JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم وصف استراتيجية تحضير العينة لتصوير أجنة الزرد المبكرة داخل مشيمة سليمة باستخدام مجهر صفائح ضوئي. يحلل الاتجاهات المختلفة التي تكتسبها الأجنة داخل المشيمة في مراحل 70٪ من المشيمة والبراعم ويفصل استراتيجيات التصوير للحصول على دقة على نطاق خلوي في جميع أنحاء الجنين باستخدام نظام الورقة الضوئية.

Abstract

أصبح الفحص المجهري للصفائح الضوئية هو المنهجية المفضلة للتصوير الحي لأجنة أسماك الزرد على نطاقات زمنية طويلة مع الحد الأدنى من السمية الضوئية. على وجه الخصوص ، يتيح نظام الرؤية المتعددة ، الذي يسمح بتدوير العينة ، تصوير أجنة كاملة من زوايا مختلفة. ومع ذلك ، في معظم جلسات التصوير باستخدام نظام متعدد الرؤية ، يعد تركيب العينة عملية مزعجة حيث يتم تحضير العينات عادة في أنبوب بوليمر. للمساعدة في هذه العملية ، يصف هذا البروتوكول استراتيجيات التركيب الأساسية لتصوير التطور المبكر لأسماك الزرد بين 70٪ من مراحل الجسيدات المبكرة. على وجه التحديد ، توفر الدراسة إحصائيات عن المواضع المختلفة التي تتخلف عنها الأجنة في مراحل epiboly والبراعم بنسبة 70٪ داخل المشيمة. علاوة على ذلك ، فإنه يناقش العدد الأمثل للزوايا والفاصل الزمني بين الزوايا المطلوبة لتصوير أجنة أسماك الزرد الكاملة في المراحل المبكرة من التطور بحيث يمكن استخراج المعلومات على نطاق خلوي عن طريق دمج وجهات النظر المختلفة. أخيرا ، نظرا لأن الجنين يغطي مجال رؤية الكاميرا بالكامل ، وهو أمر مطلوب للحصول على دقة على نطاق خلوي ، فإن هذا البروتوكول يوضح بالتفصيل عملية استخدام معلومات الخرزة من أعلى أو أسفل الجنين لتسجيل وجهات النظر المختلفة.

Introduction

يعد ضمان الحد الأدنى من السمية الضوئية مطلبا رئيسيا لتصوير الأجنة الحية ذات الدقة الزمانية المكانية العالية لفترات طويلة. على مدى العقد الماضي ، أصبح الفحص المجهري للورقة الضوئية هو المنهجية المفضلة لتلبية هذا المطلب1،2،3،4،5،6،7. باختصار ، في هذه التقنية التي تم استخدامها لأول مرة في عام 2004 لالتقاط العمليات التنموية8 ، تمر لوحان رفيعان محاذيان من الليزر عبر الجنين من نهايات متعارضة ، مما يضيء فقط مستوى الاهتمام. يتم وضع هدف الكشف بشكل متعامد ، ثم يتم جمع ضوء الفلورسنت المنبعث من جميع النقاط المضيئة في العينة في وقت واحد. ثم يتم الحصول على صورة ثلاثية الأبعاد عن طريق تحريك الجنين بالتتابع عبر ورقة الضوء الساكنة.

بالإضافة إلى ذلك ، في شكل محدد من هذه المنهجية ، يسمى الفحص المجهري للصفائح الضوئية متعددة الرؤوس ، يمكن تعليق العينات في أنبوب بوليمر يمكن تدويره باستخدام دوار ، مما يتيح تصوير نفس الجنين من زوايا متعددة9،10،11. بعد التصوير ، يتم دمج الصور من زوايا متعددة بناء على علامات التسجيل ، والتي عادة ما تكون علامات فلورية كروية داخل الجنين (على سبيل المثال ، النوى) أو في الأنبوب (على سبيل المثال ، حبات الفلورسنت). يعمل التصوير متعدد الرؤوس والاندماج على تحسين الدقة المحورية بشكل كبير ، مما يوفر دقة متناحية، عبر جميع الأبعادالثلاثة 12. في حين أن هذه ميزة كبيرة ، فإن التحدي الرئيسي لمنهجية الرؤية المتعددة هو تركيب العينات ، حيث يجب تركيب الأجنة والاحتفاظ بها في مكانها في الأنابيب طوال فترة التصوير الزمنية.

لإجراء التصوير متعدد المشاهدات ، للحفاظ على الأجنة في مكانها ومنع الحركة أثناء التصوير ، يمكن تضمين الأجنة في الاغاروز. ومع ذلك ، غالبا ما يؤدي هذا إلى نمو وتطور ضارين ، خاصة بالنسبة لأجنة الزرد في المراحل المبكرة13 ، وهو النظام النموذجي الذي تمت مناقشته هنا. تتمثل استراتيجية التركيب الثانية في استخدام أنبوب رفيع أكبر قليلا من قطر الجنين ، حيث يمكن سحب الجنين إلى الأنبوب جنبا إلى جنب مع وسط الجنين ، متبوعا بإغلاق قاع الأنبوب بسدادة الاغاروز14. في هذه الطريقة ، نظرا لأن الأنبوب مملوء بوسط الجنين ، لا يمكن استخدام علامات التسجيل مثل حبات الفلورسنت لدمج وجهات النظر المختلفة ، وبالتالي يعتمد التسجيل على علامات داخل الجنين. بشكل عام ، تعمل الخرزات كعلامات تسجيل أفضل حيث تتحلل إشارة العلامات داخل الجنين عند الانتقال إلى عمق العينة بسبب قيود الإضاءة والكشف عن أي مجهر.

وبالتالي ، فإن النهج الثالث ، الذي سيتم تفصيله هنا واستخدامه سابقا5،13،14،15،16 ، هو تصوير أجنة الزرد المبكرة بمشيمة سليمة وملء الأنبوب بنسبة مئوية قليلة من الاغاروز ، والذي يحتوي على خرز كعلامات تسجيل. في هذا السيناريو ، نظرا لأن التدخل اليدوي لوضع الأجنة داخل المشيمة غير ممكن ، فإن هذه الدراسة تقدم إحصائيات حول الاتجاه الافتراضي الذي تقع فيه أجنة الزرد المبكرة ، مع التركيز بشكل خاص على 70٪ من مراحل epiboly والبراعم. ثم يناقش العدد الأمثل من المشاهدات المطلوبة لتصوير الأجنة في المراحل المبكرة بدقة على نطاق خلوي ويفصل عملية الاندماج باستخدام BigStitcher ، وهو مكون إضافي قائم على فيجي10،17،18. يهدف هذا البروتوكول معا ، الذي يستخدم هدف NA 20x / 1 ، إلى تسهيل علماء الأجنة في استخدام أنظمة الألواح الضوئية متعددة الرؤوس لتصوير الأجنة باستخدام النوى وعلامات الأغشية من المعدة إلى مراحل الجسيدات المبكرة.

Protocol

تمت الموافقة على صيانة أسماك الزرد والإجراءات التجريبية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لأخلاقيات ، عبر المرجع TIFR / IAEC / 2023-1 و TIFR / IAEC / 2023-5. تم حقن الأجنة التي تم الحصول عليها عن طريق تهجين الأسماك متغايرة الزيجوت التي تعبر عن Tg (actb2: GFP-Hsa.UTRN) 19 ب H2A-mCherry mRNA (30 pg) في مرحلة الخلية الواحدة. H2A-mCherry تم تصنيع mRNA باستخدام pCS2 + H2A-mCherry البلازميد (هدية من مختبر Oates ، EPFL) عن طريق النسخ في المختبر. تم تصوير الأجنة التي تعبر عن كلتا العلامتين ، المشار إليها باسم Utr-GFP و H2A-mCherry ، على التوالي ، في بقية البروتوكول ، في مرحلتي 70٪ من epiboly والبراعم. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. تحضير عينة للتصوير متعدد المشاهدات

