Stratégies d’imagerie et de montage par microscopie à feuillet de lumière pour les embryons précoces de poisson-zèbre

Résumé

Une stratégie de préparation d’échantillons pour l’imagerie d’embryons précoces de poisson-zèbre dans un chorion intact à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière est décrite. Il analyse les différentes orientations que les embryons acquièrent à l’intérieur du chorion aux stades épibolique et bourgeonnaire à 70 % et détaille les stratégies d’imagerie pour obtenir une résolution à l’échelle cellulaire dans tout l’embryon à l’aide du système de feuillet lumineux.

Résumé

La microscopie à feuillet de lumière est devenue la méthodologie de choix pour l’imagerie en direct d’embryons de poisson-zèbre sur de longues échelles de temps avec une phototoxicité minimale. En particulier, un système multiview, qui permet la rotation des échantillons, permet d’imager des embryons entiers sous différents angles. Cependant, dans la plupart des séances d’imagerie avec un système multivue, le montage des échantillons est un processus fastidieux car les échantillons sont généralement préparés dans un tube en polymère. Pour faciliter ce processus, ce protocole décrit les stratégies de montage de base pour l’imagerie du développement précoce du poisson-zèbre entre les stades épibolique de 70 % et les premiers stades somite. Plus précisément, l’étude fournit des statistiques sur les différentes positions par défaut des embryons aux stades de 70 % de l’épibolie et du bourgeon dans le chorion. De plus, il traite du nombre optimal d’angles et de l’intervalle entre les angles requis pour imager des embryons entiers de poisson-zèbre aux premiers stades du développement afin que des informations à l’échelle cellulaire puissent être extraites en fusionnant les différentes vues. Enfin, étant donné que l’embryon couvre tout le champ de vision de la caméra, ce qui est nécessaire pour obtenir une résolution à l’échelle cellulaire, ce protocole détaille le processus d’utilisation des informations de billes situées au-dessus ou en dessous de l’embryon pour l’enregistrement des différentes vues.

Introduction

Garantir une phototoxicité minimale est une exigence majeure pour l’imagerie d’embryons vivants avec une résolution spatio-temporelle élevée pendant de longues périodes. Au cours de la dernière décennie, la microscopie à feuillet de lumière est devenue la méthodologie de choix pour répondre à cette exigence 1,2,3,4,5,6,7. Brièvement, dans cette technique qui a été utilisée pour la première fois en 2004 po....

Protocole

Les procédures d’entretien et expérimentales du poisson-zèbre utilisées dans cette étude ont été approuvées par le comité d’éthique animale de l’établissement, voir les références TIFR/IAEC/2023-1 et TIFR/IAEC/2023-5. Des embryons obtenus par croisement de poissons hétérozygotes exprimant Tg(actb2 :GFP-Hsa.UTRN)¹⁹ ont été injectés avec l’ARNm H2A-mCherry (30 pg) au stade unicellulaire. L’ARNm H2A-mCherry a été synthétisé à l’aide du plasmide pCS2+ H2A-mCherry (un don du laboratoire Oates, EPFL) par transcription in vitro . Les embryons exprimant les deux marqueurs, appelés respectivement Utr-G....

Discussion

Le positionnement d’un embryon dans la bonne orientation pour imager la région d’intérêt est l’une des étapes limitant le débit qui entraîne souvent l’échec d’une séance de microscopie pour un utilisateur. C’est d’autant plus le cas dans un microscope à feuillet de lumière multivue, où la manipulation manuelle de l’orientation est difficile car les échantillons sont intégrés dans un tube. Pour faciliter ce processus, cette étude rapporte les statistiques de.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Calcium Chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Version: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspension	Sigma-Aldrich	L3280
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	ThermoFischer Scientific	AM1340	For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05	Adtech Innovations in Fluoroplastics	STW15	PTFE tubes
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640
Ultrasonic Cleaner	Labman	LMUC3	Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 System	Zeiss