早期斑马鱼胚胎的光片显微镜成像和安装策略

摘要

描述了使用光片显微镜对完整绒毛膜内的早期斑马鱼胚胎进行成像的样品制备策略。它分析了胚胎在 70% 的外生和芽期在绒毛膜内获得的不同方向，并详细介绍了使用光片系统在整个胚胎中获得细胞尺度分辨率的成像策略。

摘要

光片显微镜已成为斑马鱼胚胎长时间实时成像的首选方法，光毒性最小。特别是，允许样品旋转的多视图系统能够从不同角度对整个胚胎进行成像。然而，在大多数使用多视图系统的成像过程中，样品安装是一个麻烦的过程，因为样品通常在聚合物管中制备。为了帮助这个过程，该协议描述了在 70% 表观和早期体节阶段之间对早期斑马鱼发育进行成像的基本安装策略。具体来说，该研究提供了胚胎在绒毛膜内 70% 的外胚期和芽期默认处于各种位置的统计数据。此外，它还讨论了在发育早期对整个斑马鱼胚胎进行成像所需的最佳角度数和角度间隔，以便通过融合不同的视图来提取细胞尺度的信息。最后，由于胚胎覆盖了相机的整个视野，这是获得细胞级分辨率所必需的，因此该协议详细说明了使用来自胚胎上方或下方的珠子信息来记录不同视图的过程。

引言

确保最小的光毒性是长期对高时空分辨率的活胚胎进行成像的主要要求。在过去的十年中，光片显微镜已成为满足这一要求的首选方法 1,2,3,4,5,6,7。简而言之，在这项于 2004 年首次用于捕捉发育过程⁸ 的技术中，两片对齐的激光从相对的两端穿过胚胎，仅照亮感兴趣的平面。将检测物镜正交放置，然后同时收集样品中所有照射点发射的荧光。然后通过按顺序将胚胎穿过静态光片来获得 3D 图像。

此外，在这种方法的一种特定形式中，称为多视图光片显微镜，样品可以悬浮在聚合物管中，该聚合物管可以使用转子旋转，从而能够从多个角度对同一胚胎进行成像 ^9,10,11

研究方案

本研究中使用的斑马鱼维护和实验程序已获得机构动物伦理委员会的批准，参考文献 TIFR/IAEC/2023-1 和 TIFR/IAEC/2023-5。在单细胞阶段，通过杂交表达 Tg （actb2：GFP-Hsa.UTRN） ¹⁹ 的杂合鱼获得的胚胎注射 H2A-mCherry mRNA （30 pg）。使用 pCS2+ H2A-mCherry 质粒（来自 Oates 实验室的礼物，EPFL）通过体外转录合成 H2A-mCherry mRNA。表达这两种标记物的胚胎，分别称为 Utr-GFP 和 H2A-mCherry，在方案的其余部分，在 70% 的外生和芽期进行成像。材料表中列出了研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 用于多视图成像的样品制备

1. FEP/PTFE 管的制备
   1. 按照前面描述的程序清洁 FEP/PTFE 管¹⁴.
   2. 清洁后，根据需要将试管切成 2-2.5 cm 的长度，并将它们储存在含有双蒸水的 2 mL 微量离心管中。试管可以以这种方式储存约一个月。
   3. 在样品制备之前，将试管在 70-75 °C 下加热约 25 分钟以拉直试....

讨论

将胚胎定位在正确的方向以对感兴趣区域进行成像是速率限制步骤之一，通常会导致用户的显微镜检查失败。在多视图光片显微镜中更是如此，因为样品嵌入管中，因此很难手动操作方向。为了帮助这一过程，本研究报告了斑马鱼胚胎在绒毛膜内占据 70% 的表外和早期体节阶段的各种位置的统计数据，当带有胚胎的聚合物管在微量离心管中保持直立时。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Calcium Chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Version: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspension	Sigma-Aldrich	L3280
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	ThermoFischer Scientific	AM1340	For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05	Adtech Innovations in Fluoroplastics	STW15	PTFE tubes
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640
Ultrasonic Cleaner	Labman	LMUC3	Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 System	Zeiss