Isolierung von Endothelzellen der Bauchspeicheldrüse der Maus

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Endothelzellen der Maus aus der gesamten Bauchspeicheldrüse.

Zusammenfassung

Die Bauchspeicheldrüse ist ein lebenswichtiges Organ für die Aufrechterhaltung des metabolischen Gleichgewichts im Körper, unter anderem aufgrund ihrer Produktion von Stoffwechselhormonen wie Insulin und Glucagon sowie Verdauungsenzymen. Die Bauchspeicheldrüse ist auch ein stark vaskularisiertes Organ, ein Merkmal, das durch das komplizierte Netzwerk der Pankreaskapillaren erleichtert wird. Dieses ausgedehnte Kapillarnetzwerk besteht aus stark gefensterten Endothelzellen (ECs), die für die Entwicklung und Funktion der Bauchspeicheldrüse wichtig sind. Dementsprechend kann die Dysfunktion der ECs zur Dysfunktion der Bauchspeicheldrüse bei Krankheiten wie Diabetes und Krebs beitragen. Daher ist die Erforschung der Funktion der Pankreas-ECs (pECs) nicht nur für das Verständnis der Biologie der Bauchspeicheldrüse, sondern auch für die Entwicklung ihrer Pathologien wichtig. Mausmodelle sind wertvolle Werkzeuge zur Erforschung von Stoffwechsel- und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Es gibt jedoch kein etabliertes Protokoll mit ausreichenden Details für die Isolierung von Maus-pECs aufgrund der relativ kleinen Population von ECs und der reichlich vorhandenen Verdauungsenzyme, die möglicherweise aus dem Azinusgewebe freigesetzt werden und zu Zellschäden und damit zu einer geringen Ausbeute führen können. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir ein Protokoll zur Anreicherung und Wiederherstellung von Maus-pECs entwickelt, das eine sanfte physikalische und chemische Dissoziation und Antikörper-vermittelte Selektion kombiniert. Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine robuste Methode, um intakte und lebensfähige ECs aus der gesamten Bauchspeicheldrüse der Maus zu extrahieren. Dieses Protokoll eignet sich für mehrere Downstream-Assays und kann auf verschiedene Mausmodelle angewendet werden.

Einleitung

Die Bauchspeicheldrüse, der Schlüssel zur Stoffwechselkontrolle und Homöostase, ist ein stark vaskularisiertes Organ. Die Bauchspeicheldrüse hat sowohl endokrine als auch exokrine Funktionen und steuert die Regulation des Blutzuckerspiegels bzw. der Verdauungsenzyme. Diese beiden Kompartimente sind durch das ausgedehnte Netzwerk der Blutgefäße der Bauchspeicheldrüse miteinander verbunden und erleichtern den Austausch und Transport von Sauerstoff, Hormonen und Enzymen. Entscheidend ist, dass dieses dichte Kapillarnetzwerk die Langerhans-Insel durchdringt, eine Gruppe hormonregulierender Zellen innerhalb der Bauchspeicheldrüse, die für ihre endokrine Funktion verantwortlich ist und aus den Glucagon-sezernierenden Alpha-Zellen (α-Zellen, den insulin-sezernierenden Beta-Zellen (β) und den Somatostatin-sezernierenden Delta-Zellen (δ) besteht ^1,2. Obwohl die Inselzellen nur 1-2 % der Pankreasmasse ausmachen, erhalten sie 20 % des gesamten Blutflusses³, was die Bedeutung des Gefäßsystems der Inselzellen unterstreicht. Die Pankreaskapillaren bestehen hauptsächlich aus stark gefensterten Endothelzellen (ECs), die von muralen Perizyten umgeben sind. Diese kapillaren ECs spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung, Reifung und (Dys-)Funktion der Inselzellen und bilden enge Wechselwirkungen mit verschiedenen endo- und exokrinen Zellen⁴ (Abbildung 1).

