Aislamiento de células endoteliales pancreáticas de ratón

Resumen

Este protocolo describe el aislamiento de células endoteliales de ratón de páncreas completo.

Resumen

El páncreas es un órgano vital para mantener el equilibrio metabólico dentro del cuerpo, en parte debido a su producción de hormonas metabólicas como la insulina y el glucagón, así como enzimas digestivas. El páncreas también es un órgano altamente vascularizado, una característica facilitada por la intrincada red de capilares pancreáticos. Esta extensa red capilar está formada por células endoteliales (CE) altamente fenestradas, importantes para el desarrollo y la función del páncreas. En consecuencia, la disfunción de las CE puede contribuir a la del páncreas en enfermedades como la diabetes y el cáncer. Por lo tanto, la investigación de la función de las CE pancreáticas (ECp) es importante no solo para comprender la biología del páncreas, sino también para desarrollar sus patologías. Los modelos de ratón son herramientas valiosas para estudiar las enfermedades metabólicas y cardiovasculares. Sin embargo, no ha habido un protocolo establecido con suficientes detalles para el aislamiento de las CEp de ratón debido a la población relativamente pequeña de CE y a las abundantes enzimas digestivas potencialmente liberadas por el tejido acinar que pueden provocar daño celular y, por lo tanto, un bajo rendimiento. Para hacer frente a estos desafíos, ideamos un protocolo para enriquecer y recuperar las pEC de ratón, combinando una disociación física y química suave y una selección mediada por anticuerpos. El protocolo presentado aquí proporciona un método robusto para extraer CE intactas y viables de todo el páncreas de ratón. Este protocolo es adecuado para múltiples ensayos posteriores y se puede aplicar a varios modelos de ratón.

Introducción

El páncreas, clave para el control metabólico y la homeostasis, es un órgano altamente vascularizado. El páncreas tiene funciones endocrinas y exocrinas, controlando la regulación de la glucosa en sangre y las enzimas digestivas, respectivamente. Estos dos compartimentos están unidos entre sí por una extensa red de vasos sanguíneos pancreáticos, lo que facilita el intercambio y el transporte de oxígeno, hormonas y enzimas. De manera crítica, esta densa red capilar penetra en el islote de Langerhans, un grupo de células reguladoras de hormonas dentro del páncreas responsables de su función endocrina, que consiste en las células alfa (α....

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Protocolo

El aislamiento de los tejidos se realizó bajo el protocolo de estudio aprobado #17010 por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Beckman Research Institute, City of Hope (Duarte, California, EE. UU.). Aquí, usamos Tie-2CreERT2; Línea de ratones Rosa26-TdTomato en fondo C57BL/6 a las 8 - 12 semanas de edad. En esta línea, las CE se marcan con TdTomato cuando se inducen con tamoxifeno como se ha descrito anteriormente³⁴. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar a todas las edades de ratones adultos con diferentes genotipos y antecedentes genéticos.

1....

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Resultados

Siguiendo este protocolo, se pueden obtener aproximadamente 2 x 10⁶ células vivas al agrupar 3 páncreas de ratón y 750.000 células de un solo páncreas de ratón. Para validar el enriquecimiento de CE, realizamos los siguientes análisis: 1) PCR cuantitativa: en comparación con las muestras de flujo continuo (FT) (es decir, las fracciones no unidas al anticuerpo CD31), las fracciones de CE tenían niveles significativamente más altos de Pecam1 (que codifica CD31.......

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Discusión

En este artículo se presenta un protocolo para el enriquecimiento y aislamiento de las pECs. Al igual que los protocolos anteriores de aislamiento de CE de otros tejidos u órganos, este protocolo consta de tres procesos principales, a saber, disociación física, digestión enzimática y enriquecimiento de CE basado en anticuerpos. Para abordar los desafíos únicos en el procesamiento del páncreas, introdujimos varias adaptaciones clave y pasos críticos dentro de nuestro protocolo: .......

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
25G needles	BD	305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q712-03-AA
5 mL eppendorf	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
70 µm strainer	Fisher	22-363-548
Anti-CD31-biotin	Miltenyi Biotech	REA784
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Collagen Type 1, from calf skin	Sigma Aldrich	C9791	Attachment reagent in the protocol
Collagenase Type 1	Worthington Bio	LS004197
Countess Automatic Cell Counter	Thermo Fisher
DAPI	Thermo Fisher	D1306	immunofluorescence
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
DNAse I	Roche	260913
D-PBS (Ca2+,Mg2+)	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
LS Columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
M199	Sigma	M2520-1L
MACS MultiStand with the QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech	130-042-303
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Microbeads anti-biotin	Miltenyi Biotech	130-090-485
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Molecular Grade Water	Corning	46-000-CM
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
PECAM1 (CD31) Antibody	Abcam	ab56299	immunofluorescence
PECAM1 (CD31) Antibody	R&D Systems	AF3628
Phosphate Buffered Saline (10X) (no Ca2+,no Mg2+)	Genesee Scientific	25-507-XB
Primer 36B4 Forward mouse	IDT		AGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese mouse	IDT		TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Forward mouse	IDT		TCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Reverse mouse	IDT		AAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Reverse mouse	IDT		CACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 Forward mouse	IDT		CTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 Forward mouse	IDT		ACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 Reverse mouse	IDT		TCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Tissue Culture Dishes 2cm	Genesee Scientific	25-260
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
Trypsin Inhibitor	Roche	10109886001
Tween-20
VE-Cadherin Antibody	Abcam	ab33168	immunofluorescence
Waterbath