Stratégies d’imagerie et de montage par microscopie à feuillet de lumière pour les embryons précoces de poisson-zèbre

Résumé

Une stratégie de préparation d’échantillons pour l’imagerie d’embryons précoces de poisson-zèbre dans un chorion intact à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière est décrite. Il analyse les différentes orientations que les embryons acquièrent à l’intérieur du chorion aux stades épibolique et bourgeonnaire à 70 % et détaille les stratégies d’imagerie pour obtenir une résolution à l’échelle cellulaire dans tout l’embryon à l’aide du système de feuillet lumineux.

Résumé

La microscopie à feuillet de lumière est devenue la méthodologie de choix pour l’imagerie en direct d’embryons de poisson-zèbre sur de longues échelles de temps avec une phototoxicité minimale. En particulier, un système multiview, qui permet la rotation des échantillons, permet d’imager des embryons entiers sous différents angles. Cependant, dans la plupart des séances d’imagerie avec un système multivue, le montage des échantillons est un processus fastidieux car les échantillons sont généralement préparés dans un tube en polymère. Pour faciliter ce processus, ce protocole décrit les stratégies de montage de base pour l’imagerie du développement précoce du poisson-zèbre entre les stades épibolique de 70 % et les premiers stades somite. Plus précisément, l’étude fournit des statistiques sur les différentes positions par défaut des embryons aux stades de 70 % de l’épibolie et du bourgeon dans le chorion. De plus, il traite du nombre optimal d’angles et de l’intervalle entre les angles requis pour imager des embryons entiers de poisson-zèbre aux premiers stades du développement afin que des informations à l’échelle cellulaire puissent être extraites en fusionnant les différentes vues. Enfin, étant donné que l’embryon couvre tout le champ de vision de la caméra, ce qui est nécessaire pour obtenir une résolution à l’échelle cellulaire, ce protocole détaille le processus d’utilisation des informations de billes situées au-dessus ou en dessous de l’embryon pour l’enregistrement des différentes vues.

Introduction

Garantir une phototoxicité minimale est une exigence majeure pour l’imagerie d’embryons vivants avec une résolution spatio-temporelle élevée pendant de longues périodes. Au cours de la dernière décennie, la microscopie à feuillet de lumière est devenue la méthodologie de choix pour répondre à cette exigence 1,2,3,4,5,6,7. Brièvement, dans cette technique qui a été utilisée pour la première fois en 2004 pour capturer les processus de développement⁸, deux fines feuilles de laser alignées traversent l’embryon à partir d’extrémités opposées, éclairant uniquement le plan d’intérêt. Un objectif de détection est placé orthogonalement, puis la lumière fluorescente émise par tous les points éclairés de l’échantillon est collectée simultanément. Une image 3D est ensuite obtenue en déplaçant séquentiellement l’embryon à travers la feuille de lumière statique.

De plus, dans une forme spécifique de cette méthodologie, appelée microscopie à feuillet de lumière multivue, les échantillons peuvent être suspendus dans un tube en polymère qui peut être tourné à l’aide d’un rotor, permettant d’imager le même embryon sous plusieurs angles ^9,10,11. Après l’imagerie, les images sous plusieurs angles sont fusionnées en fonction de marqueurs de recalage, qui sont généralement des marqueurs fluorescents globulaires à l’intérieur de l’embryon (par exemple, des noyaux) ou dans le tube (par exemple, des billes fluorescentes). L’imagerie multivue et la fusion améliorent considérablement la résolution axiale, offrant une résolution isotrope sur les trois dimensions¹². Bien qu’il s’agisse d’un grand avantage, l’un des principaux défis de la méthodologie multiview est le montage d’échantillons, où les embryons doivent être montés et maintenus en place dans les tubes pendant toute la durée de l’imagerie.

Pour effectuer une imagerie multivue, pour maintenir les embryons en place et empêcher les mouvements pendant l’imagerie, les embryons peuvent être intégrés dans l’agarose. Cependant, cela conduit souvent à une croissance et à un développement préjudiciables, en particulier pour les embryons de poisson-zèbre à un stade précoce¹³, le système modèle dont il est question ici. Une deuxième stratégie de montage consiste à utiliser un tube mince qui est à peine plus grand que le diamètre de l’embryon, où l’embryon peut être tiré dans le tube avec le milieu embryonnaire, suivi de la fermeture du fond du tube avec un bouchon d’agarose¹⁴. Dans cette méthode, parce que le tube est rempli de milieu embryonnaire, les marqueurs d’enregistrement tels que les billes fluorescentes ne peuvent pas être utilisés pour la fusion des différentes vues, et l’enregistrement dépend donc des marqueurs à l’intérieur de l’embryon. En général, les billes agissent comme de meilleurs marqueurs de repérage, car le signal des marqueurs à l’intérieur de l’embryon se dégrade à mesure que l’on s’enfonce plus profondément dans l’échantillon en raison des limites d’éclairage et de détection de tout microscope.

Ainsi, une troisième approche, qui sera détaillée ici et utilisée précédemment 5,13,14,15,16, consiste à imager des embryons précoces de poisson-zèbre avec un chorion intact et à remplir le tube avec un pourcentage minimal d’agarose, qui contient des billes comme marqueurs d’enregistrement. Dans ce scénario, étant donné qu’il n’est pas possible d’intervenir manuellement pour positionner les embryons dans un chorion, cette étude fournit des statistiques sur l’orientation par défaut des embryons précoces de poisson-zèbre, en se concentrant particulièrement sur 70% des stades d’épibole et de bourgeon. Il discute ensuite du nombre optimal de vues requis pour l’imagerie des embryons à un stade précoce à une résolution à l’échelle cellulaire et détaille le processus de fusion à l’aide de BigStitcher, un plugin^basé sur les FIDJI 10,17,18. L’ensemble de ce protocole, qui utilise un objectif 20x/1 NA, vise à faciliter l’utilisation par les embryologistes de poisson-zèbre de systèmes de feuilles de lumière multivues pour l’imagerie d’embryons avec des noyaux et des marqueurs membranaires de la gastrulation aux premiers stades sommites.

Protocole

Les procédures d’entretien et expérimentales du poisson-zèbre utilisées dans cette étude ont été approuvées par le comité d’éthique animale de l’établissement, voir les références TIFR/IAEC/2023-1 et TIFR/IAEC/2023-5. Des embryons obtenus par croisement de poissons hétérozygotes exprimant Tg(actb2 :GFP-Hsa.UTRN)¹⁹ ont été injectés avec l’ARNm H2A-mCherry (30 pg) au stade unicellulaire. L’ARNm H2A-mCherry a été synthétisé à l’aide du plasmide pCS2+ H2A-mCherry (un don du laboratoire Oates, EPFL) par transcription in vitro . Les embryons exprimant les deux marqueurs, appelés respectivement Utr-GFP et H2A-mCherry, dans le reste du protocole, ont été imagés aux stades de l’épibole et du bourgeon à 70 %. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation d’échantillons pour l’imagerie multi-vues

1. Préparation des tubes FEP/PTFE
   1. Nettoyez les tubes FEP/PTFE en suivant les procédures décrites précédemment¹⁴.
   2. Après le nettoyage, coupez les tubes en longueurs de 2 à 2,5 cm selon les besoins et rangez-les dans des tubes de microcentrifugation de 2 ml contenant de l’eau distillée doublement. Les tubes peuvent être conservés de cette manière pendant environ un mois.
   3. Avant la préparation de l’échantillon, chauffez les tubes à 70-75 °C pendant environ 25 minutes pour redresser les tubes. Évitez l’encombrement dans chaque tube de microcentrifugation pour éviter l’agglutination, en assurant un espace suffisant pour un redressement efficace du tube.
      REMARQUE : Portez des gants pendant toute la procédure de manipulation des tubes, car toute empreinte digitale/particule de poussière laissée sur les tubes peut interférer avec l’imagerie.
2. Préparation de l’agarose
   1. Préparez les solutions mères tampon E3 50x comme suit :
      1. Stock 1 - 3,252 g de Na₂HPO₄, 0,285 g de KH₂PO₄, 11,933 g de NaCl, 0,477 g de KCl dans 1 L d’eau déminéralisée
      2. Stock 2 - 2,426 g de CaCl₂, 4,067 g de MgSO₄ dans 1 L d’eau déminéralisée.
   2. Pour fabriquer 1 tampon E3, ajoutez 20 ml de chacune des solutions mères 1 et 2 dans 960 ml d’eau désionisée.
      REMARQUE : N’ajoutez pas de bleu de méthylène dans le tampon E3 utilisé pour l’imagerie, car cela provoque une diffusion de la lumière.
   3. Dissoudre l’agarose à bas point de fusion dans 1x E3 en chauffant à 70-75 °C sur un bloc chauffant en agitant jusqu’à ce que la solution devienne claire sans grumeaux ni cristaux.
   4. Pour l’imagerie multivue, ajoutez des billes fluorescentes disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux) à la solution d’agarose, ce qui permet le recalage de l’image pendant l’analyse. Soniquez les billes à température ambiante avec une fréquence de 40 kHz pendant 20 à 30 min dans un ultrasoniseur à bain d’eau pour désagréger les billes.
   5. Après la sonication, ajouter 1 μL de billes à 10 mL de solution d’agarose dans un tube de 15 mL et bien agiter le tube pour assurer une dispersion uniforme des billes.
      REMARQUE : Le volume de solution de billes à ajouter à l’agarose dépend de la solution mère et du fabricant. Essayez une gamme de volumes et choisissez une concentration où les billes apparaissent bien dispersées lorsqu’elles sont imagées dans le système de feuillet de lumière. Trop de billes peuvent s’agréger malgré la sonication et le vortex, tandis que trop peu de billes peuvent affecter le recalage de l’image.
   6. Conservez le tube d’agarose avec les billes ajoutées dans un bain-marie fermé maintenu à 37 °C pendant au moins 30 minutes avant la préparation de l’échantillon. Cela permet de faire baisser la température de l’agarose de 70 °C à 37 °C.
3. Préparation des échantillons
   1. Installez les poissons par paires avec des séparateurs la veille du jour de l’imagerie. Retirez les séparateurs pendant environ 15 minutes et prélevez les embryons en utilisant la procédure standard²⁰.
   2. Une fois que les embryons ont atteint le stade d’intérêt pour la préparation de l’échantillon, versez la totalité des 10 ml d’agarose (avec des billes) maintenue à 37 °C dans une boîte de Pétri de 6 cm.
   3. Attendez environ 2-3 minutes pour ramener la température en dessous de 33 °C avant de transférer 10 à 15 embryons dans la solution d’agarose.
      REMARQUE : Il s’agit d’une étape importante pour prévenir tout choc thermique possible pour les embryons transférés dans l’agarose.
   4. Assurez-vous que le moins de tampon E3 possible est ajouté à la solution d’agarose lors du transfert des embryons. Faites tourner la boîte de Pétri pour que le peu de tampon qui aurait été transféré soit bien dispersé.
   5. Porter des gants pour le reste de la procédure de préparation de l’échantillon.
   6. Prenez une micropipette de 200 μL avec une pointe de pipette appropriée et insérez un tube droit nettoyé sorti du tube de la microcentrifugeuse dans la pointe de la pipette, comme illustré à la figure 1A,B.
   7. Aspirez un peu d’agarose dans le tube, suivi de 2-3 embryons à l’aide de la micropipette (Figure 1C,D). Assurez-vous que les embryons sont près du fond du tube (Figure 1E), ce qui deviendra important lors de la mise en place de l’imagerie. Assurez-vous également qu’il y a un peu d’agarose entre les différents embryons (figure 1E) afin que les billes de cette région puissent être utilisées comme marqueurs d’enregistrement.
   8. Sans relâcher la pression de la pipette, détachez le tube de la pointe de la pipette et placez-le sur le couvercle de la boîte de Pétri remplie d’E3 pour que l’agarose se solidifie (Figure 1F).
   9. Répétez les étapes 1.3.6 à 1.3.8 jusqu’à ce que tous les embryons de la boîte de Pétri soient transférés dans les tubes.
   10. Une fois que l’agarose s’est solidifiée (ce qui peut prendre de 5 à 10 minutes et peut être confirmé en vérifiant l’agarose dans la boîte de Pétri), transférez les tubes dans un tube de microcentrifugation de 2 mL rempli d’E3 (figure 1G).
   11. Conservez les tubes contenant les embryons dans un incubateur à 28 °C ou 33 °C, selon les besoins, avant de passer à l’imagerie multivue.

2. Imagerie multivue

REMARQUE : Cette étape présente une procédure générale pour l’imagerie multivue des embryons de poisson-zèbre à leurs premiers stades de développement. La méthode détaillée ci-dessous peut être facilement adaptée à tout système de microscopie à feuillet de lumière multivue.

1. Localisation de l’embryon
   REMARQUE : Remplissez la chambre d’échantillon du microscope avec le milieu embryonnaire²⁰ et réglez la température de la chambre d’échantillon à la température d’intérêt au moins 10 min avant l’imagerie.
   1. Assemblez le porte-échantillon comme décrit précédemment²¹, mais avec une modification. Comme l’imagerie sera effectuée à travers le tube, insérez le tube contenant les embryons directement dans un capillaire de bon diamètre, de sorte qu’il soit maintenu en place sans pousser l’agarose vers l’extérieur et déranger les embryons au fond (Figure 1H).
      REMARQUE : Étant donné que la chambre d’échantillonnage a une hauteur définie, s’assurer que les embryons sont situés vers le fond du tube pendant la préparation de l’échantillon (comme mentionné à l’étape 1.3.7) permettrait de positionner l’embryon dans le champ de vision sans heurter le sol de la chambre.
   2. Insérez le porte-échantillon dans le système multiview et utilisez les commandes x et y pour placer l’embryon au centre du champ de vision.
   3. Utilisez la commande z du navigateur d’échantillon pour ensuite mettre l’embryon au point.
   4. À ce stade, l’orientation de l’embryon à l’intérieur du chorion sera clairement visible, et si elle n’est pas satisfaisante, insérez un nouveau tube et choisissez l’embryon avec une orientation d’intérêt.
2. Alignement des feuilles de lumière
   1. Une fois que l’embryon est en position, configurez tous les paramètres expérimentaux - lasers, trajet lumineux, filtre, séparateur de faisceau et caméra.
   2. Lors de la configuration des paramètres d’acquisition, si le logiciel propose une option de balayage pivot, sélectionnez-la. Un balayage pivot réduira l’effet d’ombrage émergeant de la feuille de lumière lorsqu’elle rencontre des structures ou des régions opaques dans l’échantillon.
   3. Lancez le balayage en direct de l’échantillon. Configurez la taille du bit, la puissance du laser et le zoom souhaité, ce qui déterminera l’épaisseur de la feuille de lumière et, par conséquent, la résolution axiale.
   4. Pour aligner les feuilles lumineuses, passez d’abord à l’éclairage unilatéral et modifiez les paramètres des deux feuilles lumineuses (gauche et droite) séquentiellement. Zoomez numériquement sur une région de l’échantillon où des structures d’intérêt claires sont visibles.
      REMARQUE : Dans cette étude, un marqueur nucléaire (H2A-mCherry) ou un marqueur membranaire (Utr-GFP) a été utilisé pour aligner les feuilles. Il est recommandé de modifier les paramètres de la feuille de lumière dans le logiciel afin d’obtenir le contraste de signal le plus net dans la région d’intérêt.
   5. Une fois que les deux feuilles lumineuses sont optimisées individuellement pour obtenir le meilleur signal, allumez les deux feuilles lumineuses. Effectuez un deuxième tour d’alignement et assurez-vous que le scintillement est minimal, ce qui indique un assez bon alignement des deux feuilles.
   6. Une fois l’alignement terminé, activez l’option de fusion automatique des images générées par les deux feuilles, si le logiciel le permet. Alternativement, on peut d’abord aligner grossièrement les feuilles de lumière en se concentrant sur les billes autour de l’échantillon, puis affiner l’alignement à l’aide des informations de l’échantillon.
      REMARQUE : Lors de l’imagerie avec deux fluorophores (tels que des marqueurs nucléaires et membranaires), l’alignement optimal est généralement légèrement différent pour les deux structures. Dans ce scénario, choisissez un paramètre basé sur les contraintes de traitement en aval. Par exemple, si les limites cellulaires doivent être segmentées, ce qui nécessite un traitement relativement plus intensif, alignez les feuillets légers en fonction du marqueur de membrane.
3. Configuration de l’imagerie multivue
   1. Après avoir aligné les feuilles de lumière, activez les options permettant d’effectuer une pile z ainsi qu’une imagerie multivue.
   2. Lancez la numérisation en direct et naviguez à l’aide du navigateur d’échantillons pour sélectionner la première vue. Dans cette vue, configurez l’intervalle de tranches, suivi de la première et de la dernière tranche de la pile z. Ajoutez cette position dans la boîte de dialogue multivue, qui prend note de la position et des informations de la pile z pour cette vue.
   3. Passez à la vue suivante en modifiant l’angle dans le navigateur d’échantillons. Configurez la pile z pour la deuxième vue et ajoutez les informations dans la boîte de dialogue multivue.
   4. Répétez la même opération pour des vues supplémentaires.
      REMARQUE : Assurez-vous qu’un certain nombre minimum de tranches sont imagés dans chaque vue afin qu’il y ait suffisamment de chevauchement entre les différentes vues, ce qui facilitera éventuellement l’enregistrement des vues pendant le traitement. Le nombre minimum de tranches dépendra du facteur de zoom ainsi que du nombre d’angles choisis pour l’imagerie.
   5. Après avoir configuré toutes les vues, enregistrez ces informations dans un fichier texte (nommé 'embryo-positions', par exemple), qui contiendra les informations de la pile z, les coordonnées (x, y, z) du tube ainsi que les spécifications de l’angle pour chaque vue. Après l’enregistrement, effacez toutes les positions de la boîte de dialogue multivue.
   6. Étant donné que l’imagerie est faite avec un chorion intact, qui est relativement grand, il n’est pas possible de voir les billes dans le tube avec les mêmes réglages. Par conséquent, les informations sur les billes doivent être acquises à partir d’une position différente dans le tube. Pour ce faire, traduisez par une coordonnée « y » différente loin de l’embryon où les billes sont visibles. Ajoutez cette position à la boîte de dialogue multivue et enregistrez-la dans un fichier texte (nommé 'beads-y', par exemple).
      REMARQUE : Imagez les billes aussi près que possible de l’échantillon d’embryon afin de minimiser les effets d’éventuelles différences de courbure du tube aux deux positions. Par conséquent, si plusieurs embryons sont montés dans le tube, il est important de laisser un peu d’agarose entre les tubes pour imager les billes (comme mentionné à l’étape 1.3.7).
   7. Allez dans le dossier où les fichiers texte sont enregistrés et dupliquez le fichier 'embryo-positions' dans un nouveau fichier nommé 'beads-positions'. Remplacez la coordonnée y de toutes les vues du fichier 'beads-positions' par la coordonnée y du fichier 'beads-y'. Cela garantira que les perles sont imagées avec le même nombre de vues, d’empilements z et de coordonnées x, mais à une position y différente dans le tube.
   8. Revenez au logiciel d’imagerie et chargez le fichier « bead-positions » dans le logiciel. Si l’option de série chronologique est activée, sélectionnez un cycle et démarrez l’expérience. Enregistrez les images de perles en tant que 'billes', qui seront utilisées pour enregistrer les différentes vues pendant le traitement de l’image.
   9. Après avoir pris les images des billes, effacez les positions et chargez le fichier initial « embryo-positions » dans le logiciel. Réglez le nombre de cycles souhaité avec un intervalle de temps approprié et démarrez l’expérience.

3. Analyse d’images multivues

REMARQUE : Pour fusionner les images multivues, un plugin FIJI, BigStitcher, qui est la dernière version du plugin Multiview Reconstruction, est utilisé 10,17,18. Le plug-in peut être installé en ajoutant le plug-in BigStitcher dans la fonction « Gérer les sites de mise à jour », accessible dans l’option « Mettre à jour » du menu « Aide ». Une fois installé, le plugin apparaîtra dans le menu 'Plugins'. Les grandes étapes de la fusion sont les suivantes : (1) Définir des paires de fichiers .xml/.h5 pour les billes et les embryons ; (2) Enregistrez toutes les vues avec le fichier de perles ; (3) Extraire la fonction d’étalement de point (PSF) pour les billes, qui peut être utilisée pour la déconvolution (Figure 2A) ; (4) Transférez les informations d’enregistrement et de PSF du fichier de billes vers le fichier d’embryon et commencez la déconvolution multivue. La plupart de ces étapes ont déjà été décrites en détail²¹, et ici, les étapes qui sont traitées différemment sont décrites.

1. Définition d’un jeu de données .xml
   1. Définissez un nouvel ensemble de données pour les billes et l’embryon comme « beads.xml » et « embryo.xml », respectivement, comme décrit précédemment²¹.
2. Détection et enregistrement à l’aide de points d’intérêt
   1. Une fois l’exportation du fichier beads.xml réussie, sélectionnez les vues requises pour l’enregistrement dans la boîte de dialogue « Multiview Explorer » (Figure 2B). Cliquez avec le bouton droit de la souris et choisissez Détecter les points d’intérêt. Procédez comme décrit^{à la section 21}.
   2. Après avoir détecté les points d’intérêt, sélectionnez toutes les vues, cliquez avec le bouton droit de la souris et choisissez Enregistrer à l’aide des points d’intérêt. Suivez le protocole décrit²¹.
   3. Vérifiez soigneusement si l’enregistrement du cordon a fonctionné avec succès. Une fois l’enregistrement réussi, les perles superposées de différentes vues se superposent (Figure 2C). Pour vérifier la précision du repérage, sélectionnez deux vues consécutives, accédez à la zone de chevauchement et basculez entre les deux vues pour observer si les perles imagées sous différents angles sont superposées. Répétez cette opération pour chaque vue consécutive.
   4. Si le chevauchement n’est pas précis, réessayez l’enregistrement en assouplissant la signification requise pour l’enregistrement et/ou l’erreur acceptable de chevauchement (appelée « erreur RANSAC » dans la boîte de dialogue « Enregistrement »).
   5. Une fois l’inscription réussie, cliquez sur Enregistrer dans la fenêtre « Multiview Explorer » pour enregistrer le fichier .xml mis à jour.
      REMARQUE : Enregistrez également le fichier journal, car il contient des informations détaillées supplémentaires sur l’efficacité de l’enregistrement. Pour traduire les informations d’enregistrement des billes à l’embryon, suivez les étapes décrites ci-dessous.
   6. Ouvrez le fichier bead.xml dans l’éditeur de texte de votre choix et copiez l’intégralité du bloc sous « ViewRegistrations ».
   7. Ouvrez le embryo.xml et remplacez le bloc « ViewRegistrations » par le bloc copié à partir du fichier de billes. S’il y a plusieurs canaux, remplacez les informations d’enregistrement de chaque canal comme ci-dessus. Les informations d’enregistrement peuvent être transférées manuellement ou à l’aide du code MATLAB personnalisé qui peut être téléchargé ici : https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
   8. Ouvrez le fichier embryo.xml dans « BigStitcher » et vérifiez soigneusement si l’enregistrement a fonctionné avec succès pour l’embryon. Répétez la même chose que pour les perles, en vérifiant le chevauchement des structures d’intérêt toutes les deux vues consécutives.
      REMARQUE : Parfois, l’enregistrement de l’embryon peut ne pas être aussi souhaitable malgré le fait que les billes soient parfaitement enregistrées. Cela est possible s’il y a de légers changements dans la courbure du tube entre la position où les billes sont imagées et la position de l’embryon. De plus, il pourrait y avoir des mouvements subtils de l’embryon entre les vues car il flotte librement dans le chorion. Dans ce cas, effectuez un deuxième tour d’enregistrement à l’aide d’un marqueur nucléaire dans l’embryon.
   9. Pour ce faire, ouvrez le fichier embryo.xml dans « BigStitcher », faites un clic droit sur toutes les vues qui ont le marqueur nucléaire, et choisissez Détecter les points d’intérêt.
   10. Renommez les points d’intérêt en « noyaux » et procédez aux étapes comme pour les billes.
   11. Lors de la définition des paramètres de « différence de gaussienne », assurez-vous que la plupart, sinon la totalité, des noyaux sont détectés et qu’il n’y a pas de détection nucléaire ectopique. Ensuite, cliquez sur Terminé.
   12. Ensuite, enregistrez ces vues en choisissant Enregistrer à l’aide de points d’intérêt et optez pour l’option Basé sur un descripteur précis (invariant de traduction ). Assurez-vous que l’option « Comparer toutes les vues et tous les points d’intérêt » est sélectionnée et utilisez les « noyaux » comme points d’intérêt. Utilisez l’option pour corriger la première vue et ne pas cartographier en arrière.
   13. Pour l’enregistrement, utilisez un modèle affine avec une régularisation rigide et les paramètres par défaut dans le plugin.
   14. Vérifiez à nouveau le succès de l’inscription en comparant toutes les deux vues consécutives.
   15. Une fois l’inscription réussie, cliquez sur Enregistrer dans la fenêtre « Multiview Explorer » pour enregistrer le fichier .xml mis à jour.
   16. Ouvrez le fichier embryo.xml dans l’éditeur de texte de votre choix et copiez les informations d’enregistrement des marqueurs nucléaires vers les autres canaux.
3. Extraction et affectation de fonctions d’étalement de points
   1. Pour effectuer une déconvolution multivue, extrayez la PSF du système d’imagerie à partir de l’ensemble de données de billes enregistrées et appliquez-la au fichier de l’embryon.
   2. Pour obtenir ces informations, sélectionnez toutes les vues dans le fichier de perle, puis cliquez avec le bouton droit de la souris et choisissez les options Fonctions d’étalement de points et Extraction .
   3. Dans la boîte de dialogue qui apparaît, assurez-vous que les options Utiliser les points d’intérêt correspondants et Supprimer les projections d’intensité minimale de la PSF sont cochées, passez aux tailles PSF par défaut et cliquez sur OK.
      REMARQUE : Si l’extraction PSF réussit pour toutes les vues, le fichier journal affichera « Extrait n/n PSF »
   4. Ensuite, réenregistrez le fichier .xml. Une case cochée dans la colonne PSF de la boîte de dialogue « Multiview Explorer » apparaîtra, et un dossier « psf » sera généré dans le dossier respectif avec tous les PSF extraits.
   5. Ouvrez le fichier embryo.xml et attribuez le PSF à chaque vue séparément. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur « une vue » → cliquez sur Fonctions d’étalement de points → choisissez Attribuer → sélectionnez Avancé, puis Attribuer un nouveau PSF à toutes les vues sélectionnées. Cliquez sur Parcourir, allez dans le chemin du fichier .xml et ouvrez le dossier psf .
   6. Choisissez le PSF correspondant avec l’ID correspondant dans la vue sélectionnée et cliquez sur OK, après quoi la case PSF apparaîtra cochée dans la fenêtre 'Multiview Explorer'.
   7. Répétez le processus pour toutes les autres vues.
4. Fusion et déconvolution multivues
   1. Une fois que la fonction d’étalement de points a été affectée à toutes les vues, cliquez avec le bouton droit de la souris et choisissez Multiview Deconvolution.
   2. Sélectionnez le cadre de sélection en tant que vues actuellement sélectionnées. Pour ce travail, l’accélération OSEM par défaut et le nombre d’itérations fonctionnent bien.
   3. Sous-échantillonnez les images si nécessaire si vous souhaitez un calcul plus rapide ou si la mémoire du processeur est limitante.
      REMARQUE : Si la RAM requise dépasse la mémoire existante, un message d’erreur d’avertissement de couleur rouge apparaîtra en bas de la fenêtre. Ne démarrez pas la déconvolution si cet avertissement apparaît, car le plugin se bloquera et cessera de répondre à un moment donné pendant le traitement.
   4. Pour évaluer la progression de la déconvolution, consultez le fichier journal, qui affichera les résultats toutes les 5 itérations.
   5. Pour augmenter la vitesse de calcul, effectuez une déconvolution multivue dans le GPU si déjà installé.
      REMARQUE : À la fin de ce processus, une fenêtre d’image fusionnée apparaîtra, qui peut être enregistrée en tant que fichier tiff.

Résultats

L’orientation précise de l’échantillon est un élément essentiel de l’utilisation efficace d’un dispositif de microscopie. Cependant, l’orientation manuelle des échantillons n’est souvent pas possible lors de l’utilisation d’un système de feuille lumineuse à vues multiples, étant donné la nécessité de préparer les échantillons dans un tube. Par conséquent, pour vérifier s’il existe des positions stéréotypées que les embryons occupent dans le chorion, le...

Discussion

Le positionnement d’un embryon dans la bonne orientation pour imager la région d’intérêt est l’une des étapes limitant le débit qui entraîne souvent l’échec d’une séance de microscopie pour un utilisateur. C’est d’autant plus le cas dans un microscope à feuillet de lumière multivue, où la manipulation manuelle de l’orientation est difficile car les échantillons sont intégrés dans un tube. Pour faciliter ce processus, cette étude rapporte les statistiques de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Calcium Chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Version: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspension	Sigma-Aldrich	L3280
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	ThermoFischer Scientific	AM1340	For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05	Adtech Innovations in Fluoroplastics	STW15	PTFE tubes
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640
Ultrasonic Cleaner	Labman	LMUC3	Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 System	Zeiss