  1. تحضير أنابيب FEP / PTFE
    1. قم بتنظيف أنابيب FEP / PTFE باتباع الإجراءات الموضحة سابقا14.
    2. بعد التنظيف ، قم بتقطيع الأنابيب إلى أطوال 2-2.5 سم حسب المتطلبات وقم بتخزينها في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 مل تحتوي على ماء مقطر مزدوج. يمكن تخزين الأنابيب بهذه الطريقة لمدة شهر تقريبا.
    3. قبل تحضير العينة ، قم بتسخين الأنابيب عند 70-75 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة تقريبا لتصويب الأنابيب. تجنب الاكتظاظ في كل أنبوب طرد مركزي دقيق لمنع التكتل ، مما يضمن مساحة كافية لاستقامة الأنبوب بشكل فعال.
      ملاحظة: ارتد القفازات أثناء إجراء معالجة الأنبوب بالكامل ، حيث أن أي بصمة / جسيمات غبار متبقية على الأنابيب قد تتداخل مع التصوير.
  2. تحضير الاغاروز
    1. قم بإعداد حلول مخزون E3 Buffer 50x على النحو التالي:
      1. مخزون 1 - 3.252 جم من Na2HPO4 ، 0.285 جم من KH2PO4 ، 11.933 جم من كلوريد الصوديوم ، 0.477 جم من كلوريد الصوديوم في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات
      2. مخزون 2 - 2.426 جم من CaCl2 ، 4.067 جم من MgSO4 في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات.
    2. لعمل 1x E3 عازلة ، أضف 20 مل لكل من المحاليل 1 و 2 في 960 مل من الماء منزوع الأيونات.
      ملاحظة: لا تضيف الميثيلين الأزرق في المخزن المؤقت E3 المستخدم للتصوير لأنه يتسبب في تشتت الضوء.
    3. قم بإذابة الاغاروز منخفض نقطة الانصهار في 1x E3 عن طريق التسخين عند 70-75 درجة مئوية على كتلة حرارية مع التحريك حتى يصبح المحلول صافيا بدون كتل أو بلورات.
    4. للتصوير متعدد المشاهدات ، أضف حبات الفلورسنت المتوفرة تجاريا (انظر جدول المواد) إلى محلول الاغاروز ، والذي يتيح تسجيل الصورة أثناء التحليل. Sonicate الخرز في درجة حرارة الغرفة بتردد 40 كيلو هرتز لمدة 20-30 دقيقة في جهاز الموجات فوق الصوتية لحمام مائي لتفكيك الخرز.
    5. بعد الصوتنة ، أضف 1 ميكرولتر من الخرز إلى 10 مل من محلول الاغاروز في أنبوب 15 مل وقم بدوامة الأنبوب جيدا لضمان تشتت موحد للخرز.
      ملاحظة: يعتمد حجم محلول الخرزة المراد إضافته إلى الاغاروز على محلول المخزون والشركة المصنعة. جرب مجموعة من الأحجام واختر تركيزا حيث تظهر الخرزات مشتتة جيدا عند تصويرها في نظام الألواح الخفيفة. يمكن أن يتجمع عدد كبير جدا من الخرز على الرغم من الصوتنة والدوامة ، في حين أن القليل جدا من الخرز يمكن أن يؤثر على تسجيل الصور.
    6. احتفظ بأنبوب الاغاروز مع الخرز المضاف في حمام مائي مغلق ، مع الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل تحضير العينة. هذا يضمن أن درجة حرارة الاغاروز تنخفض من 70 درجة مئوية إلى 37 درجة مئوية.
  3. تحضير العينة
    1. قم بإعداد الأسماك في أزواج مع فواصل في المساء قبل يوم التصوير. قم بإزالة الفواصل لمدة 15 دقيقة تقريبا واجمع الأجنة باستخدام الإجراء القياسي20.
    2. بمجرد أن تصل الأجنة إلى مرحلة الاهتمام لإعداد العينة ، اسكب 10 مل من الاغاروز بالكامل (مع الخرز) الذي يتم الاحتفاظ به عند 37 درجة مئوية في طبق بتري 6 سم.
    3. انتظر حوالي 2-3 دقائق لخفض درجة الحرارة عن 33 درجة مئوية قبل نقل 10 إلى 15 جنينا إلى محلول الاغاروز.
      ملاحظة: هذه خطوة مهمة لمنع أي صدمة حرارية محتملة للأجنة المنقولة إلى الاغاروز.
    4. تأكد من إضافة أقل قدر ممكن من المخزن المؤقت E3 إلى محلول الاغاروز أثناء نقل الأجنة. قم بتدوير طبق بتري حتى يتشتت المخزن المؤقت الصغير الذي كان سيتم نقله جيدا.
    5. ارتد القفازات لبقية إجراءات تحضير العينة.
    6. خذ ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر بطرف ماصة مناسب وأدخل أنبوبا مستقيما نظيفا مأخوذا من أنبوب الطرد المركزي الدقيق إلى طرف الماصة كما هو موضح في الشكل 1 أ ، ب.
    7. استنشق القليل من الاغاروز في الأنبوب ، متبوعا ب 2-3 أجنة باستخدام الماصة الدقيقة (الشكل 1C ، D). تأكد من أن الأجنة قريبة من قاع الأنبوب (الشكل 1E) ، والتي ستصبح مهمة أثناء إعداد التصوير. تأكد أيضا من وجود القليل من الاغاروز بين الأجنة المختلفة (الشكل 1E) بحيث يمكن استخدام الخرز في هذه المنطقة كعلامات تسجيل.
    8. دون تحرير الضغط من الماصة ، افصل الأنبوب عن طرف الماصة وضعه على غطاء طبق بتري المملوء ب E3 حتى يتصلب الاغاروز (الشكل 1F).
    9. كرر الخطوات من 1.3.6 إلى 1.3.8 حتى يتم نقل جميع الأجنة الموجودة في طبق بتري إلى الأنابيب.
    10. بمجرد أن يصلب الاغاروز (والذي يمكن أن يستغرق من 5 إلى 10 دقائق ويمكن تأكيده عن طريق فحص الاغاروز في طبق بتري) ، انقل الأنابيب إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل مملوء ب E3 (الشكل 1G).
    11. قم بتخزين الأنابيب مع الأجنة في حاضنة 28 درجة مئوية أو 33 درجة مئوية ، حسب الحاجة ، قبل الشروع في التصوير متعدد الرؤية.

2. التصوير متعدد المشاهدات

ملاحظة: تقدم هذه الخطوة إجراء عاما للتصوير متعدد الرؤى لأجنة أسماك الزرد في مراحل نموها المبكرة. يمكن تكييف الطريقة المفصلة أدناه بسهولة مع أي نظام مجهر متعدد الرؤية.

  1. تحديد موقع الجنين
    ملاحظة: املأ غرفة العينة في المجهر بوسط الجنين20 واضبط درجة حرارة غرفة العينة على درجة الحرارة محل الاهتمام قبل 10 دقائق على الأقل من التصوير.
    1. قم بتجميع حامل العينة كما هو موضح سابقا21 ، مع تعديل واحد. نظرا لأنه سيتم إجراء التصوير من خلال الأنبوب ، أدخل الأنبوب مع الأجنة مباشرة في الشعيرات الدموية ذات القطر الصحيح ، بحيث يتم تثبيتها في مكانها دون دفع الاغاروز للخارج وإزعاج الأجنة في الأسفل (الشكل 1H).
      ملاحظة: نظرا لأن حجرة العينة لها ارتفاع محدد ، فإن التأكد من أن الأجنة موجودة في أسفل الأنبوب أثناء تحضير العينة (كما هو مذكور في الخطوة 1.3.7) سيمكن من وضع الجنين في مجال الرؤية دون الاصطدام بأرضية الغرفة.
    2. أدخل حامل العينة في نظام العرض المتعدد واستخدم عناصر التحكم x و y لإحضار الجنين إلى مركز مجال الرؤية.
    3. استخدم عنصر التحكم z في ملاح العينة لتركيز الجنين.
    4. في هذه المرحلة ، سيكون اتجاه الجنين داخل المشيمة مرئيا بوضوح ، وإذا لم يكن مرضيا ، فأدخل أنبوبا جديدا واختر الجنين باتجاه الاهتمام.
  2. محاذاة أوراق الضوء
    1. بمجرد أن يصبح الجنين في موضعه ، قم بإعداد جميع الإعدادات التجريبية - الليزر ، ومسار الضوء ، والفلتر ، وفاصل الشعاع ، والكاميرا.
    2. أثناء إعداد معلمات الاكتساب ، إذا كان البرنامج يوفر خيارا للفحص المحوري ، فحدده. سيقلل الفحص المحوري من تأثير التظليل المنبثق من ورقة الضوء عندما يواجه أي هياكل أو مناطق غير شفافة في العينة.
    3. ابدأ المسح المباشر للعينة. قم بإعداد حجم البت وقوة الليزر والتكبير المطلوب ، والذي سيحدد سمك ورقة الضوء ، وبالتالي الدقة المحورية.
    4. لمحاذاة الألواح الضوئية ، قم أولا بالتبديل إلى الإضاءة أحادية الجانب وقم بتغيير إعدادات لوحي الضوء (اليسار واليمين) بالتتابع. قم بتكبير منطقة من العينة رقميا حيث تظهر هياكل واضحة ذات أهمية.
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام علامة نووية (H2A-mCherry) أو غشاء (Utr-GFP) لمحاذاة الأوراق. يوصى بتغيير إعدادات ورقة الضوء في البرنامج بحيث يتم تحقيق التباين الأكثر حدة للإشارة في المنطقة التي تهمك.
    5. بمجرد تحسين اللوحين الخفيفين بشكل فردي لتحقيق أفضل إشارة ، قم بتشغيل كلتا اللوحين الخفيفين. قم بإجراء جولة ثانية من المحاذاة وتأكد من أن الوميض ضئيل للغاية ، مما يشير إلى محاذاة جيدة إلى حد ما بين الورقتين.
    6. بمجرد الانتهاء من المحاذاة ، قم بتنشيط خيار دمج الصور التي تم إنشاؤها بواسطة الورقتين تلقائيا ، إذا سمح البرنامج بذلك. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء أولا محاذاة أوراق الضوء بشكل خشن من خلال التركيز على الخرز حول العينة ثم ضبط المحاذاة باستخدام معلومات من العينة.
      ملاحظة: أثناء التصوير باستخدام اثنين من الفلوروفورات (مثل العلامات النووية والغشائية) ، عادة ما تكون المحاذاة المثلى مختلفة بشكل هامشي بالنسبة للهيكلين. في هذا السيناريو، اختر إعدادا استنادا إلى القيود المفروضة على المعالجة من الخادم. على سبيل المثال ، إذا كان سيتم تقسيم حدود الخلية ، وهو أكثر كثافة معالجة نسبيا ، فقم بمحاذاة صفائح الضوء بناء على علامة الغشاء.
  3. إعداد التصوير متعدد الرؤوس
    1. بعد محاذاة الأوراق الضوئية ، قم بتنشيط خيارات إجراء مكدس z بالإضافة إلى التصوير متعدد المشاهدات.
    2. ابدأ المسح الضوئي المباشر وانتقل باستخدام متصفح العينة لتحديد العرض الأول. في طريقة العرض هذه، قم بإعداد الفاصل الزمني للشريحة، متبوعا بالشرائح الأولى والأخيرة من z-stack. أضف هذا الموضع في مربع الحوار متعدد المشاهدات، والذي يلاحظ معلومات الموضع والمكدس z لطريقة العرض هذه.
    3. انتقل إلى العرض التالي عن طريق تغيير الزاوية في متصفح العينة. قم بإعداد z-stack للعرض الثاني وأضف المعلومات في مربع الحوار multiview.
    4. كرر نفس الشيء لطرق العرض الإضافية.
      ملاحظة: تأكد من تصوير حد أدنى معين من الشرائح في كل طريقة عرض بحيث يكون هناك تداخل كاف بين طرق العرض المختلفة ، مما سيساعد في النهاية في تسجيل طرق العرض أثناء المعالجة. يعتمد الحد الأدنى لعدد الشرائح على عامل التكبير وكذلك على عدد الزوايا المختارة للتصوير.
    5. بعد تعيين جميع طرق العرض ، احفظ هذه المعلومات في ملف نصي (يسمى "مواضع الجنين" ، على سبيل المثال) ، والذي سيحتوي على معلومات z-stack ، وإحداثيات (x ، y ، z) للأنبوب بالإضافة إلى مواصفات الزاوية لكل عرض. بعد الحفظ ، قم بمسح جميع المواضع من مربع الحوار متعدد العرض.
    6. نظرا لأن التصوير يتم باستخدام مشيمة سليمة ، وهي كبيرة نسبيا ، فلا يمكن عرض الخرزات في الأنبوب بنفس الإعدادات. لذلك ، يجب الحصول على معلومات الخرزة من موضع مختلف في الأنبوب. للقيام بذلك ، قم بالترجمة إلى إحداثيات "y" مختلفة بعيدا عن الجنين حيث تكون الخرزات مرئية. أضف هذا الموضع إلى مربع الحوار متعدد المشاهدات واحفظ هذا الموضع في ملف نصي (يسمى "beads-y" ، على سبيل المثال).
      ملاحظة: قم بتصوير الخرزات بالقرب من عينة الجنين قدر الإمكان لتقليل آثار الاختلافات المحتملة في انحناء الأنبوب في الموضعين. لذلك ، إذا تم تركيب أجنة متعددة في الأنبوب ، فمن المهم ترك القليل من الاغاروز بين الأنابيب لتصوير الخرز (كما هو مذكور في الخطوة 1.3.7).
    7. انتقل إلى المجلد حيث يتم حفظ الملفات النصية وقم بتكرار ملف "مواضع الجنين" إلى ملف جديد باسم "مواضع الخرز". استبدل الإحداثي y لجميع طرق العرض في ملف "مواضع الخرز" بإحداثي y من ملف "beads-y". سيضمن ذلك تصوير الخرزات بنفس عدد المشاهدات ، و z-stacks ، و x-coordinates ولكن في موضع y مختلف في الأنبوب.
    8. ارجع إلى برنامج التصوير وقم بتحميل ملف "مواضع الخرزة" في البرنامج. إذا تم تنشيط خيار السلسلة الزمنية، فحدد دورة واحدة وابدأ التجربة. احفظ صور الخرزة ك "خرز" ، والتي سيتم استخدامها لتسجيل طرق العرض المختلفة أثناء معالجة الصور.
    9. بعد التقاط صور الخرزة ، امسح المواضع وقم بتحميل ملف "مواضع الجنين" الأولي في البرنامج. اضبط العدد المرغوب فيه من الدورات بفاصل زمني مناسب وابدأ التجربة.

3. تحليل الصور متعددة المشاهدات

ملاحظة: لدمج الصور متعددة المشاهدات ، يتم استخدام مكون FIJI الإضافي ، BigStitcher ، وهو أحدث إصدار من المكون الإضافي Multiview Reconstruction ،10،17،18. يمكن تثبيت المكون الإضافي عن طريق إضافة المكون الإضافي BigStitcher في وظيفة "إدارة مواقع التحديث" ، والتي يمكن الوصول إليها في خيار "تحديث" ضمن قائمة "المساعدة". بمجرد التثبيت ، سيظهر المكون الإضافي ضمن قائمة "الإضافات". الخطوات الواسعة التي ينطوي عليها الاندماج هي كما يلي: (1) تحديد أزواج ملفات .xml / .h5 لكل من الخرز والأجنة ؛ (2) تسجيل جميع المشاهدات في ملف الخرزات ؛ (3) وظيفة انتشار نقطة الاستخراج (PSF) للخرز ، والتي يمكن استخدامها لفك الالتواء (الشكل 2 أ) ؛ (4) نقل معلومات التسجيل و PSF من ملف الخرز إلى ملف الجنين والبدء في تفكيك الالتفاف متعدد المشاهدات. تم وصف معظم هذه الخطوات سابقا بالتفصيل21 ، وهنا ، يتم وصف الخطوات التي تتم معالجتها بشكل مختلف.

  1. تعريف مجموعة بيانات .xml
    1. حدد مجموعة بيانات جديدة لكل من الخرزات والجنين على أنها "beads.xml" و "embryo.xml" ، على التوالي ، كما هو موضح سابقا21.
  2. الكشف والتسجيل باستخدام نقاط الاهتمام
    1. بعد التصدير الناجح لملف beads.xml، حدد طرق العرض المطلوبة للتسجيل في مربع الحوار "مستكشف طرق العرض المتعدد" (الشكل 2 ب). انقر بزر الماوس الأيمن واختر اكتشاف نقاط الاهتمام. تابع الخطوات كما هو موضح21.
    2. بعد اكتشاف نقاط الاهتمام، حدد جميع طرق العرض، وانقر بزر الماوس الأيمن، واختر تسجيل باستخدام نقاط الاهتمام. اتبع البروتوكول كما هو موضح21.
    3. تحقق بعناية مما إذا كان تسجيل الخرزة قد نجح بنجاح. عند التسجيل الناجح ، يتم تثبيت الخرزات المتداخلة من وجهات نظر مختلفة (الشكل 2 ج). للتحقق من مدى دقة عمل التسجيل ، حدد طريقتين متتاليتين ، وانتقل إلى المنطقة المتداخلة ، وقم بالتبديل بين الطريقتين لملاحظة ما إذا كانت الخرزات المصورة من زوايا مختلفة متراكبة. كرر هذا لكل طريقة عرض متتالية.
    4. إذا لم يكن التداخل دقيقا ، فأعد محاولة التسجيل عن طريق تخفيف الأهمية المطلوبة للتسجيل و / أو الخطأ المقبول للتداخل (يسمى "خطأ RANSAC" في مربع الحوار "التسجيل").
    5. بعد التسجيل الناجح ، انقر فوق حفظ في نافذة "Multiview Explorer" لحفظ ملف .xml المحدث.
      ملاحظة: احفظ ملف السجل أيضا، لأنه يحتوي على مزيد من المعلومات التفصيلية حول كفاءة التسجيل. لترجمة معلومات التسجيل من الخرز إلى الجنين ، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
    6. افتح ملف bead.xml في محرر نصوص من اختيارك وانسخ المكون بأكمله ضمن "ViewRegistrations".
    7. افتح embryo.xml واستبدل كتلة "ViewRegistrations" بالكتلة المنسوخة من ملف الخرز. إذا كانت هناك قنوات متعددة، فاستبدل معلومات التسجيل لكل قناة على النحو الوارد أعلاه. يمكن نقل معلومات التسجيل إما يدويا أو باستخدام كود MATLAB المكتوب خصيصا والذي يمكن تنزيله من هنا: https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
    8. افتح ملف embryo.xml في "BigStitcher" وتحقق بعناية مما إذا كان التسجيل قد نجح مع الجنين. كرر نفس الشيء كما هو الحال مع الخرزات ، عن طريق التحقق من تداخل الهياكل ذات الأهمية في كل عرضين متتاليين.
      ملاحظة: في بعض الأحيان ، قد لا يكون تسجيل الأجنة مرغوبا فيه على الرغم من تسجيل الخرزات بشكل مثالي. هذا ممكن إذا كانت هناك تغييرات طفيفة في انحناء الأنبوب من الموضع الذي يتم فيه تصوير الخرزات إلى موضع الجنين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون هناك حركات خفية للجنين بين وجهات النظر لأنه يطفو بحرية داخل المشيمة. في هذه الحالة ، قم بإجراء جولة ثانية من التسجيل باستخدام علامة نووية في الجنين.
    9. للقيام بذلك ، افتح ملف embryo.xml في "BigStitcher" ، وانقر بزر الماوس الأيمن على جميع طرق العرض التي تحتوي على العلامة النووية ، واختر اكتشاف نقاط الاهتمام.
    10. أعد تسمية نقاط الاهتمام باسم "النوى" وتابع الخطوات التي يتم إجراؤها للخرز.
    11. أثناء تعيين معلمات "اختلاف الغاوسية" ، تأكد من اكتشاف معظم النوى ، إن لم يكن كلها ، وعدم وجود اكتشاف نووي خارج الرحم. بعد ذلك ، انقر فوق تم.
    12. بعد ذلك ، قم بتسجيل وجهات النظر هذه عن طريق اختيار التسجيل باستخدام نقاط الاهتمام واختيار الخيار المستند إلى الواصف الدقيق (الترجمة الثابتة). تأكد من تحديد خيار "مقارنة جميع طرق العرض ونقاط الاهتمام" واستخدم "النوى" كنقاط اهتمام. استخدم خيار إصلاح العرض الأول ولا تقم بالتعيين مرة أخرى.
    13. للتسجيل ، استخدم نموذج affine مع تنظيم صارم والمعلمات الافتراضية في المكون الإضافي.
    14. أعد التحقق من نجاح التسجيل من خلال مقارنة كل عرضين متتاليين.
    15. بعد التسجيل الناجح ، انقر فوق حفظ في نافذة "Multiview Explorer" لحفظ ملف .xml المحدث.
    16. افتح الملف embryo.xml في محرر نصوص من اختيارك وانسخ معلومات التسجيل من العلامات النووية إلى القنوات الأخرى.
  3. استخراج دالة انتشار النقاط وتعيينها
    1. لإجراء تفكيك الالتفاف متعدد الرؤية، استخرج PSF لنظام التصوير من مجموعة بيانات الخرز المسجلة وقم بتطبيقه على ملف الجنين.
    2. للحصول على هذه المعلومات ، حدد جميع طرق العرض في ملف الخرزة ثم انقر بزر الماوس الأيمن واختر وظائف انتشار النقطة وخيارات الاستخراج .
    3. في مربع الحوار الذي يظهر، تأكد من تحديد استخدام نقاط الاهتمام المقابلة وإزالة إسقاطات الحد الأدنى للكثافة من PSF ، وتابع أحجام PSF الافتراضية، وانقر فوق موافق.
      ملاحظة: إذا نجح استخراج PSF لجميع طرق العرض ، فسيعرض ملف السجل "Excludeded n / n PSFs"
    4. بعد ذلك ، أعد حفظ ملف .xml. سيظهر مربع اختيار محدد في عمود PSF في مربع الحوار "Multiview Explorer" ، وسيتم إنشاء مجلد "psf" في المجلد المعني مع جميع PSFs المستخرجة.
    5. افتح ملف embryo.xml وقم بتعيين PSF لكل طريقة عرض على حدة. انقر بزر الماوس الأيمن فوق "طريقة عرض" → انقر فوق Point Spread Functions → اختر تعيين → حدد خيارات متقدمة ، متبوعا بتعيين PSF جديد لجميع طرق العرض المحددة. انقر فوق تصفح ، وانتقل إلى مسار ملف .xml ، وافتح مجلد psf .
    6. اختر PSF المطابق مع المعرف المقابل في العرض المحدد وانقر فوق موافق ، وبعد ذلك سيظهر مربع اختيار PSF محددا في نافذة "Multiview Explorer".
    7. كرر العملية لجميع طرق العرض الأخرى.
  4. الانصهار متعدد المشاهدات وفك الالتفاف
    1. بعد تعيين وظيفة انتشار النقاط لجميع طرق العرض ، انقر بزر الماوس الأيمن واختر Multiview Deconvolution.
    2. حدد المربع المحيط كطرق عرض محددة حاليا. بالنسبة لهذا العمل، يعمل تسريع OSEM الافتراضي وعدد التكرارات بشكل جيد.
    3. قم بتقليل عينات الصور كما هو مطلوب إذا كان الحساب الأسرع مطلوبا أو إذا كانت ذاكرة وحدة المعالجة المركزية محدودة.
      ملاحظة: إذا تجاوزت ذاكرة الوصول العشوائي المطلوبة الذاكرة الموجودة، فستظهر رسالة خطأ تحذير باللون الأحمر في أسفل النافذة. لا تبدأ الالتفاف إذا ظهر هذا التحذير ، حيث سيتوقف المكون الإضافي ويتوقف عن الاستجابة في مرحلة ما أثناء المعالجة.
    4. لتقييم تقدم التفكيك ، تحقق من ملف السجل ، والذي سيعرض النتائج كل 5 تكرارات.
    5. لزيادة السرعة الحسابية ، قم بإجراء فك الالتفاف متعدد الرؤية في وحدة معالجة الرسومات إذا تم تثبيته مسبقا.
      ملاحظة: في نهاية هذه العملية ، ستظهر نافذة صورة مدمجة ، والتي يمكن حفظها كملف tiff.

النتائج

يعد توجيه العينة بطريقة دقيقة جزءا حيويا من الاستخدام الفعال لإعداد الفحص المجهري. ومع ذلك ، غالبا ما يكون توجيه العينات يدويا غير ممكن عند استخدام نظام ورقة ضوئية متعددة الرؤوس ، نظرا لمتطلبات تحضير العينات في أنبوب. لذلك ، للتحقق مما إذا كانت هناك أوضاع نمطية تتخذها ال...

Discussion

يعد وضع الجنين في الاتجاه الصحيح لتصوير منطقة الاهتمام أحد خطوات تحديد المعدل التي غالبا ما تؤدي إلى فشل جلسة الفحص المجهري للمستخدم. هذا أكثر من ذلك في مجهر الألواح الضوئية متعدد الرؤوس حيث يكون التلاعب اليدوي بالاتجاه صعبا حيث يتم تضمين العينات داخل أنبوب. للمساعدة في...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

نعرب عن تقديرنا للدكتور كاليداس كوهالي وفريقه لصيانة منشأة الأسماك و KV Boby لصيانة مجهر الألواح الضوئية. تعترف SRN بالدعم المالي المقدم من وزارة الطاقة الذرية (DAE) ، حكومة الهند (رقم تعريف المشروع. RTI4003 ، DAE OM رقم 1303/2/2019 / R\&D-II / DAE / 2079 بتاريخ 11.02.2020) ، برنامج مجموعة شركاء جمعية ماكس بلانك (M.PG. A MOZG0010) ومنحة أبحاث بدء التشغيل لمجلس أبحاث العلوم والهندسية (SRG / 2023 / 001716).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose, low gelling temperatureSigma-AldrichA9414
Calcium Chloride dihydrateSigma-Aldrich12022
FIJIVersion: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspensionSigma-AldrichL3280
Magnesium sulfate heptahydrateSigma-AldrichM2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kitThermoFischer ScientificAM1340For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium ChhlorideSigma-AldrichP9541
Potassium phosphate monobasicSigma-AldrichP0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05 Adtech Innovations in FluoroplasticsSTW15PTFE tubes
Sodium ChlorideSigma-AldrichS3014
Sodium phosphate dibasicSigma-Aldrich71640
Ultrasonic CleanerLabmanLMUC3Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 SystemZeiss

References

  1. Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
  2. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  3. Keller, P. J., et al. high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
  4. Keller, P. J. Imaging morphogenesis: Technological advances and biological insights. Science. 340 (6137), 1234168 (2013).
  5. Schmid, B., et al. High-speed panoramic Light sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4 (1), 2207 (2013).
  6. Strnad, P., et al. Inverted Light sheet microscope for imaging mouse pre-implantation development. Nat Methods. 13 (2), 139-142 (2016).
  7. McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
  8. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  9. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview Light sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat Methods. 9 (7), 730-733 (2012).
  10. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat Methods. 7 (6), 418-419 (2010).
  11. Swoger, J., Verveer, P., Greger, K., Huisken, J., Stelzer, E. H. K. Multiview image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
  12. Swoger, J., Huisken, J., Stelzer, E. H. Multiple imaging axis microscopy improves resolution for thick-sample applications. Opt Lett. 28 (18), 1654-1656 (2003).
  13. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  14. Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish. J Vis Exp. (84), e51119 (2014).
  15. Naganathan, S. R., Popović, M., Oates, A. C. Left-right symmetry of zebrafish embryos requires somite surface tension. Nature. 605 (7910), 516-521 (2022).
  16. Shah, G., et al. Multi-scale imaging and analysis identify pan-embryo cell dynamics of germlayer formation in zebrafish. Nat Commun. 10 (1), 5753 (2019).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Hörl, D., et al. BigStitcher: Reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16 (9), 870-874 (2019).
  19. Behrndt, M., et al. Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation. Science. 338 (6104), 257-260 (2012).
  20. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
  21. Icha, J., et al. Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development. J Vis Exp. (110), e53966 (2016).
  22. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview Light sheet microscopy. Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).
  23. Aigouy, B., Prud'homme, B. Segmentation and quantitative analysis of epithelial tissues. Methods Mol Biol. 2540, 387-399 (2022).
  24. Mancini, L., et al. Apical size and deltaA expression predict adult neural stem cell decisions along lineage progression. Science Adv. 9, 7519 (2023).
  25. Piscitello-Gomez, R., Mahmoud, A., Dye, N., Eaton, S. Sensitivity of the timing of Drosophila pupal wing morphogenesis to external perturbations. bioRxiv. , (2023).
  26. Tsuboi, A., Fujimoto, K., Kondo, T. Spatiotemporal remodeling of extracellular matrix orients epithelial sheet folding. Science Adv. 9, 2154 (2023).
  27. Fu, Q., Martin, B. L., Matus, D. Q., Gao, L. Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling Light sheet selective plane illumination microscopy. Nat Commun. 7 (1), 11088 (2016).
  28. Chen, B. C., et al. Lattice Light sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
  29. York, H. M., et al. Deterministic early endosomal maturations emerge from a stochastic trigger-and-convert mechanism. Nat Commun. 14 (1), 4652 (2023).
  30. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  31. Melançon, E., Liu, D. W. C., Westerfield, M., Eisen, J. S. Pathfinding by identified zebrafish motoneurons in the absence of muscle pioneers. J Neurosci. 17 (20), 7796 (1997).
  32. Rohde, L. A., et al. Cell-autonomous timing drives the vertebrate segmentation clock's wave pattern. eLife. , (2024).
  33. Haynes, E. M., et al. KLC4 shapes axon arbors during development and mediates adult behavior. eLife. 11, e74270 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved