Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Riepilogo

Viene descritta una strategia di preparazione del campione per l'imaging di embrioni precoci di zebrafish all'interno di un corion intatto utilizzando un microscopio a foglio luminoso. Analizza i diversi orientamenti che gli embrioni acquisiscono all'interno del corion al 70% degli stadi di epibolia e gemma e descrive in dettaglio le strategie di imaging per ottenere una risoluzione su scala cellulare in tutto l'embrione utilizzando il sistema light-sheet.

Abstract

La microscopia a foglio ottico è diventata la metodologia di scelta per l'imaging dal vivo di embrioni di zebrafish su lunghe scale temporali con fototossicità minima. In particolare, un sistema multiview, che consente la rotazione del campione, consente l'imaging di interi embrioni da diverse angolazioni. Tuttavia, nella maggior parte delle sessioni di imaging con un sistema multiview, il montaggio dei campioni è un processo problematico poiché i campioni vengono solitamente preparati in una provetta polimerica. Per aiutare in questo processo, questo protocollo descrive le strategie di montaggio di base per l'imaging dello sviluppo precoce del pesce zebra tra il 70% degli stadi epibolici e quelli iniziali del somite. In particolare, lo studio fornisce statistiche sulle varie posizioni in cui gli embrioni si trovano di default al 70% degli stadi di epibolia e gemma all'interno del corion. Inoltre, discute il numero ottimale di angoli e l'intervallo tra gli angoli necessari per l'imaging di embrioni interi di zebrafish nelle prime fasi di sviluppo, in modo che le informazioni su scala cellulare possano essere estratte fondendo le diverse visualizzazioni. Infine, poiché l'embrione copre l'intero campo visivo della telecamera, necessario per ottenere una risoluzione su scala cellulare, questo protocollo descrive in dettaglio il processo di utilizzo delle informazioni della perlina dall'alto o dal basso dell'embrione per la registrazione delle diverse visualizzazioni.

Introduzione

Garantire una fototossicità minima è un requisito importante per l'imaging di embrioni vivi con un'elevata risoluzione spazio-temporale per lunghi periodi. Nell'ultimo decennio, la microscopia a foglio ottico è diventata la metodologia preferita per soddisfare questo requisito 1,2,3,4,5,6,7. In breve, in questa tecnica che è stata utilizzata per la prima volta nel 2004 per catturare i processi di sviluppo....

Protocollo

Le procedure di mantenimento e sperimentazione del pesce zebra utilizzate in questo studio sono state approvate dal comitato istituzionale per l'etica degli animali, vedi riferimento TIFR/IAEC/2023-1 e TIFR/IAEC/2023-5. Gli embrioni ottenuti incrociando pesci eterozigoti che esprimono Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)¹⁹ sono stati iniettati con l'mRNA di H2A-mCherry (30 pg) allo stadio di una cellula. L'mRNA di H2A-mCherry è stato sintetizzato utilizzando il plasmide pCS2+ H2A-mCherry (un dono del laboratorio Oates, EPFL) mediante trascrizione in vitro . Gli embrioni che esprimono entrambi i marcatori, d....

Discussione

Posizionare un embrione con il giusto orientamento per visualizzare la regione di interesse è uno dei passaggi limitanti che spesso si traduce in una sessione di microscopia fallita per un utente. Questo è ancora più vero in un microscopio a foglio ottico multivista, dove la manipolazione manuale dell'orientamento è difficile poiché i campioni sono incorporati all'interno di un tubo. Per aiutare in questo processo, questo studio riporta le statistiche di varie posizioni in cui un em.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Calcium Chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Version: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspension	Sigma-Aldrich	L3280
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	ThermoFischer Scientific	AM1340	For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05	Adtech Innovations in Fluoroplastics	STW15	PTFE tubes
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640
Ultrasonic Cleaner	Labman	LMUC3	Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 System	Zeiss