Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

요약

광시트 현미경을 사용하여 온전한 융모막 내에서 초기 제브라피시 배아를 이미징하기 위한 샘플 준비 전략이 설명되어 있습니다. 70% epiboly 및 bud 단계에서 배아가 융모막 내에서 획득하는 다양한 방향을 분석하고 광시트 시스템을 사용하여 배아 전체에서 세포 규모의 해상도를 얻기 위한 이미징 전략을 자세히 설명합니다.

초록

광시트 현미경은 광독성을 최소화하면서 장기간에 걸쳐 제브라피시 배아의 실시간 이미징을 위해 선택되는 방법론이 되었습니다. 특히, 샘플 회전이 가능한 멀티뷰 시스템을 통해 다양한 각도에서 전체 배아를 이미징할 수 있습니다. 그러나 멀티뷰 시스템을 사용하는 대부분의 이미징 세션에서는 샘플이 일반적으로 폴리머 튜브에서 준비되기 때문에 샘플 장착은 번거로운 과정입니다. 이 과정을 돕기 위해 이 프로토콜은 70% 에피볼리 단계와 초기 소마이트 단계 사이의 초기 제브라피시 발달을 이미징하기 위한 기본 장착 전략을 설명합니다. 특히, 이 연구는 융모막 내 70%의 에피볼리(epiboly) 및 새싹 단계에서 배아가 기본적으로 위치하는 다양한 위치에 대한 통계를 제공합니다. 또한, 발달 초기 단계에서 전체 제브라피시 배아를 이미징하는 데 필요한 최적의 각도 수와 각도 사이의 간격에 대해 논의하여 서로 다른 관점을 융합하여 세포 규모의 정보를 추출할 수 있습니다. 마지막으로, 배아는 세포 규모의 해상도를 얻는 데 필요한 카메라의 전체 시야를 커버하기 때문에 이 프로토콜은 다양한 보기의 정합을 위해 배아 위 또는 아래의 비드 정보를 사용하는 과정을 자세히 설명합니다.

서문

광독성을 최소화하는 것은 살아있는 배아를 장기간 높은 시공간 해상도로 이미징하기 위한 주요 요구 사항입니다. 지난 10년 동안 광시트 현미경은 이 요구 사항 1,2,3,4,5,6,7을 충족하기 위해 선택되는 방법론이 되었습니다. 간단히 말해서, 발달 과정⁸을 포착하기 위해 2004년에 처음 사용된 이 기술에서는 두 개의 정렬된 얇은 레이저 시트가 반대쪽 끝에서 배아를 통과하여 관심 평면만 비춥니다. 검출 대물렌즈를 직각으로 배치한 다음 샘플의 모든 조명 지점에서 방출된 형광을 동시에 수집합니다. 그런 다음 정적 광 시트를 통해 배아를 순차적으로 이동하여 3D 이미지를 얻습니다.

또한, 멀티뷰 광시트 현미경이라고 하는 이 방법론의 특정 형태에서, 샘플은 로터를 사용하여 회전할 수 있는 폴리머 튜브에 현탁될 수 있으며, 이를 통해 여러 각도에서 동일한 배아를 이미징할 수 있습니다 ^9,10,11. 이미징 후, 여러 각도의 이미지는 일반적으로 배아(예: 핵) 또는 튜브(예: 형광 비드) 내의 구형 형광 마커인 등록 마커를 기반으로 융합됩니다. Multiview 이미징 및 융합은 축 방향 해상도를 크게 향상시켜 3차원 모두에 걸쳐 등방성 해상도를 제공합니다¹². 이는 큰 장점이지만, 멀티뷰 방법론의 주요 과제는 이미징의 전체 시간 동안 배아를 튜브에 장착하고 제자리에 유지해야 하는 샘플 장착입니다.

멀티뷰 이미징을 수행하기 위해, 이미징 중 움직임을 방지하고 배아를 아가로스에 내장할 수 있습니다. 그러나 이것은 종종 해로운 성장과 발달로 이어지며, 특히 여기에서 논의되는 모델 시스템인 초기 단계의 제브라피시 배아¹³의 경우 더욱 그렇습니다. 두 번째 장착 전략은 배아의 직경보다 약간 큰 얇은 튜브를 사용하여 배아를 배아 배지와 함께 튜브 안으로 끌어들일 수 있는 다음 아가로스 플러그¹⁴로 튜브 바닥을 닫는 것입니다. 이 방법에서는 튜브가 배아 배지로 채워져 있기 때문에 형광 비드와 같은 등록 마커를 서로 다른 견해의 융합에 사용할 수 없으며 등록은 배아 내의 마커에 의존합니다. 일반적으로 비드는 배아 내 마커의 신호가 현미경의 조명 및 검출 제한으로 인해 샘플 깊숙이 들어갈수록 저하되기 때문에 더 나은 등록 마커 역할을 합니다.

따라서, 여기에서 상세히 설명되고 이전에^사용된 5,13,14,15,16 세 번째 접근법은 온전한 융모막으로 초기 제브라피시 배아를 이미징하고 정합 마커로 구슬을 포함하는 아가로스를 최소의 비율로 튜브에 채우는 것입니다. 이 시나리오에서는 융모막 내에 배아를 배치하기 위한 수동 개입이 불가능하기 때문에 이 연구는 초기 제브라피시 배아가 속하는 기본 방향에 대한 통계를 제공하며, 특히 70%의 에피볼리 및 새싹 단계에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 세포 규모 해상도에서 초기 단계 배아를 이미징하는 데 필요한 최적의 보기 수에 대해 논의하고 FIJI 기반 플러그인^10,17,18인 BigStitcher를 사용한 융합 과정에 대해 자세히 설명합니다. 20x/1 NA 대물렌즈를 사용하는 이 프로토콜은 제브라피시 발생학자들이 위축에서 초기 소마이트 단계까지 핵 및 막 마커가 있는 배아를 이미징하기 위해 멀티뷰 광시트 시스템을 사용하는 것을 용이하게 하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

이 연구에 사용된 제브라피시 유지 관리 및 실험 절차는 기관 동물 윤리 위원회(참조 TIFR/IAEC/2023-1 및 TIFR/IAEC/2023-5)의 승인을 받았습니다. Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)¹⁹를 발현하는 이형접합 어류를 교배하여 얻은 배아에 단세포 단계에서 H2A-mCherry mRNA(30pg)를 주입했습니다. H2A-mCherry mRNA는 pCS2+ H2A-mCherry 플라스미드(Oates lab, EPFL에서 선물)를 사용하여 in vitro transcription으로 합성되었습니다. 프로토콜의 나머지 부분에서 각각 Utr-GFP 및 H2A-mCherry라고 하는 두 마커를 모두 발현하는 배아는 70% 에피볼리 및 새싹 단계에서 이미지화되었습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 멀티뷰 이미징을 위한 시료 전처리

1. FEP/PTFE 튜브의 준비
   1. 이전에 설명한 절차에 따라 FEP/PTFE 튜브 청소¹⁴.
   2. 세척 후 요구 사항에 따라 튜브를 2-2.5cm 길이로 자르고 이중 증류수가 들어 있는 2mL 미세 원심분리기 튜브에 보관합니다. 튜브는 이러한 방식으로 약 한 달 동안 보관할 수 있습니다.
   3. 시료를 준비하기 전에 튜브를 70-75°C에서 약 25분 동안 가열하여 튜브를 곧게 펴십시오. 뭉침을 방지하기 위해 각 미세 원심분리기 튜브의 과밀을 피하고 효과적인 튜브 교정을 위한 충분한 공간을 확보하십시오.
      알림: 튜브에 남아 있는 지문/먼지 입자가 이미징을 방해할 수 있으므로 전체 튜브 취급 절차 동안 장갑을 착용하십시오.
2. 아가로스의 제조
   1. 다음과 같이 E3 버퍼 50x 스톡 용액을 준비합니다.
      1. 스톡 1 - Na₂HPO₄ 3.252g, KH₂PO₄ 0.285g, NaCl 11.933g, 탈이온수 1L에 KCl 0.477g
      2. 재고 2 - 2.426g의 CaCl₂, 4.067L의 탈이온수 중 4g의 MgSO_1g.
   2. 1x E3 완충액을 만들려면 960mL의 탈이온수에 스톡 1 및 2 용액 각각 20mL를 추가합니다.
      참고: 이미징에 사용되는 E3 버퍼에 메틸렌 블루를 추가하면 빛이 산란될 수 있으므로 추가하지 마십시오.
   3. 용액이 덩어리나 결정 없이 투명해질 때까지 교반하면서 열 블록에서 70-75°C로 가열하여 1x E3에서 저융점 아가로스를 용해시킵니다.
   4. 멀티뷰 이미징의 경우, 시중에서 판매되는 형광 비드( 재료 표 참조)를 아가로스 용액에 추가하면 분석 중에 이미지를 정합할 수 있습니다. 수조 초음파기에서 20-30 분 동안 40kHz 주파수로 실온에서 비드를 초음파 처리하여 비드를 분해합니다.
   5. 초음파 처리 후 15mL 튜브에 10mL의 아가로스 용액에 1μL의 비드를 추가하고 비드의 균일한 분산을 보장하기 위해 튜브를 잘 소용돌이시킵니다.
      참고: 아가로스에 첨가되는 비드 용액의 부피는 스톡 용액과 제조업체에 따라 다릅니다. 다양한 부피를 시도하고 라이트 시트 시스템에서 이미징할 때 비드가 잘 분산되어 보이는 농도를 선택하십시오. 너무 많은 비드는 초음파 처리 및 와류에도 불구하고 응집될 수 있는 반면, 너무 적은 비드는 이미지 정합에 영향을 줄 수 있습니다.
   6. 비드가 첨가된 아가로스 튜브를 시료 전처리 전에 37°C로 유지되는 밀폐된 수조에서 최소 30분 동안 보관하십시오. 이렇게 하면 아가로스의 온도가 70°C에서 37°C로 내려갑니다.
3. 시료 전처리
   1. 이미징 하루 전 저녁에 칸막이와 쌍으로 물고기를 설정하십시오. 약 15분 동안 칸막이를 제거하고 표준 절차²⁰에 따라 배아를 채취합니다.
   2. 배아가 시료 전처리를 위한 관심 단계에 도달하면 37°C에서 보관한 아가로스(비드 포함) 10mL 전체를 6cm 페트리 접시에 붓습니다.
   3. 10-15개의 배아를 아가로스 용액으로 옮기기 전에 온도를 33°C 이하로 낮추기 위해 약 2-3분 동안 기다립니다.
      참고: 이것은 아가로스로 전달된 배아에 대한 가능한 열 충격을 방지하기 위한 중요한 단계입니다.
   4. 배아를 이식하는 동안 아가로스 용액에 가능한 한 적은 E3 완충액이 추가되도록 합니다. 옮겨졌을 작은 완충액이 잘 분산되도록 페트리 접시를 소용돌이칩니다.
   5. 나머지 샘플 준비 절차를 위해 장갑을 착용하십시오.
   6. 적절한 피펫 팁이 있는 200μL 마이크로피펫을 가져와서 그림 1A,B와 같이 미세원심분리기 튜브에서 꺼낸 세척된 직선 튜브를 피펫 팁에 삽입합니다.
   7. 튜브에 약간의 아가로스를 흡인한 다음 마이크로피펫을 사용하여 2-3개의 배아를 흡인합니다(그림 1C,D). 배아가 튜브 바닥에 가까이 있는지 확인하고(그림 1E), 이는 이미징을 설정하는 동안 중요해집니다. 또한 서로 다른 배아 사이에 약간의 아가로스가 있는지 확인하여(그림 1E) 이 영역의 비드를 등록 마커로 사용할 수 있습니다.
   8. 피펫에서 압력을 해제하지 않고 피펫 팁에서 튜브를 분리하고 아가로스가 응고되도록 E3로 채워진 페트리 접시의 뚜껑에 놓습니다(그림 1F).
   9. 페트리 접시의 모든 배아가 튜브로 옮겨질 때까지 1.3.6에서 1.3.8까지 반복합니다.
   10. 아가로스가 응고되면(5-10분이 소요될 수 있으며 페트리 접시에서 아가로스를 확인하여 확인할 수 있음) 튜브를 E3로 채워진 2mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다(그림 1G).
   11. 필요에 따라 배아가 있는 튜브를 28°C 또는 33°C 인큐베이터에 보관한 후 멀티뷰 이미징을 진행합니다.

2. 멀티뷰 이미징

참고: 이 단계는 초기 발달 단계에서 제브라피시 배아의 멀티뷰 이미징을 위한 일반적인 절차를 제시합니다. 아래에 설명된 방법은 모든 멀티뷰 광시트 현미경 시스템에 쉽게 적용할 수 있습니다.

1. 배아 위치 파악
   알림: 현미경의 샘플 챔버를 배아 배지²⁰으로 채우고 이미징 최소 10분 전에 샘플 챔버의 온도를 관심 온도로 설정합니다.
   1. 그러나 한 번의 수정으로 이전에 설명한 대로 샘플 홀더를 조립²¹. 이미징은 튜브를 통해 수행되므로 배아가 있는 튜브를 올바른 직경의 모세관에 직접 삽입하여 아가로스를 밀어내고 바닥의 배아를 방해하지 않고 제자리에 고정되도록 합니다(그림 1H).
      참고: 샘플 챔버에는 정의된 높이가 있기 때문에 샘플 준비 중에 배아가 튜브 바닥을 향하도록 하면(1.3.7단계에서 언급됨) 챔버 바닥에 부딪히지 않고 시야에 배아를 배치할 수 있습니다.
   2. 샘플 홀더를 멀티뷰 시스템에 삽입하고 x- 및 y- 컨트롤을 사용하여 배아를 시야의 중앙으로 가져옵니다.
   3. 표본 탐색기의 z 컨트롤을 사용하여 배아에 초점을 맞춥니다.
   4. 이 시점에서 융모막 내 배아의 방향이 명확하게 보이며 만족스럽지 않으면 새 튜브를 삽입하고 관심 있는 배아를 선택합니다.
2. 라이트 시트 정렬하기
   1. 배아가 제 위치에 놓이면 레이저, 광 경로, 필터, 빔 스플리터, 카메라 등 모든 실험 설정을 지정합니다.
   2. 획득 파라미터를 설정하는 동안 소프트웨어가 피벗 스캔 옵션을 제공하면 해당 옵션을 선택하십시오. 피벗 스캔은 샘플의 구조나 불투명 영역과 만날 때 광시트에서 나오는 그림자 효과를 줄입니다.
   3. 샘플의 실시간 스캔을 시작합니다. 비트 크기, 레이저 출력 및 원하는 줌을 설정하면 라이트 시트의 두께가 결정되고 그에 따라 축 해상도가 결정됩니다.
   4. 라이트 시트를 정렬하려면 먼저 단면 조명 으로 전환하고 두 라이트 시트 (왼쪽 및 오른쪽)의 설정을 순차적으로 변경합니다. 관심 있는 명확한 구조를 볼 수 있는 시료 영역을 디지털 방식으로 확대합니다.
      참고: 이 연구에서는 핵(H2A-mCherry) 또는 멤브레인(Utr-GFP) 마커를 사용하여 시트를 정렬했습니다. 관심 영역에서 가장 선명한 신호 대비를 얻을 수 있도록 소프트웨어에서 라이트 시트 설정을 변경하는 것이 좋습니다.
   5. 최상의 신호를 얻기 위해 두 개의 라이트 시트가 개별적으로 최적화되면 두 라이트 시트를 모두 켭니다. 두 번째 정렬을 수행하고 깜박임이 최소화되었는지 확인하여 두 시트가 상당히 잘 정렬되었음을 나타냅니다.
   6. 정렬이 완료되면 소프트웨어에서 허용하는 경우 두 시트에서 생성된 이미지를 자동으로 융합하는 옵션을 활성화합니다. 또는 먼저 시료 주변의 비드에 초점을 맞춰 광시트를 대략적으로 정렬한 다음 시료의 정보를 사용하여 정렬을 미세 조정할 수 있습니다.
      참고: 두 개의 형광단(예: 핵 및 멤브레인 마커)으로 이미징하는 동안 최적의 정렬은 일반적으로 두 구조에 대해 약간 다릅니다. 이 시나리오에서는 다운스트림 처리에 대한 제약 조건에 따라 설정을 선택합니다. 예를 들어, 셀 경계를 분할해야 하는 경우(상대적으로 처리 집약적) 멤브레인 마커를 기준으로 광 시트를 정렬합니다.
3. 멀티뷰 이미징 설정
   1. 라이트 시트를 정렬한 후 z-stack 및 multiview 이미징을 수행하기 위한 옵션을 활성화합니다.
   2. 실시간 스캔을 시작하고 표본 탐색기를 사용하여 탐색하여 첫 번째 보기를 선택합니다. 이 보기에서 조각 간격을 설정한 다음 z-stack의 첫 번째 조각과 마지막 조각을 설정합니다. 멀티뷰 대화 상자에 이 위치를 추가하면 이 뷰의 위치 및 Z 스택 정보가 기록됩니다.
   3. 시편 탐색기에서 각도를 변경하여 다음 보기로 이동합니다. 두 번째 보기에 대한 z-stack을 설정하고 멀티view 대화 상자에 정보를 추가합니다.
   4. 추가 뷰에 대해서도 동일한 작업을 반복합니다.
      참고: 서로 다른 뷰 간에 충분한 겹침이 있도록 각 뷰에서 특정 최소 수의 슬라이스가 이미지화되도록 해야 하며, 이는 결국 처리 중에 뷰를 등록하는 데 도움이 됩니다. 최소 슬라이스 수는 확대/축소 비율과 이미징을 위해 선택한 각도 수에 따라 달라집니다.
   5. 모든 보기를 설정한 후 이 정보를 텍스트 파일(예: 'embryo-positions')에 저장하면 z-stack 정보, 튜브의 (x, y, z) 좌표 및 각 보기의 각도 사양이 포함됩니다. 저장한 후 멀티뷰 대화 상자에서 모든 위치를 지웁니다.
   6. 이미징은 상대적으로 큰 온전한 융모막으로 수행되기 때문에 동일한 설정으로 튜브의 비드를 볼 수 없습니다. 따라서 비드 정보는 튜브의 다른 위치에서 획득해야 합니다. 이렇게 하려면 비드가 보이는 배아에서 떨어진 다른 'y' 좌표로 변환합니다. 이 위치를 멀티뷰 대화 상자에 추가하고 이 위치를 텍스트 파일(예: 'beads-y')에 저장합니다.
      참고: 두 위치에서 튜브 곡률의 가능한 차이의 영향을 최소화하기 위해 비드를 가능한 한 배아 샘플에 가깝게 이미지화하십시오. 따라서 여러 배아가 튜브에 장착된 경우 비드를 이미지화하기 위해 튜브 사이에 약간의 아가로스를 남겨두는 것이 중요합니다(1.3.7단계에서 언급한 대로).
   7. 텍스트 파일이 저장된 폴더로 이동하여 'embryo-positions' 파일을 'beads-positions'라는 새 파일에 복제합니다. 'beads-positions' 파일의 모든 뷰에 대한 y 좌표를 'beads-y' 파일의 y 좌표로 바꿉니다. 이렇게 하면 비드가 동일한 수의 뷰, z-스택 및 x 좌표로 이미지화되지만 튜브의 다른 y 위치에 있습니다.
   8. 이미징 소프트웨어로 돌아가서 소프트웨어에 'bead-positions' 파일을 로드합니다. 시계열 옵션이 활성화된 경우 하나의 주기를 선택하고 실험을 시작합니다. 비드 이미지를 'beads'로 저장하면 이미지 처리 중에 다른 뷰를 등록하는 데 사용됩니다.
   9. 비드 이미지를 촬영한 후 위치를 지우고 소프트웨어에서 초기 'embryo-positions' 파일을 로드합니다. 적절한 시간 간격으로 원하는 사이클 수를 설정하고 실험을 시작합니다.

3. 멀티뷰 이미지 분석

참고: 멀티뷰 이미지를 융합하기 위해 멀티뷰 재구성 플러그인의 최신 버전인 FIJI 플러그인인 BigStitcher가 10,17,18로 사용됩니다. 플러그인은 '업데이트 사이트 관리' 기능에 BigStitcher 플러그인을 추가하여 설치할 수 있으며, '도움말' 메뉴의 '업데이트' 옵션에서 액세스할 수 있습니다. 설치가 완료되면 플러그인이 '플러그인' 메뉴 아래에 나타납니다. 융합과 관련된 광범위한 단계는 다음과 같습니다: (1) 비드와 배아 모두에 대해 .xml/.h5 파일 쌍을 정의합니다. (2) 모든 뷰를 비즈 파일로 등록합니다. (3) 디콘볼루션에 사용할 수 있는 비드에 대한 추출 포인트 확산 기능(PSF)(그림 2A); (4) beads 파일의 registration 및 PSF 정보를 embryo 파일로 전송하고 멀티뷰 디콘볼루션을 시작합니다. 이러한 단계들의 대부분은 이전에 세부적으로 설명되었던 단계들(²¹)에서 설명되었으며, 여기에서, 상이하게 처리되는 단계들이 설명된다.

1. .xml 데이터셋 정의
   1. 앞서 설명한 바와 같이 비드와 배아 모두에 대한 새 데이터 세트를 각각 'beads.xml' 및 'embryo.xml'로 정의합니다²¹.
2. Detection and registration using interest points(관심 포인트를 사용한 감지 및 등록)
   1. beads.xml 파일을 성공적으로 내보낸 후 'Multiview Explorer' 대화 상자에서 등록에 필요한 보기를 선택합니다(그림 2B). 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Detect Interest Points(관심 포인트 감지)를 선택합니다. ²¹에 설명된 대로 단계를 진행합니다.
   2. 관심 포인트를 감지한 후 모든 보기를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 Register using Interest Points(관심 포인트를 사용하여 등록)를 선택합니다. ²¹에 설명된 대로 프로토콜을 따릅니다.
   3. 비드 정합이 성공적으로 작동했는지 주의 깊게 확인하십시오. 성공적으로 정합하면 서로 다른 뷰의 겹치는 비드가 중첩됩니다(그림 2C). 정합이 얼마나 정확하게 이루어졌는지 확인하려면 두 개의 연속된 보기를 선택하고 겹치는 영역으로 이동한 다음 두 보기 사이를 전환하여 다른 각도에서 이미지화된 비드가 겹쳐지는지 관찰합니다. 모든 연속 뷰에 대해 이 작업을 반복합니다.
   4. 중복이 정확하지 않은 경우 등록에 필요한 중요도 및/또는 허용 가능한 중복 오류('등록' 대화 상자에서 'RANSAC 오류'라고 함)를 완화하여 등록을 다시 시도합니다.
   5. 등록에 성공하면 'Multiview Explorer' 창에서 저장 을 클릭하여 업데이트된 .xml 파일을 저장합니다.
      참고: 등록 효율성에 대한 자세한 정보가 포함된 로그 파일도 저장하십시오. 비드에서 배아로 등록 정보를 변환하려면 아래에 설명된 단계를 따르십시오.
   6. 선택한 텍스트 편집기에서 bead.xml 파일을 열고 "ViewRegistrations" 아래의 전체 블록을 복사합니다.
