Isolamento de células endoteliais pancreáticas de camundongo

Resumo

Este protocolo descreve o isolamento de células endoteliais de camundongos de todo o pâncreas.

Resumo

O pâncreas é um órgão vital para manter o equilíbrio metabólico dentro do corpo, em parte devido à sua produção de hormônios metabólicos, como insulina e glucagon, bem como enzimas digestivas. O pâncreas também é um órgão altamente vascularizado, uma característica facilitada pela intrincada rede de capilares pancreáticos. Esta extensa rede capilar é composta de células endoteliais (CEs) altamente fenestradas importantes para o desenvolvimento e função do pâncreas. Assim, a disfunção dos CEs pode contribuir para a do pâncreas em doenças como diabetes e câncer. Assim, pesquisar a função dos CEs pancreáticos (CEPs) é importante não apenas para a compreensão da biologia do pâncreas, mas também para o desenvolvimento de suas patologias. Modelos de camundongos são ferramentas valiosas para estudar doenças metabólicas e cardiovasculares. No entanto, não existe um protocolo estabelecido com detalhes suficientes descritos para o isolamento de pECs de camundongos devido à população relativamente pequena de ECs e às abundantes enzimas digestivas potencialmente liberadas do tecido acinar que podem levar a danos celulares e, portanto, baixo rendimento. Para enfrentar esses desafios, criamos um protocolo para enriquecer e recuperar pECs de camundongos, combinando dissociação física e química suave e seleção mediada por anticorpos. O protocolo apresentado aqui fornece um método robusto para extrair CEs intactos e viáveis de todo o pâncreas do camundongo. Este protocolo é adequado para vários ensaios a jusante e pode ser aplicado a vários modelos de camundongos.

Introdução

O pâncreas, fundamental para o controle metabólico e a homeostase, é um órgão altamente vascularizado. O pâncreas tem funções endócrinas e exócrinas, controlando a regulação da glicose no sangue e das enzimas digestivas, respectivamente. Esses dois compartimentos estão ligados entre si pela extensa rede de vasos sanguíneos pancreáticos, facilitando a troca e o transporte de oxigênio, hormônios e enzimas. Criticamente, essa densa rede capilar penetra na ilhota de Langerhans, um aglomerado de células reguladoras de hormônios dentro do pâncreas responsável por sua função endócrina, consistindo nas células alfa (α) secretoras de glucagon,....

Protocolo

O isolamento tecidual foi realizado de acordo com o protocolo de estudo aprovado #17010 pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Beckman Research Institute, City of Hope (Duarte, Califórnia, EUA). Aqui, usamos Tie-2CreERT2; Rosa26-TdLinha de camundongos de tomate em fundo C57BL/6 com 8 a 12 semanas de idade. Nessa linha, os CEs são marcados com TdTomato quando induzidos com tamoxifeno, conforme descrito anteriormente³⁴. No entanto, este protocolo pode ser adaptado para todas as idades de camundongos adultos com diferentes genótipos e origens genéticas.

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Resultados

Seguindo este protocolo, aproximadamente 2 x 10⁶ células vivas podem ser obtidas ao agrupar 3 pâncreas de camundongos e 750.000 células de um único pâncreas de camundongo. Para validar o enriquecimento da CE, realizamos as seguintes análises: 1) PCR quantitativo: em comparação com as amostras de fluxo contínuo (FT) (ou seja, as frações ligadas ao anticorpo não CD31), as frações de CE apresentaram níveis significativamente mais altos de Pecam1 (codifican.......

Discussão

Neste artigo, apresentamos um protocolo para enriquecimento e isolamento dos pECs. Semelhante aos protocolos anteriores de isolamento de CE de outros tecidos ou órgãos, este protocolo consiste em três processos principais, a saber, dissociação física, digestão enzimática e enriquecimento de CE baseado em anticorpos. Para enfrentar os desafios únicos no processamento do pâncreas, introduzimos várias adaptações importantes e etapas críticas em nosso protocolo: 1) uma digestã.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
25G needles	BD	305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q712-03-AA
5 mL eppendorf	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
70 µm strainer	Fisher	22-363-548
Anti-CD31-biotin	Miltenyi Biotech	REA784
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Collagen Type 1, from calf skin	Sigma Aldrich	C9791	Attachment reagent in the protocol
Collagenase Type 1	Worthington Bio	LS004197
Countess Automatic Cell Counter	Thermo Fisher
DAPI	Thermo Fisher	D1306	immunofluorescence
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
DNAse I	Roche	260913
D-PBS (Ca2+,Mg2+)	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
LS Columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
M199	Sigma	M2520-1L
MACS MultiStand with the QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech	130-042-303
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Microbeads anti-biotin	Miltenyi Biotech	130-090-485
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Molecular Grade Water	Corning	46-000-CM
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
PECAM1 (CD31) Antibody	Abcam	ab56299	immunofluorescence
PECAM1 (CD31) Antibody	R&D Systems	AF3628
Phosphate Buffered Saline (10X) (no Ca2+,no Mg2+)	Genesee Scientific	25-507-XB
Primer 36B4 Forward mouse	IDT		AGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese mouse	IDT		TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Forward mouse	IDT		TCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Reverse mouse	IDT		AAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Reverse mouse	IDT		CACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 Forward mouse	IDT		CTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 Forward mouse	IDT		ACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 Reverse mouse	IDT		TCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Tissue Culture Dishes 2cm	Genesee Scientific	25-260
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
Trypsin Inhibitor	Roche	10109886001
Tween-20
VE-Cadherin Antibody	Abcam	ab33168	immunofluorescence
Waterbath