Isolamento delle cellule endoteliali pancreatiche di topo

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'isolamento di cellule endoteliali di topo dall'intero pancreas.

Abstract

Il pancreas è un organo vitale per il mantenimento dell'equilibrio metabolico all'interno del corpo, in parte grazie alla sua produzione di ormoni metabolici come l'insulina e il glucagone, nonché di enzimi digestivi. Il pancreas è anche un organo altamente vascolarizzato, una caratteristica facilitata dall'intricata rete di capillari pancreatici. Questa vasta rete capillare è costituita da cellule endoteliali (EC) altamente fenestrate, importanti per lo sviluppo e la funzione del pancreas. Di conseguenza, la disfunzione delle EC può contribuire a quella del pancreas in malattie come il diabete e il cancro. Pertanto, la ricerca sulla funzione delle EC pancreatiche (pECs) è importante non solo per comprendere la biologia del pancreas, ma anche per sviluppare le sue patologie. I modelli murini sono strumenti preziosi per studiare le malattie metaboliche e cardiovascolari. Tuttavia, non esiste un protocollo stabilito con dettagli sufficienti per l'isolamento delle cellule ulcerogene di topo a causa della popolazione relativamente piccola di cellule endotiche e degli abbondanti enzimi digestivi potenzialmente rilasciati dal tessuto acinare che possono portare a danni cellulari e, quindi, a una bassa resa. Per affrontare queste sfide, abbiamo ideato un protocollo per arricchire e recuperare le pEC di topo, combinando una delicata dissociazione fisica e chimica e una selezione mediata da anticorpi. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo robusto per estrarre EC intatte e vitali dall'intero pancreas del topo. Questo protocollo è adatto per più saggi a valle e può essere applicato a vari modelli murini.

Introduzione

Il pancreas, fondamentale per il controllo metabolico e l'omeostasi, è un organo altamente vascolarizzato. Il pancreas ha funzioni sia endocrine che esocrine, controllando rispettivamente la regolazione della glicemia e degli enzimi digestivi. Questi due compartimenti sono collegati tra loro da un'ampia rete di vasi sanguigni pancreatici, che facilitano lo scambio e il trasporto di ossigeno, ormoni ed enzimi. In modo critico, questa fitta rete capillare penetra nell'isolotto di Langerhans, un gruppo di cellule che regolano gli ormoni all'interno del pancreas responsabili della sua funzione endocrina, costituito dalle cellule alfa (α) secernenti glucagone, dalle cellule beta (β) secernenti insulina e dalle cellule delta (δ) secernenti somatostatina ^1,2. Sebbene le isole costituiscano solo l'1-2% della massa pancreatica, ricevono il 20% del flusso sanguigno totale³, evidenziando l'importanza della vascolarizzazione delle isole. I capillari pancreatici sono costituiti principalmente da cellule endoteliali (EC) altamente fenestrate, circondate da periciti murali. Queste EC capillari svolgono un ruolo vitale nello sviluppo, nella maturazione e nella (dis)funzione delle isole e formano intime diatridi con varie cellule endo- ed esocrine⁴ (Figura 1).

La disfunzione endoteliale è stata osservata sia nel diabete di tipo 1 che in quello di tipo 2, le condizioni più comuni causate dalla disfunzione delle isole pancreatiche ^5,6. Sia la densità microvascolare che la morfologia delle isole possono essere alterate nel diabete⁷. Inoltre, il cancro del pancreas, un tumore altamente aggressivo che può manifestarsi anche come diabete, è caratterizzato da un'elevata densità microvascolare con scarsa perfusione⁸. Dati i ruoli strutturali e funzionali fondamentali delle EC nel tessuto pancreatico normale e malato, vi è una pertinente necessità di studiare le EC nello sviluppo, nella fisiologia e nella patologia per svelare i meccanismi che guidano la salute o le malattie.

Sono stati sviluppati numerosi protocolli per l'isolamento di EC da diversi sistemi murini (ad es. cervello ^9,10, polmone¹¹, cuore¹², fegato¹³, muscoli scheletrici¹⁴ e tessuti adiposi¹⁵) e umani (ad es. cervello¹⁶, tessuto adiposo viscerale^17,18, nervi periferici¹⁹, polmone 20,21,22 e arteria mesenterica ²³) tessuti. Questi protocolli prevedono tipicamente l'uso di digestioni enzimatiche (ad esempio, da collagenasi, tripsina²⁴, dispasi ^24,25 e liberasi²⁶), seguite da una fase di arricchimento basata su anticorpi. Inoltre, questi protocolli tendono a fare affidamento su durate prolungate di digestioni ad alte concentrazioni di enzimi con agitazione vigorosa a 37 °C (Tabella 1). A causa delle caratteristiche uniche del pancreas, tra cui il fatto che ospita una pletora di enzimi digestivi endogeni, questi protocolli esistenti non possono essere applicati direttamente per isolare le pEC. In primo luogo, la composizione della matrice extracellulare (ECM) del pancreas è diversa da quella di altri tessuti. Sebbene la collagenasi sia comunemente usata per l'isolamento delle EC, esistono più sottotipi con diverse capacità di dissociazione tessuto-specifiche, che richiedono quindi un'ottimizzazione. In secondo luogo, e cruciale per l'isolamento della pEC, il rilascio e l'attivazione di enzimi endogeni pancreatici possono ostacolare significativamente il processo di isolamento. A tal fine, è necessario prestare attenzione per ridurre al minimo la rottura delle cellule acinose esocrine (la fonte primaria di zimogeni, proteasi e^{RNasi 27}), che può indurre ulteriori danni cellulari e provocare una bassa vitalità cellulare e influenzare complessivamente il recupero 27,28,29.

Per affrontare queste sfide, abbiamo adattato i metodi dei protocolli di isolamento EC esistenti e stabilito un nuovo protocollo adatto all'isolamento EC dal pancreas di topo. In particolare, descriviamo qui un flusso di lavoro (Figura 2) che utilizza la collagenasi di tipo I (tipicamente implementata per l'isolamento della EC polmonare), temperature di digestione più basse e nessuna agitazione (per prevenire l'attivazione degli zimogeni pancreatici) e l'integrazione di DNasi 30,31,32 (per prevenire l'apoptosi indotta dal DNA e migliorare la vitalità cellulare) e un anticorpo per CD31 ³³ (PECAM1, un marcatore pan-EC). Il protocollo descritto produce popolazioni di EC isolate dal pancreas di topo che possono essere utilizzate per la profilazione dell'espressione genica e i saggi proteici.

Protocollo

L'isolamento dei tessuti è stato eseguito secondo il protocollo di studio approvato #17010 dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Beckman Research Institute, City of Hope (Duarte, California, USA). Qui, usiamo Tie-2CreERT2; Linea di topi Rosa26-TdTomato su sfondo C57BL/6 a 8 - 12 settimane di età. In questa linea, le EC sono marcate con TdTomato quando indotte con tamoxifene come precedentemente descritto³⁴. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato a tutte le età di topi adulti con diversi genotipi e background genetici.

1. Prelievo dei tessuti (tempo stimato: 1-2 ore)

NOTA: Il tempo stimato è di 15 minuti/animale, si consiglia un massimo di 3 animali raggruppati per campioni di dissociazione.

1. Eutanasia degli animali per overdose di anidride carbonica (CO₂), seguita da una conferma secondaria della morte. Prima della dissezione, spruzzare tutto il corpo con etanolo al 70% (EtOH), disinfettando completamente l'area operatoria.
2. Allunga e fissa gli arti usando i perni. Usando le forbici chirurgiche, praticare una piccola incisione sulla linea mediana attraverso la pelle e il peritoneo partendo dalla zona addominale inferiore ed estendendosi verso la regione toracica.
3. Esporre la gabbia toracica tagliando il diaframma e sollevare la gabbia toracica per esporre il cuore.
4. Inserire un ago (25G-30G) collegato a una siringa contenente PBS sterile ghiacciato, nel ventricolo sinistro del cuore.
5. Avviare la perfusione iniettando il PBS attraverso il cuore a una velocità di 5 - 10 ml/min. Interrompere dopo l'iniezione di 10 ml o fino a quando il fegato e i reni non si scoloriscono.
6. Dopo la perfusione, localizzare il pancreas (sotto lo stomaco e attaccato al duodeno)³⁵ (Figura 3A) e rimuoverlo con cura utilizzando forbici da dissezione e pinze.
7. Una volta isolato, trasferire il pancreas in una provetta da 50 mL contenente 10 mL di PBS ghiacciato + 0,2 mg/mL di inibitore della tripsina, tenere in ghiaccio (Figura 3B).
   NOTA: In questa fase è possibile raggruppare il pancreas di un massimo di 3 topi e trasferirlo in 1 provetta. I campioni possono essere conservati in ghiaccio per un tempo massimo di 2 ore.

2. Preparazione della collagenasi (tempo stimato: 15-30 min)

1. Preparare le soluzioni e i tamponi come descritto di seguito.
   1. Soluzione di dissociazione: aggiungere collagenasi di tipo I in provetta da 50 mL a una concentrazione finale di 1 mg/mL in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS 1x (Ca²⁺, Mg²⁺; vedere la Tabella dei materiali) e 0,001 U/mL di DNasi I + 0,2 mg/mL di inibitore della tripsina.
   2. Soluzione di arresto della dissociazione: aggiungere soluzione salina tamponata con fosfato (PBS 1x, senza Ca²⁺, Mg²⁺; lo stesso per tutti gli altri PBS in questo protocollo; vedere la Tabella dei materiali), 5% di albumina sierica bovina (BSA), 0,001 U/mL di DNasi I o DMEM + 10% di FBS + 0,001 MU/mL di DNasi I.
   3. Tampone di lavaggio: aggiungere PBS 1x, 0,5% di albumina sierica bovina (BSA), 0,001 U/mL di DNasi I + 0,05 mg/mL di inibitore della tripsina.
2. Sciogliere completamente i tamponi e filtrarli con un filtro da 0,22 μm. Mettere da parte e tenere in ghiaccio.

3. Digestione (tempo stimato: 40 min-1 h)

1. Rimuovere il pancreas dal PBS ghiacciato e posizionarlo sulla piastra di Petri sopra il ghiaccio. Rimuovere con cura il tessuto in eccesso (ad es. milza, grasso, detriti) con forbici chirurgiche e pinzette (Figura 3C).
   NOTA: È fondamentale rimuovere il grasso, poiché l'eccesso di lipidi può interferire con la digestione dei tessuti.
2. Trasferire il pancreas di topo tagliato in una provetta da 5 mL contenente 1 mL di soluzione di dissociazione.
3. Tenere la provetta sul ghiaccio e tritare i tessuti pancreatici con le forbici da dissezione in pezzi sottili pipettabili, ad esempio 0,5 mm o 1 mm. Trasferire il lisato in una provetta da 50 ml e conservare in ghiaccio.
4. Aggiungere altro pancreas alla provetta da 5 ml utilizzata per tritare inizialmente il tessuto pancreatico e aggiungere ulteriore 1 ml di collagenasi. Ripetere se necessario per più preparazioni del pancreas.
5. Aggiungere 2 mL di soluzione di collagenasi alla provetta da 5 mL per rimuovere eventuali residui di tessuto pancreatico e trasferirla in una provetta da 50 mL. Il volume totale della collagenasi deve essere di 5 ml per 3 pancreas o 3 ml per un singolo pancreas.
6. Una volta che tutti i campioni sono stati sottoposti a dissociazione meccanica, trasferire le provette da 50 mL contenenti i lisati tissutali omogeneizzati in un bagno d'acqua a 37 °C e incubare per 10 minuti.
   NOTA: Non agitare energicamente o agitare la miscela di tessuto durante questo processo in quanto ciò può causare la rottura dei tessuti acinari e il rilascio di abbondanti enzimi endogeni e DNA.
7. Togliere i tubi dal bagnomaria e agitare delicatamente per mescolare bene, quindi lasciare a bagnomaria per altri 10 minuti (tempo totale: 20 minuti).
   NOTA: Non superare i 30 minuti in bagnomaria a 37 °C per evitare una digestione eccessiva.
8. Posizionare le provette sul ghiaccio e lasciare che l'omogeneizzato si depositi per gravità. Una volta depositato, trasferire il surnatante attraverso un filtro da 70 μm e aggiungere 5 mL di soluzione di arresto della dissociazione.
9. Aggiungere un ulteriore 1 mL di soluzione di dissociazione al pellet rimanente e triturare con un ago da 18G.
10. Passare l'omogeneizzato rimanente attraverso il filtro e lavare con altri 5 mL di soluzione di arresto della dissociazione.
11. Sospensione con cella di centrifuga a 300 x g per 10 min, a 4 °C. Rimuovere completamente il surnatante mediante aspirazione e mantenere il pellet cellulare sul ghiaccio.
12. Risospendere il pellet cellulare con 1 mL di tampone di lavaggio e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
13. Prelevare una piccola aliquota dal pellet di cella risoluta (10 μL) e mescolarla con il blu di tripano in un rapporto 1:1 per contare le cellule utilizzando un contatore di cellule e misurare la vitalità.

4. Arricchimento delle cellule endoteliali (EC) (tempo stimato: 2-3 h)

1. Aggiungere 1 μL di anticorpo anti-CD31-biotina per ogni 1 x 10⁷ cellule contate e incubare per 30 minuti a 4 °C su un rotatore (circa 5 μL per 3 pancreas).
2. Aggiungere 20 μl di microsfere anti-biotina e incubare per 40 minuti a 4 °C su un rotatore di provette.
3. Installare un supporto magnetico con il supporto del separatore della colonna e applicare la colonna. Equilibrare la colonna con 3 mL di tampone di lavaggio.
4. Aggiungere il campione alla colonna e lavare con un totale di 9 mL di tampone di lavaggio.
   NOTA: Se la concentrazione di cellule è elevata, diluire le cellule con altri 2 mL di tampone di lavaggio in una provetta separata. Aggiungere 1 mL di campione alla volta nella colonna per evitare che la colonna si ostruisca.
5. Rimuovere la colonna dal supporto della colonna e inserirla in una provetta da 15 mL. Aggiungere 5 mL di tampone di lavaggio alla colonna. Utilizzare lo stantuffo per spingere verso il basso le cellule nella colonna e raccogliere l'eluizione (che contiene EC arricchita).
6. Centrifugazione a flusso continuo ed eluizione/frazione EC a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. Contare le celle e misurare la vitalità come nel passaggio 3.13.
7. Convalida l'arricchimento EC tramite qPCR di flow-through e frazioni EC. Utilizzare NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) come marcatore generale per le cellule endocrine e la molecola di adesione piastrinica e delle cellule endoteliali (Pecam1) come marcatore per EC³³. Utilizzare 36B4 (Rplp0, fosfoproteina ribosomiale acida p0) come controllo interno per la normalizzazione dell'espressione genica.
   NOTA: In questa fase i campioni raccolti possono essere utilizzati per analisi di proteine o RNA.

5. Coltura di pEC

1. Preparare M199 medio. Integrare M199 medio a una concentrazione finale del 20% di siero fetale bovino (FBS) e dello 0,1% di penicillina-streptomicina.
2. Rivestire una piastra di coltura cellulare da 60 mm con collagene di tipo I (1 mg/mL in acido acetico 0,1 M) e lasciare riposare per 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Rimuovere il collagene di tipo I e risciacquare la piastra con 1X PBS, due volte. Aggiungere 2 mL di terreno M199 preparato e posizionare la piastra per colture cellulari nell'incubatore per colture cellulari standard (5% CO₂, 37 °C) per 5 minuti.
4. Una volta isolate le cellule, aggiungere le cellule isolate alla piastra di coltura cellulare M199 preriscaldata. Mantenere le cellule in condizioni di coltura per circa 14 giorni e cambiare i terreni ogni 2-3 giorni.

Risultati

Seguendo questo protocollo, è possibile ottenere circa 2 x 10⁶ cellule vive quando si raggruppano 3 pancreas di topo e 750.000 cellule da un singolo pancreas di topo. Per convalidare l'arricchimento di EC, abbiamo eseguito le seguenti analisi: 1) PCR quantitativa: rispetto ai campioni flow-through (FT) (cioè le frazioni legate agli anticorpi non CD31), le frazioni EC avevano livelli significativamente più elevati di Pecam1 (codificante CD31) e Kdr (codific...

Discussione

In questo articolo, presentiamo un protocollo per l'arricchimento e l'isolamento dei pEC. Simile ai precedenti protocolli di isolamento delle EC da altri tessuti o organi, questo protocollo consiste in tre processi principali, vale a dire la dissociazione fisica, la digestione enzimatica e l'arricchimento EC basato su anticorpi. Per affrontare le sfide uniche nell'elaborazione del pancreas, abbiamo introdotto diversi adattamenti chiave e passaggi critici all'interno del nostro protocollo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
25G needles	BD	305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q712-03-AA
5 mL eppendorf	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
70 µm strainer	Fisher	22-363-548
Anti-CD31-biotin	Miltenyi Biotech	REA784
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Collagen Type 1, from calf skin	Sigma Aldrich	C9791	Attachment reagent in the protocol
Collagenase Type 1	Worthington Bio	LS004197
Countess Automatic Cell Counter	Thermo Fisher
DAPI	Thermo Fisher	D1306	immunofluorescence
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
DNAse I	Roche	260913
D-PBS (Ca2+,Mg2+)	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
LS Columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
M199	Sigma	M2520-1L
MACS MultiStand with the QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech	130-042-303
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Microbeads anti-biotin	Miltenyi Biotech	130-090-485
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Molecular Grade Water	Corning	46-000-CM
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
PECAM1 (CD31) Antibody	Abcam	ab56299	immunofluorescence
PECAM1 (CD31) Antibody	R&D Systems	AF3628
Phosphate Buffered Saline (10X) (no Ca2+,no Mg2+)	Genesee Scientific	25-507-XB
Primer 36B4 Forward mouse	IDT		AGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese mouse	IDT		TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Forward mouse	IDT		TCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Reverse mouse	IDT		AAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Reverse mouse	IDT		CACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 Forward mouse	IDT		CTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 Forward mouse	IDT		ACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 Reverse mouse	IDT		TCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Tissue Culture Dishes 2cm	Genesee Scientific	25-260
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
Trypsin Inhibitor	Roche	10109886001
Tween-20
VE-Cadherin Antibody	Abcam	ab33168	immunofluorescence
Waterbath