JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает выделение эндотелиальных клеток мыши из целой поджелудочной железы.

Аннотация

Поджелудочная железа является жизненно важным органом для поддержания метаболического баланса в организме, отчасти благодаря производству метаболических гормонов, таких как инсулин и глюкагон, а также пищеварительных ферментов. Поджелудочная железа также является сильно васкуляризированным органом, чему способствует сложная сеть капилляров поджелудочной железы. Эта обширная капиллярная сеть состоит из высокофенестрированных эндотелиальных клеток (ЭК), важных для развития и функционирования поджелудочной железы. Соответственно, дисфункция ЭК может способствовать дисфункции поджелудочной железы при таких заболеваниях, как диабет и рак. Таким образом, исследование функции ЭК поджелудочной железы (pECs) важно не только для понимания биологии поджелудочной железы, но и для развития ее патологий. Мышиные модели являются ценным инструментом для изучения метаболических и сердечно-сосудистых заболеваний. Тем не менее, не существует установленного протокола с достаточным подробным описанием для выделения ЭК мышей из-за относительно небольшой популяции ЭК и большого количества пищеварительных ферментов, потенциально высвобождаемых из ацинарной ткани, что может привести к повреждению клеток и, следовательно, к низкому выходу. Чтобы решить эти проблемы, мы разработали протокол обогащения и восстановления pEC мышей, сочетающий мягкую физическую и химическую диссоциацию и отбор, опосредованный антителами. Представленный здесь протокол обеспечивает надежный метод извлечения неповрежденных и жизнеспособных ЭК из всей поджелудочной железы мыши. Этот протокол подходит для нескольких последующих анализов и может быть применен к различным моделям мышей.

Введение

Поджелудочная железа, играющая ключевую роль в метаболическом контроле и гомеостазе, является сильно васкуляризированным органом. Поджелудочная железа выполняет как эндокринную, так и экзокринную функции, контролируя регуляцию уровня глюкозы в крови и пищеварительных ферментов соответственно. Эти два компартмента связаны между собой обширной сетью кровеносных сосудов поджелудочной железы, облегчающих обмен и транспортировку кислорода, гормонов и ферментов. Важно отметить, что эта плотная капиллярная сеть проникает в островок Лангерганса, скопление гормонорегулирующих клеток в поджелудочной железе, отвечающих за ее эндокринную функцию, состоящее из глюкагон-секретирующих альфа-клеток (α), инсулин-секретирующих бета-клеток (β) и соматостатин-секретирующих дельта-клеток (δ) 1,2. Хотя островки составляют всего 1-2% от массы поджелудочной железы, они получают 20% отобщего кровотока3, что подчеркивает важность сосудистой сети островков. Капилляры поджелудочной железы в основном состоят из высокофенестрированных эндотелиальных клеток (ЭК), которые окружены пристеночными перицитами. Эти капиллярные ЭК играют жизненно важную роль в развитии, созревании и (дис)функции островков и образуют тесные перекрестные связи с различными эндо- и экзокринными клетками4 (Рисунок 1).

Эндотелиальная дисфункция наблюдалась как при диабете 1, так и при диабете 2 типа, наиболее распространенных состояниях, вызванных дисфункцией островков поджелудочной железы 5,6. Плотность и морфология микрососудов островков могут быть изменены при сахарном диабете7. Кроме того, рак поджелудочной железы, высокоагрессивная опухоль, которая также может проявляться в виде сахарного диабета, характеризуется высокой микрососудистой плотностью при плохой перфузии8. Учитывая ключевую структурную и функциональную роль ЭК как в нормальной, так и в больной ткани поджелудочной железы, существует актуальная необходимость в изучении ЭК в развитии, физиологии и патологии, чтобы раскрыть механизмы, которые управляют здоровьем или болезнями.

Разработаны многочисленные протоколы для выделения ЭК у различных мышей (например, мозга 9,10, легких11, сердца12, печени13, скелетных мышц14 и жировых тканей15) и человека (например, мозга16, висцеральной жировой ткани17,18, периферических нервов19, легких 20,21,22 и брыжеечной артерии 23) тканей. Эти протоколы обычно включают использование ферментативных расщеплений (например, коллагеназой, трипсином24, диспазой 24,25 и либеразой26) с последующей стадией обогащения на основе антител. Кроме того, эти протоколы, как правило, основываются на длительной продолжительности переваривания в высоких концентрациях ферментов с энергичным перемешиванием при 37 °C (табл. 1). Из-за уникальных особенностей поджелудочной железы, в том числе из-за того, что она содержит множество эндогенных пищеварительных ферментов, эти существующие протоколы не могут быть непосредственно применены для выделения pEC. Во-первых, состав внеклеточного матрикса (ВКМ) поджелудочной железы отличается от других тканей. В то время как коллагеназа обычно используется для выделения ЭК, существует несколько подтипов с различными тканеспецифическими возможностями диссоциации, что требует оптимизации. Во-вторых, и это имеет решающее значение для выделения pEC, высвобождение и активация эндогенных ферментов поджелудочной железы может значительно замедлить процесс выделения. С этой целью необходимо соблюдать осторожность, чтобы свести к минимуму разрыв экзокринных ацинарных клеток (основного источника зимогенов, протеаз и РНКазы27), которые могут вызвать дальнейшее повреждение клеток и привести к низкой жизнеспособности клеток и общему эффекту восстановления 27,28,29.

Чтобы решить эти проблемы, мы адаптировали методы существующих протоколов изоляции КЭ и разработали новый протокол, подходящий для выделения КЭ из поджелудочной железы мыши. В частности, мы описываем здесь рабочий процесс (рис. 2) с использованием коллагеназы типа I (обычно применяемой для выделения ЭК легких), более низкой температуры пищеварения и отсутствия перемешивания (для предотвращения активации ферментов поджелудочной железы), а также добавок ДНКазы 30,31,32 (для предотвращения ДНК-индуцированного апоптоза и улучшения жизнеспособности клеток), а также антител к CD3133 (PECAM1, пан-EC маркер). В соответствии с описанным протоколом создаются популяции ЭК, выделенные из поджелудочной железы мышей, которые могут быть использованы для профилирования экспрессии генов и анализа белков.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Выделение тканей проводилось в соответствии с утвержденным протоколом исследования #17010 Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Научно-исследовательского института Бекмана, Город надежды (Дуарте, Калифорния, США). Здесь мы используем Tie-2CreERT2; Линия мышей Rosa26-TdTomato в фоновом классе C57BL/6 в возрасте от 8 до 12 недель. В этой линии ЭК мечаются TdTomato при индуцировании тамоксифеном, как описано ранее34. Тем не менее, этот протокол может быть адаптирован для всех возрастов взрослых мышей с различными генотипами и генетическим фоном.

1. Забор тканей (ориентировочное время: 1-2 часа)

ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентировочное время составляет 15 минут на животное, рекомендуется максимум 3 животных в одном образце диссоциации.

  1. Усыпляют животных путем передозировки углекислого газа (СО2) с последующим вторичным подтверждением смерти. Перед вскрытием распылите на все тело 70% этанол (EtOH), полностью продезинфицировав операционную зону.
  2. Вытяните и закрепите конечности с помощью булавок. С помощью хирургических ножниц сделайте небольшой разрез по средней линии через кожу и брюшину, начиная с нижней части живота и продолжая по направлению к грудному отделу.
  3. Обнажите грудную клетку, разрезав диафрагму, и поднимите грудную клетку, чтобы обнажить сердце.
  4. Введите иглу (25G-30G), соединенную со шприцем, содержащим ледяной стерильный PBS, в левый желудочек сердца.
  5. Начните перфузию с введения PBS через сердце со скоростью 5 - 10 мл/мин. Прекратите после введения 10 мл или до тех пор, пока печень и почки не обесцвечиваются.
  6. После перфузии найдите поджелудочную железу (ниже желудка и прикрепленную к двенадцатиперстной кишке)35 (рисунок 3А) и осторожно удалите ее с помощью препарирующих ножниц и щипцов.
  7. После выделения перенесите поджелудочную железу в трубку объемом 50 мл, содержащую 10 мл ледяного PBS + ингибитор трипсина 0,2 мг/мл, держите на льду (рис. 3B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поджелудочная железа максимум от 3 мышей может быть объединена на этом этапе и перенесена в 1 пробирку. Образцы можно держать на льду не более 2 часов.

2. Препарат коллагеназы (ориентировочное время: 15-30 мин)

  1. Подготовьте растворы и буферы, как описано ниже.
    1. Раствор для диссоциации: Добавьте коллагеназу типа I в пробирку объемом 50 мл до конечной концентрации 1 мг/мл в фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS 1x (Ca2+, Mg2+; см. Таблицу материалов) и 0,001 Ед/мл ДНКазы I + 0,2 мг/мл ингибитора трипсина.
    2. Раствор для остановки диссоциации: Добавьте фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS 1x, без Ca2+, Mg2+; то же самое для всех остальных PBS в этом протоколе; см. Таблицу материалов), 5% бычий сывороточный альбумин (BSA), 0,001 Ед/мл ДНКазы I или DMEM + 10% FBS + 0,001 МКМ/мл ДНКазы I.
    3. Буфер для стирки: Добавьте PBS 1x, 0,5% альбумин бычьей сыворотки (BSA), 0,001 ЕД/мл ДНКазы I + 0,05 мг/мл ингибитора трипсина.
  2. Полностью растворите буферы и отфильтруйте через фильтр 0,22 мкм. Отложите в сторону и держите на льду.

3. Пищеварение (ориентировочное время: 40 мин-1 час)

  1. Извлеките поджелудочную железу из ледяного ПБС и положите на чашку Петри поверх льда. Осторожно удалите излишки тканей (например, селезенку, жир, мусор) хирургическими ножницами и пинцетом (рисунок 3C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно удалить жир, так как избыток липидов может помешать перевариванию тканей.
  2. Перенесите обрезанную поджелудочную железу мыши в пробирку объемом 5 мл, содержащую 1 мл диссоциативного раствора.
  3. Держите трубку на льду и измельчите ткани поджелудочной железы с помощью ножниц-препараторов на мелкие кусочки, пригодные для напижевания, например, 0,5 мм или 1 мм. Перелейте лизат в пробирку объемом 50 мл и держите на льду.
  4. Добавьте дополнительную поджелудочную железу в трубку объемом 5 мл, используемую для первоначального измельчения ткани поджелудочной железы, и добавьте еще 1 мл коллагеназы. Повторите по мере необходимости для многократной подготовки поджелудочной железы.
  5. Добавьте 2 мл раствора коллагеназы в пробирку объемом 5 мл, чтобы удалить остатки ткани поджелудочной железы, и перенесите в пробирку объемом 50 мл. Общий объем коллагеназы должен составлять 5 мл для 3 поджелудочной железы или 3 мл для одной поджелудочной железы.
  6. После того, как все образцы подвергнутся механической диссоциации, перенесите 50 мл пробирок, содержащих гомогенизированные лизаты тканей, в водяную баню при температуре 37 °C и инкубируйте в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не перемешивайте и не переворачивайте тканевую смесь во время этого процесса, так как это может привести к разрыву ацинарных тканей и высвобождению большого количества эндогенных ферментов и ДНК.
  7. Снимите трубки с водяной бани и аккуратно перемешайте, чтобы хорошо перемешать, и оставьте на водяной бане еще на 10 мин. (Общее время: 20 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 30 минут на водяной бане при температуре 37 °C, чтобы избежать переваривания.
  8. Поместите трубки на лед и дайте гомогенату осесть под действием силы тяжести. После отстаивания пропустите надосадочную жидкость через фильтр 70 мкм и добавьте 5 мл раствора для остановки диссоциации.
  9. Добавьте еще 1 мл диссоциативного раствора к оставшейся грануле и растирайте иглой 18G.
  10. Пропустите оставшийся гомогенат через фильтр и промойте еще 5 мл раствора для остановки диссоциации.
  11. Взвесьте спиновые ячейки при 300 x g в течение 10 мин, при 4 °C. Полностью удалите надосадочную жидкость путем аспирации и держите клеточную гранулу на льду.
  12. Суспензируйте клеточную гранулу с 1 мл промывочного буфера и переложите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  13. Возьмите небольшую аликвоту из ресуспендированной клеточной гранулы (10 μл) и смешайте с трипановым синим в соотношении 1:1, чтобы подсчитать клетки с помощью счетчика клеток и измерить жизнеспособность.

4. Обогащение эндотелиальными клетками (ЭК) (ориентировочное время: 2-3 часа)

  1. Добавьте 1 мкл антитела к CD31-биотину на каждые 1 x 107 подсчитанных клеток и инкубируйте в течение 30 мин при 4 °C на ротаторе (около 5 мкл на 3 поджелудочной железы).
  2. Добавьте 20 μL микрогранул, антибиотиновых микрогранул и инкубируйте в течение 40 минут при 4 °C на вращателе пробирки.
  3. Установите магнитную стойку с держателем сепаратора колонн и установите колонку. Уравновесьте колонку 3 мл промывочного буфера.
  4. Добавьте образец в колонку и промойте буфером для промывки 9 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если концентрация клеток высокая, разведите клетки еще 2 мл промывочного буфера в отдельной пробирке. Добавляйте по 1 мл образца за раз в колонку, чтобы предотвратить ее засорение.
  5. Снимите колонку с держателя колонки и поместите в пробирку объемом 15 мл. Добавьте в колонку 5 мл буфера для промывки. С помощью поршня нажмите на ячейки в колонке и соберите элюирование (которое содержит обогащенный EC).
  6. Отжим проточную и элюирующую фракцию при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C. Подсчитайте клетки и измерьте жизнеспособность, как показано на шаге 3.13.
  7. Валидация ЕС-обогащения с помощью количественной ПЦР проточных и ЕС-фракций. Используйте NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) в качестве общего маркера эндокринных клеток и молекулу адгезии тромбоцитов и эндотелиальных клеток (Pecam1) в качестве маркера EC33. Используйте 36B4 (Rplp0, кислый рибосомальный фосфопротеин p0) в качестве внутреннего контроля для нормализации экспрессии генов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные образцы могут быть использованы для анализа белка или РНК на этом этапе.

5. Культивирование pEC

  1. Приготовьте М199 средний. Добавьте М199 в средней до конечной концентрации 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 0,1% пенициллин-стрептомицина.
  2. Покройте 60 мм клеточную культуральную пластину коллагеном типа I (1 мг/мл в 0,1 М уксусной кислоте) и оставьте на 30 минут при комнатной температуре.
  3. Удалите коллаген I типа и промойте пластину 1X PBS дважды. Добавьте 2 мл подготовленной среды M199 и поместите планшет для клеточной культуры в стандартный инкубатор для клеточных культур (5% CO2, 37 °C) на 5 минут.
  4. После того, как клетки были изолированы, добавьте изолированные клетки в предварительно нагретую клеточную культуральную планшет M199. Держите клетки в культивируемых условиях примерно 14 дней и меняйте среды каждые 2-3 дня.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Следуя этому протоколу, можно получить примерно 2 x 106 живых клеток при объединении 3 поджелудочных желез мышей и 750 000 клеток из одной поджелудочной железы мыши. Чтобы подтвердить обогащение EC, мы провели следующие анализы: 1) количественная ПЦР: по сравнению с прот...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этой статье мы представляем протокол обогащения и изоляции pEC. Подобно предыдущим протоколам выделения КЭ из других тканей или органов, этот протокол состоит из трех основных процессов, а именно: физической диссоциации, ферментативного переваривания и обогащения Э?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят доктора Брайана Армстронга из «Города надежды» и Минди Родригес из Калифорнийского университета в Риверсайде за техническую помощь. Это исследование было частично профинансировано грантами от NIH (R01 HL145170 к ZBC), Фонда Эллы Фицджеральд (к ZBC), City of Hope (премия Артура Риггса за инновации в области метаболизма диабета и исследований) и гранта Калифорнийского института регенеративной медицины EDU4-12772 (к AT). Исследования, представленные в этой публикации, включали работу, выполненную в области световой микроскопии и цифровой визуализации при поддержке Национального института рака NIH под номером P30CA033572. Рисунок 1 и Рисунок 2 были сделаны с помощью BioRender.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL eppendorfUSA Scientific1615-5500
10 cm dishGenesee Scientific25-202
25G needlesBD305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ712-03-AA
5 mL eppendorfThermo Fisher 14282300
6-well plateGreiner Bio-One07-000-208
70 µm strainerFisher22-363-548
Anti-CD31-biotinMiltenyi BiotechREA784
Bovine serum albumin heat shock treatedFisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
CentrifugeEppendorf
Collagen Type 1, from calf skinSigma Aldrich C9791Attachment reagent in the protocol
Collagenase Type 1 Worthington BioLS004197
Countess Automatic Cell CounterThermo Fisher 
DAPIThermo Fisher D1306immunofluorescence
Disposable Safety ScalpelsMyco Instrumentation6008TR-10
DNAse I Roche260913 
D-PBS (Ca2+,Mg2+)Thermo Fisher 14080055
EthanolFisherBP2818-4
Fetal bovine serumFisher10437028
IncubatorKept at 37 °C 5% CO2
LS ColumnsMiltenyi Biotech130-042-401
M199SigmaM2520-1L
MACS MultiStand with the QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech130-042-303
Medium 199Sigma Aldrich M2520-10X
Microbeads anti-biotinMiltenyi Biotech130-090-485
MicroscopeLeicaTo assess cell morphology
Molecular Grade WaterCorning46-000-CM
NaClFisherS271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker Eppendorf
PECAM1 (CD31) AntibodyAbcamab56299immunofluorescence
PECAM1 (CD31) AntibodyR&D SystemsAF3628
Phosphate Buffered Saline (10X) (no Ca2+,no Mg2+)Genesee Scientific25-507-XB
Primer 36B4 Forward mouseIDTAGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese mouse IDTTCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Forward mouse IDTTCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Reverse mouseIDTAAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Reverse mouse IDTCACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 Forward mouseIDTCTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 Forward mouseIDTACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 Reverse mouseIDTTCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAPThermo Fisher AM9780
RNase-free waterTakaraRR036B
Sterile 12" long forcepsF.S.T91100-16
Sterile fine forcepsF.S.T11050-10
Sterile fine scissorsF.S.T14061-11
Tissue Culture Dishes 2cmGenesee Scientific25-260
TRIzol reagentFisher15596018
Trypan BlueCorningMT25900CI
Trypsin Inhibitor Roche10109886001
Tween-20
VE-Cadherin AntibodyAbcamab33168immunofluorescence
Waterbath

Ссылки

  1. Ballian, N., Brunicardi, F. C. Islet vasculature as a regulator of endocrine pancreas function. World J Surg. 31 (4), 705-714 (2007).
  2. Almaca, J., Weitz, J., Rodriguez-Diaz, R., Pereira, E., Caicedo, A. The pericyte of the pancreatic islet regulates capillary diameter and local blood flow. Cell Metab. 27 (3), 630-644 (2018).
  3. Lifson, N., Lassa, C. V., Dixit, P. K. Relation between blood flow and morphology in islet organ of rat pancreas. Am J Physiol. 249, 1 Pt 1 E43-E48 (1985).
  4. Burganova, G., Bridges, C., Thorn, P., Landsman, L. The role of vascular cells in pancreatic beta-cell function. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 667170(2021).
  5. Hadi, H. A., Suwaidi, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Vasc Health Risk Manag. 3 (6), 853-876 (2007).
  6. Granlund, L., Hedin, A., Korsgren, O., Skog, O., Lundberg, M. Altered microvasculature in pancreatic islets from subjects with type 1 diabetes. PLoS One. 17 (10), e0276942(2022).
  7. Dai, C., et al. Pancreatic islet vasculature adapts to insulin resistance through dilation and not angiogenesis. Diabetes. 62 (12), 4144-4153 (2013).
  8. Nishikawa, Y., Tsuji, Y., Isoda, H., Kodama, Y., Chiba, T. Perfusion in the tissue surrounding pancreatic cancer and the patient's prognosis. Biomed Res Int. 2014, 648021(2014).
  9. Conchinha, N. V., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: Brain, chord, lung, and muscle. STAR Protoc. 2 (3), 100508(2021).
  10. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  11. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Sci Rep. 9 (1), 1458(2019).
  12. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: Small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protoc. 2 (2), 100489(2021).
  13. Guo, Q., Furuta, K., Aly, A., Ibrahim, S. H. Isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells. J Vis Exp. (178), e63062(2021).
  14. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753(2008).
  15. Tang, X., et al. Suppression of endothelial ago1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
  16. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  17. Chaurasiya, V., et al. Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication. Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).
  18. Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: Differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
  19. Domer, P., et al. Rapid and efficient immunomagnetic isolation of endothelial cells from human peripheral nerves. Sci Rep. 11 (1), 1951(2021).
  20. Comhair, S. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. Am J Respir Cell Mol Biol. 46 (6), 723-730 (2012).
  21. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: Isolation, culture, and characterization. Microvasc Res. 46 (1), 89-102 (1993).
  22. Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulm Circ. 7 (1), 108-116 (2017).
  23. Malhi, N. K., et al. Isolation and profiling of human primary mesenteric arterial endothelial cells at the transcriptome level. J Vis Exp. (181), e63307(2022).
  24. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  25. Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of liberase hi and collagenase nb1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19 (1), 3-8 (2010).
  26. Waise, S., et al. An optimised tissue disaggregation and data processing pipeline for characterising fibroblast phenotypes using single-cell rna sequencing. Sci Rep. 9 (1), 9580(2019).
  27. Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J Cell Biol. 63 (3), 1037-1056 (1974).
  28. Li, D., et al. Complete disassociation of adult pancreas into viable single cells through cold trypsin-edta digestion. J Zhejiang Univ Sci B. 14 (7), 596-603 (2013).
  29. Ji, B., Gaiser, S., Chen, X., Ernst, S. A., Logsdon, C. D. Intracellular trypsin induces pancreatic acinar cell death but not nf-kappab activation. J Biol Chem. 284 (26), 17488-17498 (2009).
  30. Mao, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the mouse pancreas: Characteristic features of pancreatic ductal cells in chronic pancreatitis. Genes (Basel). 13 (6), 1015(2022).
  31. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell rna sequencing. STAR Protoc. 1 (3), 100144(2020).
  32. Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nat Commun. 11 (1), 4516(2020).
  33. Park, S., Dimaio, T. A., Scheef, E. A., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Pecam-1 regulates proangiogenic properties of endothelial cells through modulation of cell-cell and cell-matrix interactions. Am J Physiol Cell Physiol. 299 (6), C1468-C1484 (2010).
  34. Kim, Y. W., et al. Integration of single-cell transcriptomes and biological function reveals distinct behavioral patterns in bone marrow endothelium. Nat Commun. 13 (1), 7235(2022).
  35. Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4 (11), 1649-1652 (2009).
  36. Malhi, N. K., et al. Serine-arginine-rich protein kinase-1 inhibition for the treatment of diabetic retinopathy. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 322 (6), H1014-H1027 (2022).
  37. Sachs, S., et al. Targeted pharmacological therapy restores beta-cell function for diabetes remission. Nat Metab. 2 (2), 192-209 (2020).
  38. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plast Reconstr Surg. 136 (2), 189-199 (2015).
  39. Arbiser, J. L., et al. Oncogenic h-ras stimulates tumor angiogenesis by two distinct pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (3), 861-866 (1997).
  40. Muraro, M. J., et al. A single-cell transcriptome atlas of the human pancreas. Cell Syst. 3 (4), 385-394 (2016).
  41. Segerstolpe, A., et al. Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes. Cell Metab. 24 (4), 593-607 (2016).
  42. Kang, R. B., et al. Single-nucleus rna sequencing of human pancreatic islets identifies novel gene sets and distinguishes beta-cell subpopulations with dynamic transcriptome profiles. Genome Med. 15 (1), 30(2023).
  43. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Res. 27 (2), 208-222 (2017).
  44. Fasolino, M., et al. Single-cell multi-omics analysis of human pancreatic islets reveals novel cellular states in type 1 diabetes. Nat Metab. 4 (2), 284-299 (2022).
  45. Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells. J Vis Exp. (195), e64871(2023).
  46. Castillo, J. J., et al. Islet amyloid polypeptide aggregation exerts cytotoxic and proinflammatory effects on the islet vasculature in mice. Diabetologia. 65 (10), 1687-1700 (2022).
  47. Tremblay, J. R., et al. Rare, tightly-bound, multi-cellular clusters in the pancreatic ducts of adult mice function like progenitor cells and survive and proliferate after acinar cell injury. Stem Cells. 42 (4), 385-401 (2024).
  48. Zook, H. N., et al. Activation of ductal progenitor-like cells from adult human pancreas requires extracellular matrix protein signaling. iScience. 27 (3), 109237(2024).
  49. Sordi, V., et al. Establishment, characterization and long-term culture of human endocrine pancreas-derived microvascular endothelial cells. Cytotherapy. 19 (1), 141-152 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

208

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены