A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم وصف استراتيجية تحضير العينة لتصوير أجنة الزرد المبكرة داخل مشيمة سليمة باستخدام مجهر صفائح ضوئي. يحلل الاتجاهات المختلفة التي تكتسبها الأجنة داخل المشيمة في مراحل 70٪ من المشيمة والبراعم ويفصل استراتيجيات التصوير للحصول على دقة على نطاق خلوي في جميع أنحاء الجنين باستخدام نظام الورقة الضوئية.

Abstract

أصبح الفحص المجهري للصفائح الضوئية هو المنهجية المفضلة للتصوير الحي لأجنة أسماك الزرد على نطاقات زمنية طويلة مع الحد الأدنى من السمية الضوئية. على وجه الخصوص ، يتيح نظام الرؤية المتعددة ، الذي يسمح بتدوير العينة ، تصوير أجنة كاملة من زوايا مختلفة. ومع ذلك ، في معظم جلسات التصوير باستخدام نظام متعدد الرؤية ، يعد تركيب العينة عملية مزعجة حيث يتم تحضير العينات عادة في أنبوب بوليمر. للمساعدة في هذه العملية ، يصف هذا البروتوكول استراتيجيات التركيب الأساسية لتصوير التطور المبكر لأسماك الزرد بين 70٪ من مراحل الجسيدات المبكرة. على وجه التحديد ، توفر الدراسة إحصائيات عن المواضع المختلفة التي تتخلف عنها الأجنة في مراحل epiboly والبراعم بنسبة 70٪ داخل المشيمة. علاوة على ذلك ، فإنه يناقش العدد الأمثل للزوايا والفاصل الزمني بين الزوايا المطلوبة لتصوير أجنة أسماك الزرد الكاملة في المراحل المبكرة من التطور بحيث يمكن استخراج المعلومات على نطاق خلوي عن طريق دمج وجهات النظر المختلفة. أخيرا ، نظرا لأن الجنين يغطي مجال رؤية الكاميرا بالكامل ، وهو أمر مطلوب للحصول على دقة على نطاق خلوي ، فإن هذا البروتوكول يوضح بالتفصيل عملية استخدام معلومات الخرزة من أعلى أو أسفل الجنين لتسجيل وجهات النظر المختلفة.

Introduction

يعد ضمان الحد الأدنى من السمية الضوئية مطلبا رئيسيا لتصوير الأجنة الحية ذات الدقة الزمانية المكانية العالية لفترات طويلة. على مدى العقد الماضي ، أصبح الفحص المجهري للورقة الضوئية هو المنهجية المفضلة لتلبية هذا المطلب1،2،3،4،5،6،7. باختصار ، في هذه التقنية التي تم استخدامها لأول مرة في عام 2004 لالتقاط العمليات التنموية8 ، تمر لوحان رفيعان محاذيان من الليزر عبر الجنين من نهايات متعا....

Protocol

تمت الموافقة على صيانة أسماك الزرد والإجراءات التجريبية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لأخلاقيات ، عبر المرجع TIFR / IAEC / 2023-1 و TIFR / IAEC / 2023-5. تم حقن الأجنة التي تم الحصول عليها عن طريق تهجين الأسماك متغايرة الزيجوت التي تعبر عن Tg (actb2: GFP-Hsa.UTRN) 19 ب H2A-mCherry mRNA (30 pg) في مرحلة الخلية الواحدة. H2A-mCherry تم تصنيع mRNA باستخدام pCS2 + H2A-mCherry البلازميد (هدية من مختبر Oates ، EPFL) عن طريق النسخ في المختبر. تم تصوير الأجنة التي تعبر عن كلتا العلامتين ، المشار إليها باسم Utr-GFP و H2A-mCherry ، على التوالي ، في بقية البروتوكول ، في مرحلتي 70٪ من epi....

النتائج

يعد توجيه العينة بطريقة دقيقة جزءا حيويا من الاستخدام الفعال لإعداد الفحص المجهري. ومع ذلك ، غالبا ما يكون توجيه العينات يدويا غير ممكن عند استخدام نظام ورقة ضوئية متعددة الرؤوس ، نظرا لمتطلبات تحضير العينات في أنبوب. لذلك ، للتحقق مما إذا كانت هناك أوضاع نمطية تتخذها ال.......

Discussion

يعد وضع الجنين في الاتجاه الصحيح لتصوير منطقة الاهتمام أحد خطوات تحديد المعدل التي غالبا ما تؤدي إلى فشل جلسة الفحص المجهري للمستخدم. هذا أكثر من ذلك في مجهر الألواح الضوئية متعدد الرؤوس حيث يكون التلاعب اليدوي بالاتجاه صعبا حيث يتم تضمين العينات داخل أنبوب. للمساعدة في.......

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

نعرب عن تقديرنا للدكتور كاليداس كوهالي وفريقه لصيانة منشأة الأسماك و KV Boby لصيانة مجهر الألواح الضوئية. تعترف SRN بالدعم المالي المقدم من وزارة الطاقة الذرية (DAE) ، حكومة الهند (رقم تعريف المشروع. RTI4003 ، DAE OM رقم 1303/2/2019 / R\&D-II / DAE / 2079 بتاريخ 11.02.2020) ، برنامج مجموعة شركاء جمعية ماكس بلانك (M.PG. A MOZG0010) ومنحة أبحاث بدء التشغيل لمجلس أبحاث العلوم والهندسية (SRG / 2023 / 001716).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose, low gelling temperatureSigma-AldrichA9414
Calcium Chloride dihydrateSigma-Aldrich12022
FIJIVersion: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspensionSigma-AldrichL3280
Magnesium sulfate heptahydrateSigma-AldrichM2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kitThermoFischer ScientificAM1340For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium ChhlorideSigma-AldrichP9541
Potassium phosphate monobasicSigma-AldrichP0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05 Adtech Innovations in FluoroplasticsSTW15PTFE tubes
Sodium ChlorideSigma-AldrichS3014
Sodium phosphate dibasicSigma-Aldrich71640
Ultrasonic CleanerLabmanLMUC3Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 SystemZeiss

References

  1. Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
  2. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved