التصوير المجهري للورقة الضوئية واستراتيجيات التركيب لأجنة أسماك الزرد المبكرة

Summary

تم وصف استراتيجية تحضير العينة لتصوير أجنة الزرد المبكرة داخل مشيمة سليمة باستخدام مجهر صفائح ضوئي. يحلل الاتجاهات المختلفة التي تكتسبها الأجنة داخل المشيمة في مراحل 70٪ من المشيمة والبراعم ويفصل استراتيجيات التصوير للحصول على دقة على نطاق خلوي في جميع أنحاء الجنين باستخدام نظام الورقة الضوئية.

Abstract

أصبح الفحص المجهري للصفائح الضوئية هو المنهجية المفضلة للتصوير الحي لأجنة أسماك الزرد على نطاقات زمنية طويلة مع الحد الأدنى من السمية الضوئية. على وجه الخصوص ، يتيح نظام الرؤية المتعددة ، الذي يسمح بتدوير العينة ، تصوير أجنة كاملة من زوايا مختلفة. ومع ذلك ، في معظم جلسات التصوير باستخدام نظام متعدد الرؤية ، يعد تركيب العينة عملية مزعجة حيث يتم تحضير العينات عادة في أنبوب بوليمر. للمساعدة في هذه العملية ، يصف هذا البروتوكول استراتيجيات التركيب الأساسية لتصوير التطور المبكر لأسماك الزرد بين 70٪ من مراحل الجسيدات المبكرة. على وجه التحديد ، توفر الدراسة إحصائيات عن المواضع المختلفة التي تتخلف عنها الأجنة في مراحل epiboly والبراعم بنسبة 70٪ داخل المشيمة. علاوة على ذلك ، فإنه يناقش العدد الأمثل للزوايا والفاصل الزمني بين الزوايا المطلوبة لتصوير أجنة أسماك الزرد الكاملة في المراحل المبكرة من التطور بحيث يمكن استخراج المعلومات على نطاق خلوي عن طريق دمج وجهات النظر المختلفة. أخيرا ، نظرا لأن الجنين يغطي مجال رؤية الكاميرا بالكامل ، وهو أمر مطلوب للحصول على دقة على نطاق خلوي ، فإن هذا البروتوكول يوضح بالتفصيل عملية استخدام معلومات الخرزة من أعلى أو أسفل الجنين لتسجيل وجهات النظر المختلفة.

Introduction

يعد ضمان الحد الأدنى من السمية الضوئية مطلبا رئيسيا لتصوير الأجنة الحية ذات الدقة الزمانية المكانية العالية لفترات طويلة. على مدى العقد الماضي ، أصبح الفحص المجهري للورقة الضوئية هو المنهجية المفضلة لتلبية هذا المطلب^{1،2،3،4،5،6،7}. باختصار ، في هذه التقنية التي تم استخدامها لأول مرة في عام 2004 لالتقاط العمليات التنموية⁸ ، تمر لوحان رفيعان محاذيان من الليزر عبر الجنين من نهايات متعا....

Protocol

تمت الموافقة على صيانة أسماك الزرد والإجراءات التجريبية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لأخلاقيات ، عبر المرجع TIFR / IAEC / 2023-1 و TIFR / IAEC / 2023-5. تم حقن الأجنة التي تم الحصول عليها عن طريق تهجين الأسماك متغايرة الزيجوت التي تعبر عن Tg (actb2: GFP-Hsa.UTRN) ¹⁹ ب H2A-mCherry mRNA (30 pg) في مرحلة الخلية الواحدة. H2A-mCherry تم تصنيع mRNA باستخدام pCS2 + H2A-mCherry البلازميد (هدية من مختبر Oates ، EPFL) عن طريق النسخ في المختبر. تم تصوير الأجنة التي تعبر عن كلتا العلامتين ، المشار إليها باسم Utr-GFP و H2A-mCherry ، على التوالي ، في بقية البروتوكول ، في مرحلتي 70٪ من epi....

النتائج

يعد توجيه العينة بطريقة دقيقة جزءا حيويا من الاستخدام الفعال لإعداد الفحص المجهري. ومع ذلك ، غالبا ما يكون توجيه العينات يدويا غير ممكن عند استخدام نظام ورقة ضوئية متعددة الرؤوس ، نظرا لمتطلبات تحضير العينات في أنبوب. لذلك ، للتحقق مما إذا كانت هناك أوضاع نمطية تتخذها ال.......

Discussion

يعد وضع الجنين في الاتجاه الصحيح لتصوير منطقة الاهتمام أحد خطوات تحديد المعدل التي غالبا ما تؤدي إلى فشل جلسة الفحص المجهري للمستخدم. هذا أكثر من ذلك في مجهر الألواح الضوئية متعدد الرؤوس حيث يكون التلاعب اليدوي بالاتجاه صعبا حيث يتم تضمين العينات داخل أنبوب. للمساعدة في.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Calcium Chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Version: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspension	Sigma-Aldrich	L3280
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	ThermoFischer Scientific	AM1340	For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05	Adtech Innovations in Fluoroplastics	STW15	PTFE tubes
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640
Ultrasonic Cleaner	Labman	LMUC3	Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 System	Zeiss