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要約

このプロトコルは、全膵臓からのマウス内皮細胞の単離を説明しています。

要約

膵臓は、インスリンやグルカゴンなどの代謝ホルモンや消化酵素の産生など、体内の代謝バランスを維持するための重要な臓器です。膵臓は高度に血管新生された器官でもあり、膵臓の毛細血管の複雑なネットワークによって促進される特徴です。この広範な毛細血管ネットワークは、膵臓の発達と機能に重要な高度に穴あき内皮細胞(EC)で構成されています。したがって、ECの機能不全は、糖尿病や癌などの疾患における膵臓の機能不全に寄与する可能性があります。このように、膵臓EC(pEC)の機能を研究することは、膵臓の生物学を理解するだけでなく、その病態を発展させるためにも重要です。マウスモデルは、代謝性疾患や心血管疾患を研究するための貴重なツールです。しかし、ECの集団が比較的少なく、腺房組織から放出される可能性のある消化酵素が豊富であるため、細胞の損傷につながる可能性があり、したがって収率が低いため、マウスpECの単離について十分な詳細が記載された確立されたプロトコルはありませんでした。これらの課題に対処するために、私たちは、穏やかな物理的および化学的解離と抗体媒介選択を組み合わせて、マウスのpECを濃縮および回復するためのプロトコルを考案しました。ここで紹介するプロトコルは、マウスの膵臓全体から無傷で生存可能なECを抽出するための堅牢な方法を提供します。このプロトコルは、複数のダウンストリームアッセイに適しており、さまざまなマウスモデルに適用できます。

概要

代謝制御と恒常性の鍵となる膵臓は、高度に血管新生された器官です。膵臓には内分泌機能と外分泌機能の両方があり、それぞれ血糖値と消化酵素の調節を制御しています。これらの2つのコンパートメントは、膵臓血管の広範なネットワークによってリンクされており、酸素、ホルモン、および酵素の交換と輸送を促進します。重要なことに、この密集した毛細血管網は、グルカゴン分泌アルファ(α)細胞、インスリン分泌ベータ(β)細胞、およびソマトスタチン分泌デルタ(δ)細胞からなる、膵臓内の内分泌機能を担うホルモン調節細胞のクラスターであるランゲルハンス島に浸透しています1,2。膵島は膵臓の質量の1〜2%しか占めていませんが、総血流の20%を受け取っています3、膵島の血管系の重要性が強調されています。膵臓の毛細血管は、主に高度に穴あきされた内皮細胞(EC)で構成されており、壁画の周皮細胞に囲まれています。これらの毛細血管ECは、膵島の発生、成熟、および(機能不全)に重要な役割を果たし、さまざまな内分泌細胞および外分泌細胞4と密接なクロストークを形成します4(図1)。

内皮機能障害は、膵島の機能障害によって引き起こされる最も一般的な状態である1型糖尿病と2型糖尿病の両方で観察されています5,6。膵島微小血管密度と形態はどちらも糖尿病で変化する可能性があります7。さらに、膵臓がんは、糖尿病としても現れる可能性のある非常に侵攻性の高い腫瘍であり、灌流不良の微小血管密度が高いという特徴があります8。正常な膵臓組織と疾患のある膵臓組織の両方におけるECの重要な構造的および機能的役割を考えると、健康や疾患を引き起こすメカニズムを明らかにするために、発生、生理学、および病理学におけるpECを研究することが適切に必要です。

異なるマウス(例えば、脳9,10、肺11、心臓12、肝臓13、骨格筋14、および脂肪組織15)およびヒト(例えば、脳16、内臓脂肪組織17,18、末梢神経19、肺20,21,22、および腸間膜動脈23)からECを単離するために、多数のプロトコルが開発されてきた)ティッシュ。これらのプロトコールは、典型的には、酵素消化(例えば、コラゲナーゼ、トリプシン24、ディスパーゼ24、25、およびリベラーゼ26)の使用と、それに続く抗体ベースの濃縮ステップを含む。さらに、これらのプロトコルは、37°Cで激しく攪拌する高濃度の酵素での長時間の消化に依存する傾向があります(表1)。膵臓には多数の内因性消化酵素が収容されているなど、膵臓のユニークな特徴があるため、これらの既存のプロトコルを直接pECの単離に適用することはできません。まず、膵臓の細胞外マトリックス(ECM)組成は他の組織とは異なります。コラゲナーゼはEC単離に一般的に使用されますが、組織特異的な解離能力が異なる複数のサブタイプが存在するため、最適化が必要です。第二に、pEC単離にとって極めて重要なのは、膵臓内因性酵素の放出と活性化が単離プロセスを大幅に妨げることです。この目的のためには、外分泌腺房細胞(チモーゲン、プロテアーゼ、およびRNase27の主要な供給源)の破裂を最小限に抑えるために注意を払う必要があり、これによりさらなる細胞損傷が誘発され、細胞生存率が低下し、全体的な回復に影響を与える可能性がある27,28,29。

これらの課題に対処するために、既存のEC単離プロトコルの方法を適応させ、マウス膵臓からのEC単離に適した新しいプロトコルを確立しました。具体的には、ここでは、コラゲナーゼI型(通常は肺EC単離に実施)、消化温度の低下と攪拌なし(膵臓のチモーゲンの活性化を防ぐため)、およびDNase30,31,32の補給(DNA誘導性アポトーシスを予防し、細胞生存率を向上させるため、およびCD31に対する抗体)を使用するワークフロー(図2)について説明します33(PECAM1、pan-ECマーカー)。記載されたプロトコルは、マウスの膵臓から単離されたEC集団を産生し、これは遺伝子発現プロファイリングおよびタンパク質アッセイに使用できる。

プロトコル

組織単離は、承認された研究プロトコル#17010に基づいて、City of Hope(米国カリフォルニア州ドゥアルテ)のBeckman Research InstituteのInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)によって実施されました。ここでは、Tie-2CreERT2を使用します。8 - 12週齢のC57BL/6背景のRosa26-TdTomatoマウス系統。このラインでは、ECは、前述の34のようにタモキシフェンで誘導されるとTdTomatoで標識される。しかし、このプロトコルは、異なる遺伝子型および遺伝的背景を持つ成体マウスのすべての年齢に適応させることができます。

1.ティッシュコレクション(推定時間:1〜2時間)

注:時間の見積もりは15分/動物で、解離サンプルごとに最大3匹の動物をプールすることをお勧めします。

  1. 二酸化炭素(CO2)の過剰摂取により動物を安楽死させ、続いて死亡の二次確認を行います。解剖前に全身に70%エタノール(EtOH)を噴霧し、手術部位を完全に消毒します。
  2. ピンを使って手足を伸ばして固定します。手術用ハサミを使用して、下腹部から胸部に向かって伸びる皮膚と腹膜を通る小さな正中線切開を行います。
  3. 横隔膜を切開して胸郭を露出させ、胸郭を持ち上げて心臓を露出させます。
  4. 氷冷滅菌PBSを含む注射器に接続された針(25G-30G)を心臓の左心室に挿入します。
  5. 5〜10 mL / minの速度で心臓にPBSを注入することにより、灌流を開始します。10mLの注入後、または肝臓や腎臓が変色するまで停止します。
  6. 灌流後、膵臓(胃の下にあり、十二指腸に付着している)35 (図3A)の位置を特定し、解剖ハサミと鉗子を使用して慎重に除去する。
  7. 単離したら、10 mLの氷冷PBS + 0.2 mg / mLトリプシン阻害剤を含む50 mLチューブに膵臓を移し、氷上に保ちます(図3B)。
    注:このステップで最大3匹のマウスの膵臓をプールし、1本のチューブに移すことができます。サンプルは最大2時間氷上に保持できます。

2. コラゲナーゼの調製(所要時間:15-30分)

  1. 以下に説明するように溶液とバッファーを調製します。
    1. 解離溶液:コラゲナーゼI型を50 mLチューブに50 mLチューブに加え、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS 1x(Ca2+、Mg2+; 材料表を参照)および0.001 U/mL DNase I + 0.2 mg/mLトリプシン阻害剤の最終濃度1 mg/mLにします。
    2. 解離停止溶液:リン酸緩衝生理食塩水(PBS 1x、Ca2+、Mg2+なし、このプロトコルのすべての残りのPBSについて同じ; 材料の表を参照)、5%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.001 U/mL DNase IまたはDMEM + 10%FBS + 0.001 MU/mL DNase Iを添加します。
    3. 洗浄バッファー:PBS 1x、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.001 U/mL DNase I + 0.05 mg/mLトリプシン阻害剤を添加します。
  2. バッファーを完全に溶解し、0.22 μmフィルターでろ過します。脇に置いて氷の上に置いておきます。

3.消化(推定時間:40分-1時間)

  1. 氷冷したPBSから膵臓を取り出し、氷の上のペトリ皿の上に置きます。余分な組織(脾臓、脂肪、破片など)を手術用ハサミとピンセットで慎重に取り除きます(図3C)。
    注:過剰な脂質は組織の消化を妨げる可能性があるため、脂肪を取り除くことが重要です。
  2. トリミングしたマウス ?? 臓を、1 mL の解離溶液が入った 5 mL チューブに移します。
  3. チューブを氷の上に置いたまま、解剖ハサミで膵臓組織を0.5mmや1mmなどの細いピペットで切ることができます。ライセートを50 mLチューブに移し、氷上に保管します。
  4. 最初に膵臓組織をミンチするために使用した5mLチューブに膵臓を追加し、さらに1mLのコラゲナーゼを追加します。必要に応じて、複数の ?? 臓の準備について繰り返します。.
  5. 5 mLチューブに2 mLのコラゲナーゼ溶液を加えて、残存する膵臓組織を除去し、50 mLチューブに移します。コラゲナーゼの総量は、3つの膵臓で5 mL、1つの膵臓で3 mLである必要があります。
  6. すべてのサンプルが機械的解離を受けたら、均質化した組織溶解物を含む50 mLチューブを37°Cのウォーターバスに移し、10分間インキュベートします。
    注:このプロセス中は、腺房組織の破裂や豊富な内因性酵素やDNAの放出を引き起こす可能性があるため、組織混合物を激しく攪拌したり渦巻きにしたりしないでください。
  7. チューブをウォーターバスから取り出し、静かに渦巻いてよく混ぜ合わせ、さらに10分間ウォーターバスに入れます(合計時間:20分)。
    注意: 過剰消化を避けるために、30°Cのウォーターバスで37分を超えないようにしてください。
  8. チューブを氷の上に置き、ホモジネートを重力で沈殿させます。落ち着いたら、上清を70 μmフィルターにかけ、5 mLの解離停止溶液を加えます。
  9. 残りのペレットにさらに1 mLの解離溶液を加え、18Gの針で粉砕します。
  10. 残りのホモジネートをフィルターに通し、さらに5 mLの解離停止溶液で洗浄します。
  11. スピンセル懸濁液を300 x g で10分間、4°Cで保存します。 吸引によって上清を完全に除去し、細胞ペレットを氷上に保ちます。
  12. 細胞ペレットを1 mLの洗浄バッファーで再懸濁し、1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
  13. 再懸濁した細胞ペレット(10 μL)から少量のアリコートを取り出し、トリパンブルーと1:1の比率で混合し、セルカウンターを使用して細胞をカウントし、生存率を測定します。

4. 内皮細胞(EC)の濃縮(推定時間:2-3時間)

  1. 1 x 107 細胞ごとに1 μLの抗CD31-ビオチン抗体を添加し、ローテーター上で4°Cで30分間インキュベートします(膵臓3個あたり約5 μL)。
  2. 20 μLの抗ビオチンマイクロビーズを添加し、チューブローテーター上で4°Cで40分間インキュベートします。
  3. カラムセパレーターホルダーにマグネットスタンドを取り付け、カラムを装着します。3 mLの洗浄バッファーでカラムを平衡化します。
  4. サンプルをカラムに加え、合計9 mLの洗浄バッファーで洗浄します。
    注:細胞濃度が高い場合は、別のチューブで追加の2 mLの洗浄バッファーで細胞を希釈します。一度に1 mLのサンプルをカラムに加え、カラムの目詰まりを防ぎます。
  5. カラムホルダーからカラムを取り出し、15 mLチューブに入れます。5 mLの洗浄バッファーをカラムに加えます。プランジャーを使用してカラム内の細胞を押し下げ、溶出物(濃縮ECを含む)を収集します。
  6. フロースルーおよび溶出/ECフラクションを300 x g で4°Cで10分間スピンダウンします。 ステップ3.13のように細胞をカウントし、生存率を測定します。
  7. フロースルーおよびECフラクションのqPCRによるEC濃縮を検証します。NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) を内分泌細胞の一般的なマーカーとして使用し、EC33 のマーカーとして血小板および内皮細胞接着分子 (Pecam1) を使用します。36B4(Rplp0、酸性リボソームリン酸化タンパク質p0)を遺伝子発現の正常化のための内部コントロールとして使用します。
    注:このステップでは、収集したサンプルをタンパク質またはRNA分析に使用できます。

5. pECの培養

  1. M199ミディアムを用意します。M199を中程度から最終濃度の20%ウシ胎児血清(FBS)と0.1%ペニシリン-ストレプトマイシンで補います。.
  2. 60 mmの細胞培養プレートにI型コラーゲン(0.1 M酢酸に1 mg/mL)をコーティングし、室温で30分間静置します。
  3. I型コラーゲンを取り除き、プレートを1X PBSで2回すすぎます。調製したM199培地2 mLを加え、細胞培養プレートを標準細胞培養インキュベーター(5% CO2、37°C)に5分間置きます。
  4. 細胞を単離したら、単離した細胞を予熱したM199細胞培養プレートに加えます。細胞を培養条件で約14日間保持し、2〜3日ごとに培地を交換します。

結果

このプロトコルに従うと、3つのマウス膵臓、および1つのマウス膵臓から750,000個の細胞をプールすると、約2×106 個の生細胞を得ることができます。ECの濃縮を検証するために、我々は以下の分析を行った:1)定量的PCR:フロースルー(FT)サンプル(すなわち、非CD31抗体結合画分)と比較して、EC画分は 、Pecam1 (CD31をコードする)および Kdr (VEGFR2をコード?...

ディスカッション

この記事では、pECの濃縮と単離のためのプロトコルを紹介します。他の組織や臓器からの以前のEC単離プロトコルと同様に、このプロトコルは、物理的解離、酵素消化、および抗体ベースのEC濃縮という3つの主要なプロセスで構成されています。膵臓の処理における特有の課題に対処するために、私たちはプロトコル内にいくつかの重要な適応と重要なステップを導?...

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

著者は、シティ・オブ・ホープのブライアン・アームストロング博士とカリフォルニア大学リバーサイド校のミンディ・ロドリゲス氏に技術支援に感謝します。この研究は、NIH(R01 HL145170からZBC)、Ella Fitzgerald財団(ZBCへ)、City of Hope(Arthur Riggs Diabetes Metabolism and Research Institute Innovation Award)、およびCalifornia Institute of Regenerative Medicineからの助成金EDU4-12772(ATへ)によって部分的に資金提供されました。この出版物で報告された研究には、NIHの国立がん研究所が支援する光学顕微鏡法およびデジタルイメージングで行われた研究が含まれていました(賞番号P30CA033572)。 図1 と 図2 はBioRenderで作成しました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL eppendorfUSA Scientific1615-5500
10 cm dishGenesee Scientific25-202
25G needlesBD305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ712-03-AA
5 mL eppendorfThermo Fisher 14282300
6-well plateGreiner Bio-One07-000-208
70 µm strainerFisher22-363-548
Anti-CD31-biotinMiltenyi BiotechREA784
Bovine serum albumin heat shock treatedFisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
CentrifugeEppendorf
Collagen Type 1, from calf skinSigma Aldrich C9791Attachment reagent in the protocol
Collagenase Type 1 Worthington BioLS004197
Countess Automatic Cell CounterThermo Fisher 
DAPIThermo Fisher D1306immunofluorescence
Disposable Safety ScalpelsMyco Instrumentation6008TR-10
DNAse I Roche260913 
D-PBS (Ca2+,Mg2+)Thermo Fisher 14080055
EthanolFisherBP2818-4
Fetal bovine serumFisher10437028
IncubatorKept at 37 °C 5% CO2
LS ColumnsMiltenyi Biotech130-042-401
M199SigmaM2520-1L
MACS MultiStand with the QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech130-042-303
Medium 199Sigma Aldrich M2520-10X
Microbeads anti-biotinMiltenyi Biotech130-090-485
MicroscopeLeicaTo assess cell morphology
Molecular Grade WaterCorning46-000-CM
NaClFisherS271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker Eppendorf
PECAM1 (CD31) AntibodyAbcamab56299immunofluorescence
PECAM1 (CD31) AntibodyR&D SystemsAF3628
Phosphate Buffered Saline (10X) (no Ca2+,no Mg2+)Genesee Scientific25-507-XB
Primer 36B4 Forward mouseIDTAGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese mouse IDTTCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Forward mouse IDTTCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Reverse mouseIDTAAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Reverse mouse IDTCACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 Forward mouseIDTCTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 Forward mouseIDTACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 Reverse mouseIDTTCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAPThermo Fisher AM9780
RNase-free waterTakaraRR036B
Sterile 12" long forcepsF.S.T91100-16
Sterile fine forcepsF.S.T11050-10
Sterile fine scissorsF.S.T14061-11
Tissue Culture Dishes 2cmGenesee Scientific25-260
TRIzol reagentFisher15596018
Trypan BlueCorningMT25900CI
Trypsin Inhibitor Roche10109886001
Tween-20
VE-Cadherin AntibodyAbcamab33168immunofluorescence
Waterbath

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