Endotheliale Dysfunktion wurde sowohl bei Typ-1- als auch bei Typ-2-Diabetes beobachtet, den häufigsten Erkrankungen, die durch eine Inseldysfunktion der Bauchspeicheldrüse verursacht werden ^5,6. Sowohl die mikrovaskuläre Dichte als auch die Morphologie der Inselzellen können bei Diabetes verändert sein⁷. Darüber hinaus zeichnet sich der Bauchspeicheldrüsenkrebs, ein hochaggressiver Tumor, der sich auch als Diabetes manifestieren kann, durch eine hohe mikrovaskuläre Dichte mit schlechter Durchblutung^{aus 8}. Angesichts der zentralen strukturellen und funktionellen Rolle von ECs sowohl im normalen als auch im erkrankten Pankreasgewebe besteht ein erheblicher Bedarf, die pECs in Entwicklung, Physiologie und Pathologie zu untersuchen, um die Mechanismen aufzudecken, die Gesundheit oder Krankheiten antreiben.

Zahlreiche Protokolle wurden für die Isolierung von ECs aus verschiedenen murinen (z. B. Gehirn ^9,10, Lunge¹¹, Herz¹², Leber¹³, Skelettmuskulatur¹⁴ und Fettgewebe¹⁵) und menschlichen (z. B. Gehirn¹⁶, viszerales Fettgewebe^17,18, periphere Nerven¹⁹, Lunge 20,21,22 und Mesenterialarterie ²³) entwickelt) Gewebe. Diese Protokolle beinhalten typischerweise die Verwendung enzymatischer Verdaue (z. B. durch Kollagenase, Trypsin²⁴, Dispase^{24, 25} und Liberase²⁶), gefolgt von einem Antikörper-basierten Anreicherungsschritt. Darüber hinaus beruhen diese Protokolle tendenziell auf verlängerten Verdauungsdauern in hohen Enzymkonzentrationen mit kräftigem Rühren bei 37 °C (Tabelle 1). Aufgrund der einzigartigen Eigenschaften der Bauchspeicheldrüse, einschließlich der Tatsache, dass sie eine Vielzahl von endogenen Verdauungsenzymen beherbergt, können diese bestehenden Protokolle nicht direkt auf die Isolierung von pECs angewendet werden. Erstens unterscheidet sich die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix (EZM) der Bauchspeicheldrüse von anderen Geweben. Während Kollagenase häufig für die EC-Isolierung verwendet wird, gibt es mehrere Subtypen mit unterschiedlichen gewebespezifischen Dissoziationsfähigkeiten, die daher optimiert werden müssen. Zweitens, und das ist entscheidend für die pEC-Isolierung, kann die Freisetzung und Aktivierung von endogenen Enzymen der Bauchspeicheldrüse den Isolierungsprozess erheblich behindern. Zu diesem Zweck muss darauf geachtet werden, den Bruch der exokrinen Azinuszellen (die Hauptquelle für Zymogene, Proteasen und RNase²⁷) zu minimieren, was zu weiteren Zellschäden führen und zu einer geringen Zellviabilität führen und die Gesamterholung beeinträchtigen^kann 27,28,29.

Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir Methoden aus bestehenden EC-Isolationsprotokollen angepasst und ein neues Protokoll etabliert, das für die EC-Isolierung aus der Bauchspeicheldrüse der Maus geeignet ist. Konkret beschreiben wir hier einen Arbeitsablauf (Abbildung 2) mit Kollagenase Typ I (typischerweise für die Lungen-EC-Isolierung eingesetzt), niedrigeren Verdauungstemperaturen und ohne Unruhe (um die Aktivierung von Pankreaszymogenen zu verhindern) und^DNase 30,31,32 Supplementierung (zur Verhinderung von DNA-induzierter Apoptose und Verbesserung der Zellviabilität) und einem Antikörper gegen CD31 ³³ (PECAM1, ein Pan-EC-Marker). Das beschriebene Protokoll erzeugt EC-Populationen, die aus der Bauchspeicheldrüse der Maus isoliert wurden und für die Erstellung von Genexpressionsprofilen und Proteinassays verwendet werden können.

Protokoll

Die Gewebeisolierung wurde gemäß dem genehmigten Studienprotokoll #17010 vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Beckman Research Institute, City of Hope (Duarte, Kalifornien, USA) durchgeführt. Hier verwenden wir Tie-2CreERT2; Rosa26-TdTomato-Mauslinie im C57BL/6-Hintergrund im Alter von 8 - 12 Wochen. In dieser Linie werden ECs mit TdTomato markiert, wenn sie mit Tamoxifen induziert werden, wie zuvor beschrieben³⁴. Dieses Protokoll kann jedoch für alle Altersgruppen von erwachsenen Mäusen mit unterschiedlichen Genotypen und genetischen Hintergründen angepasst werden.

1. Gewebeentnahme (geschätzte Zeit: 1-2 h)

HINWEIS: Die geschätzte Zeit beträgt 15 Minuten/Tier, empfohlen werden maximal 3 Tiere pro Dissoziationsprobe.

1. Euthanasieren Sie die Tiere durch eine Überdosis Kohlendioxid (CO₂), gefolgt von einer sekundären Todesbestätigung. Vor der Dissektion den ganzen Körper mit 70%igem Ethanol (EtOH) besprühen, wodurch der Operationsbereich vollständig desinfiziert wird.
2. Strecken Sie die Gliedmaßen aus und sichern Sie sie mit Stecknadeln. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen kleinen Schnitt durch die Haut und das Bauchfell, beginnend im unteren Bauchbereich und bis in den Brustbereich.
3. Legen Sie den Brustkorb frei, indem Sie das Zwerchfell durchtrennen, und heben Sie den Brustkorb an, um das Herz freizulegen.
4. Führen Sie eine Nadel (25G-30G), die mit einer Spritze verbunden ist, die eiskaltes, steriles PBS enthält, in den linken Ventrikel des Herzens ein.
5. Beginnen Sie die Perfusion, indem Sie das PBS mit einer Geschwindigkeit von 5 - 10 ml/min durch das Herz injizieren. Hören Sie nach der Injektion von 10 ml auf oder bis sich Leber und Nieren verfärben.
6. Nach der Perfusion lokalisieren Sie die Bauchspeicheldrüse (unterhalb des Magens und am Zwölffingerdarm befestigt)³⁵ (Abbildung 3A) und entfernen Sie sie vorsichtig mit einer Präparierschere und einer Pinzette.
7. Nach der Isolierung wird die Bauchspeicheldrüse in ein 50-ml-Röhrchen mit 10 ml eiskaltem PBS + 0,2 mg/ml Trypsin-Inhibitor überführt und auf Eis gelegt (Abbildung 3B).
   HINWEIS: In diesem Schritt kann die Bauchspeicheldrüse von maximal 3 Mäusen gepoolt und in 1 Röhrchen übertragen werden. Die Proben können für eine maximale Zeit von 2 Stunden auf Eis aufbewahrt werden.

2. Kollagenase-Vorbereitung (geschätzte Zeit: 15-30 min)

1. Bereiten Sie Lösungen und Puffer wie unten beschrieben vor.
   1. Dissoziationslösung: Kollagenase Typ I in ein 50-ml-Röhrchen bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS 1x (Ca²⁺, Mg²⁺; siehe Materialtabelle) und 0,001 U/ml DNase I + 0,2 mg/ml Trypsin-Inhibitor geben.
   2. Dissoziationsstopplösung: Fügen Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS 1x, ohne Ca²⁺, Mg²⁺; dasselbe gilt für alle anderen PBS in diesem Protokoll; siehe Materialtabelle), 5 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,001 U/ml DNase I oder DMEM + 10 % FBS + 0,001 MU/ml DNase I hinzu.
   3. Waschpuffer: Fügen Sie PBS 1x, 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,001 U/ml DNase I + 0,05 mg/ml Trypsininhibitor hinzu.
2. Puffer vollständig auflösen und durch einen 0,22 μm Filter filtrieren. Beiseite stellen und auf Eis legen.

3. Aufschluss (geschätzte Zeit: 40 min-1 h)

1. Entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse aus dem eiskalten PBS und legen Sie sie auf eine Petrischale auf Eis. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe (z. B. Milz, Fett, Ablagerungen) vorsichtig mit einer chirurgischen Schere und Pinzette (Abbildung 3C).
   HINWEIS: Es ist wichtig, Fett zu entfernen, da ein Überschuss an Lipiden die Verdauung des Gewebes beeinträchtigen kann.
2. Übertragen Sie die getrimmte Bauchspeicheldrüse der Maus in ein 5-ml-Röhrchen mit 1 ml Dissoziationslösung.
3. Halten Sie das Röhrchen auf Eis und hacken Sie das Pankreasgewebe mit einer Präparierschere in feine pipetierbare Stücke, z.B. 0,5 mm oder 1 mm. Lysat in ein 50-ml-Röhrchen umfüllen und auf Eis halten.
4. Geben Sie zusätzliche Bauchspeicheldrüse in das 5-ml-Röhrchen, mit dem das Pankreasgewebe zunächst zerkleinert wurde, und fügen Sie zusätzlich 1 ml Kollagenase hinzu. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf für mehrere Bauchspeicheldrüsenpräparate.
5. Geben Sie 2 ml Kollagenaselösung in das 5-ml-Röhrchen, um restliches Bauchspeicheldrüsengewebe zu entfernen, und übertragen Sie es in das 50-ml-Röhrchen. Das Gesamtkollagenasevolumen sollte 5 ml für 3 Bauchspeicheldrüsen oder 3 ml für eine einzelne Bauchspeicheldrüse betragen.
6. Sobald alle Proben mechanisch dissoziationiert wurden, werden die 50-ml-Röhrchen mit den homogenisierten Gewebelysaten in ein 37 °C warmes Wasserbad überführt und 10 Minuten lang inkubiert.
   HINWEIS: Rühren oder wirbeln Sie das Gewebegemisch während dieses Vorgangs nicht kräftig auf, da dies zum Bruch des Azinusgewebes und zur Freisetzung von reichlich endogenen Enzymen und DNA führen kann.
7. Nehmen Sie die Röhrchen aus dem Wasserbad und schwenken Sie sie vorsichtig, um sie gut zu vermischen, und lassen Sie sie weitere 10 Minuten im Wasserbad (Gesamtzeit: 20 Minuten).
   HINWEIS: 30 min im 37 °C warmen Wasserbad nicht überschreiten, um eine Überverdauung zu vermeiden.
8. Stellen Sie die Röhrchen auf Eis und lassen Sie das Homogenat durch die Schwerkraft absetzen. Nach dem Absetzen wird der Überstand durch einen 70-μm-Filter geleitet und 5 ml Dissoziationsstopplösung hinzugefügt.
9. Geben Sie zusätzlich 1 ml Dissoziationslösung zu dem restlichen Pellet und zerreiben Sie es mit einer 18-G-Nadel.
10. Das restliche Homogenat wird durch den Filter geleitet und mit zusätzlichen 5 ml Dissoziationsstopplösung gewaschen.
11. Spin-Zellen-Suspension bei 300 x g für 10 min, bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand vollständig durch Aspiration und halten Sie das Zellpellet auf Eis.
12. Das Zellpellet mit 1 mL Waschpuffer resuspendieren und in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen.
13. Nehmen Sie ein kleines Aliquot aus dem resuspendierten Zellpellet (10 μl) und mischen Sie es mit Trypanblau im Verhältnis 1:1, um die Zellen mit einem Zellzähler zu zählen und die Lebensfähigkeit zu messen.

4. Anreicherung der Endothelzellen (EC) (geschätzte Zeit: 2-3 h)

1. 1 μl anti-CD31-Biotin-Antikörper pro 1 x 10^{7 gezählten} Zellen zugeben und 30 min bei 4 °C auf einem Rotator inkubieren (ca. 5 μl pro 3 Bauchspeicheldrüse).
2. 20 μl Anti-Biotin-Mikrokügelchen zugeben und 40 min bei 4 °C auf einem Röhrchenrotator inkubieren.
3. Stellen Sie einen Magnetständer mit dem Säulentrennerhalter auf und setzen Sie die Säule auf. Säule mit 3 mL Waschpuffer äquilibrieren.
4. Geben Sie die Probe in die Säule und waschen Sie sie mit insgesamt 9 mL Waschpuffer.
   HINWEIS: Wenn die Zellkonzentration hoch ist, verdünnen Sie die Zellen mit zusätzlichen 2 ml Waschpuffer in einem separaten Röhrchen. Geben Sie jeweils 1 ml Probe in die Säule, um ein Verstopfen der Säule zu verhindern.
5. Nehmen Sie die Säule aus dem Säulenhalter und legen Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen. Geben Sie 5 ml Waschpuffer in die Säule. Verwenden Sie den Kolben, um die Zellen in der Säule nach unten zu drücken und die Elution (die angereichertes EC enthält) zu sammeln.
6. Schleudern Sie den Durchfluss und die Elutions-/EC-Fraktion bei 300 x g für 10 min bei 4 °C herunter. Zählen Sie die Zellen und messen Sie die Lebensfähigkeit wie in Schritt 3.13.
7. Validierung der EC-Anreicherung mittels qPCR von Flow-Through- und EC-Fraktionen. Verwenden Sie NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) als allgemeinen Marker für endokrine Zellen und Thrombozyten- und Endothelzelladhäsionsmolekül (Pecam1) als Marker für EC³³. Verwenden Sie 36B4 (Rplp0, saures ribosomales Phosphoprotein p0) als interne Kontrolle für die Normalisierung der Genexpression.
   HINWEIS: In diesem Schritt können gesammelte Proben für Protein- oder RNA-Analysen verwendet werden.

5. Kultivierung von pECs

1. Bereiten Sie das M199-Medium vor. Ergänzen Sie M199 Medium mit einer Endkonzentration von 20 % fötalem Rinderserum (FBS) und 0,1 % Penicillin-Streptomycin.
2. Eine 60 mm Zellkulturplatte mit Kollagen Typ I (1 mg/ml in 0,1 M Essigsäure) bestreichen und 30 Minuten bei Raumtemperatur ziehen lassen.
3. Entfernen Sie Kollagen Typ I und spülen Sie die Platte zweimal mit 1X PBS aus. Geben Sie 2 ml des vorbereiteten M199-Mediums hinzu und stellen Sie die Zellkulturplatte für 5 Minuten in einen Standard-Zellkulturinkubator (5 % CO₂, 37 °C).
4. Sobald die Zellen isoliert wurden, geben Sie die isolierten Zellen in eine vorgewärmte M199-Zellkulturplatte. Bewahren Sie die Zellen ca. 14 Tage unter Kulturbedingungen auf und wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.

Ergebnisse

Nach diesem Protokoll können etwa 2 x 10⁶ lebende Zellen gewonnen werden, wenn 3 Maus-Bauchspeicheldrüsen gepoolt werden, und 750.000 Zellen aus einer einzigen Maus-Bauchspeicheldrüse. Um die Anreicherung von EC zu validieren, führten wir die folgenden Analysen durch: 1) quantitative PCR: Im Vergleich zu den Flow-Through-Proben (d.h. den nicht-CD31-Antikörper-gebundenen Fraktionen) wiesen die EC-Fraktionen signifikant höhere Spiegel von Pecam1 (kodiert für CD31...

Diskussion

In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll zur Anreicherung und Isolierung der pECs vor. Ähnlich wie frühere EC-Isolierungsprotokolle aus anderen Geweben oder Organen besteht dieses Protokoll aus drei Hauptprozessen, nämlich der physikalischen Dissoziation, dem enzymatischen Verdau und der Antikörper-basierten EC-Anreicherung. Um den einzigartigen Herausforderungen bei der Verarbeitung der Bauchspeicheldrüse gerecht zu werden, haben wir mehrere wichtige Anpassungen und kritische Sc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
25G needles	BD	305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q712-03-AA
5 mL eppendorf	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
70 µm strainer	Fisher	22-363-548
Anti-CD31-biotin	Miltenyi Biotech	REA784
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Collagen Type 1, from calf skin	Sigma Aldrich	C9791	Attachment reagent in the protocol
Collagenase Type 1	Worthington Bio	LS004197
Countess Automatic Cell Counter	Thermo Fisher
DAPI	Thermo Fisher	D1306	immunofluorescence
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
DNAse I	Roche	260913
D-PBS (Ca2+,Mg2+)	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
LS Columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
M199	Sigma	M2520-1L
MACS MultiStand with the QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech	130-042-303
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Microbeads anti-biotin	Miltenyi Biotech	130-090-485
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Molecular Grade Water	Corning	46-000-CM
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
PECAM1 (CD31) Antibody	Abcam	ab56299	immunofluorescence
PECAM1 (CD31) Antibody	R&D Systems	AF3628
Phosphate Buffered Saline (10X) (no Ca2+,no Mg2+)	Genesee Scientific	25-507-XB
Primer 36B4 Forward mouse	IDT		AGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese mouse	IDT		TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Forward mouse	IDT		TCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Reverse mouse	IDT		AAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Reverse mouse	IDT		CACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 Forward mouse	IDT		CTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 Forward mouse	IDT		ACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 Reverse mouse	IDT		TCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Tissue Culture Dishes 2cm	Genesee Scientific	25-260
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
Trypsin Inhibitor	Roche	10109886001
Tween-20
VE-Cadherin Antibody	Abcam	ab33168	immunofluorescence
Waterbath