Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

요약

광시트 현미경을 사용하여 온전한 융모막 내에서 초기 제브라피시 배아를 이미징하기 위한 샘플 준비 전략이 설명되어 있습니다. 70% epiboly 및 bud 단계에서 배아가 융모막 내에서 획득하는 다양한 방향을 분석하고 광시트 시스템을 사용하여 배아 전체에서 세포 규모의 해상도를 얻기 위한 이미징 전략을 자세히 설명합니다.

초록

광시트 현미경은 광독성을 최소화하면서 장기간에 걸쳐 제브라피시 배아의 실시간 이미징을 위해 선택되는 방법론이 되었습니다. 특히, 샘플 회전이 가능한 멀티뷰 시스템을 통해 다양한 각도에서 전체 배아를 이미징할 수 있습니다. 그러나 멀티뷰 시스템을 사용하는 대부분의 이미징 세션에서는 샘플이 일반적으로 폴리머 튜브에서 준비되기 때문에 샘플 장착은 번거로운 과정입니다. 이 과정을 돕기 위해 이 프로토콜은 70% 에피볼리 단계와 초기 소마이트 단계 사이의 초기 제브라피시 발달을 이미징하기 위한 기본 장착 전략을 설명합니다. 특히, 이 연구는 융모막 내 70%의 에피볼리(epiboly) 및 새싹 단계에서 배아가 기본적으로 위치하는 다양한 위치에 대한 통계를 제공합니다. 또한, 발달 초기 단계에서 전체 제브라피시 배아를 이미징하는 데 필요한 최적의 각도 수와 각도 사이의 간격에 대해 논의하여 서로 다른 관점을 융합하여 세포 규모의 정보를 추출할 수 있습니다. 마지막으로, 배아는 세포 규모의 해상도를 얻는 데 필요한 카메라의 전체 시야를 커버하기 때문에 이 프로토콜은 다양한 보기의 정합을 위해 배아 위 또는 아래의 비드 정보를 사용하는 과정을 자세히 설명합니다.

서문

광독성을 최소화하는 것은 살아있는 배아를 장기간 높은 시공간 해상도로 이미징하기 위한 주요 요구 사항입니다. 지난 10년 동안 광시트 현미경은 이 요구 사항 1,2,3,4,5,6,7을 충족하기 위해 선택되는 방법론이 되었습니다. 간단히 말해서, 발달 과정⁸을 포착하기 위해 2004년에 처음 사용된 이 기술에서는 두 개의 정렬된 얇은 레이저 시트가 반대쪽 끝에서 배아를 통과하여 관심 평면만 비춥니다. 검출 대물렌즈를 직각으로 배치한 다음 샘플의 모든 조명 지점에서 방출된 형광을 동시에 수집합니다. 그런 다음 정적 광 시트를 통해 배아를 순차적으로 이동하여 3D 이미지를 얻습니다.

또한, 멀티뷰 광시트 현미경이라고 하는 이 방법론의 ....

프로토콜

이 연구에 사용된 제브라피시 유지 관리 및 실험 절차는 기관 동물 윤리 위원회(참조 TIFR/IAEC/2023-1 및 TIFR/IAEC/2023-5)의 승인을 받았습니다. Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)¹⁹를 발현하는 이형접합 어류를 교배하여 얻은 배아에 단세포 단계에서 H2A-mCherry mRNA(30pg)를 주입했습니다. H2A-mCherry mRNA는 pCS2+ H2A-mCherry 플라스미드(Oates lab, EPFL에서 선물)를 사용하여 in vitro transcription으로 합성되었습니다. 프로토콜의 나머지 부분에서 각각 Utr-GFP 및 H2A-mCherry라고 하는 두 마커를 모두 발현하는 배아는 70% 에피볼리 및 새싹 단계에서 이미지화되었습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 멀티뷰 이미징을 위한 시료 전처리

1. FEP/PTFE 튜브의 준비
   1. 이전에 설명한 절차에 따라 FEP/PTFE 튜브 청소¹⁴.....

토론

관심 영역을 이미지화하기 위해 배아를 올바른 방향으로 배치하는 것은 종종 사용자의 현미경 세션 실패를 초래하는 속도 제한 단계 중 하나입니다. 이는 샘플이 튜브 내에 내장되어 있기 때문에 방향을 수동으로 조작하기 어려운 멀티뷰 광시트 현미경에서 더욱 그렇습니다. 이 과정을 돕기 위해 이 연구는 배아가 있는 고분자 튜브가 미세 원심분리기 튜브에 똑바로 세?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Calcium Chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Version: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspension	Sigma-Aldrich	L3280
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	ThermoFischer Scientific	AM1340	For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05	Adtech Innovations in Fluoroplastics	STW15	PTFE tubes
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640
Ultrasonic Cleaner	Labman	LMUC3	Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 System	Zeiss