   7. embryo.xml 열고 "ViewRegistrations" 블록을 비즈 파일에서 복사한 블록으로 바꿉니다. 채널이 여러 개인 경우 위와 같이 각 채널에 대한 등록 정보를 바꿉니다. 등록 정보는 수동으로 전송하거나 여기에서 다운로드할 수 있는 사용자 지정 작성된 MATLAB 코드를 사용하여 전송할 수 있습니다 https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
   8. "BigStitcher"에서 embryo.xml 파일을 열고 배아에 대한 등록이 성공적으로 작동했는지 주의 깊게 확인하십시오. 두 개의 연속적인 보기마다 관심 있는 구조의 겹침을 확인하여 비드에 대해 수행한 것과 동일한 작업을 반복합니다.
      참고: 때때로, 비드가 완벽하게 등록되더라도 배아 등록이 바람직하지 않을 수 있습니다. 이는 비드가 이미징되는 위치에서 배아 위치까지 튜브 곡률에 약간의 변화가 있는 경우 가능합니다. 또한, 배아가 융모막 내에서 자유롭게 떠다니기 때문에 시야 사이에 배아의 미묘한 움직임이 있을 수 있습니다. 이 경우 배아에서 핵 마커를 사용하여 두 번째 등록을 수행합니다.
   9. 이렇게 하려면 "BigStitcher"에서 embryo.xml 파일을 열고 핵 마커가 있는 모든 뷰를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 관심 포인트 감지를 선택합니다.
   10. 관심 점의 이름을 'nuclei'로 바꾸고 비드에 대해 수행된 단계를 진행합니다.
   11. 'Difference of Gaussian' 매개변수를 설정하는 동안 전부는 아니더라도 대부분의 핵이 검출되고 이소성 핵 검출이 없는지 확인하십시오. 그런 다음 완료를 클릭합니다.
   12. 그런 다음 Register using Interest points(관심 포인트를 사용하여 등록 )를 선택하여 이러한 보기를 등록하고 Precise descriptor based (translation-invariant) 옵션을 선택합니다. '모든 보기 및 관심 포인트 비교' 옵션이 선택되어 있는지 확인하고 'nuclei'를 관심 포인트로 사용합니다. 첫 번째 뷰를 수정하는 옵션을 사용하고 다시 매핑하지 않습니다.
   13. 등록을 위해 플러그인에서 엄격한 정규화와 기본 매개변수가 있는 아핀 모델을 사용하십시오.
   14. 두 개의 연속적인 보기를 모두 비교하여 등록 성공 여부를 다시 확인합니다.
   15. 등록에 성공하면 'Multiview Explorer' 창에서 저장 을 클릭하여 업데이트된 .xml 파일을 저장합니다.
   16. 선택한 텍스트 편집기에서 embryo.xml 파일을 열고 핵 마커의 등록 정보를 다른 채널로 복사합니다.
3. 포인트 스프레드 기능 추출 및 할당
   1. 멀티뷰 디콘볼루션을 수행하려면 등록된 beads 데이터셋에서 이미징 시스템의 PSF를 추출하여 배아 파일에 적용하십시오.
   2. 이 정보를 얻으려면 비드 파일에서 모든 뷰를 선택한 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 포인트 스프레드 함수(Point Spread Functions ) 및 추출(Extract) 옵션을 선택합니다.
   3. 표시되는 대화 상자에서 Use Corresponding Interest points 및 Remove min intensity projections from PSF 가 선택되어 있는지 확인하고 기본 PSF 크기를 계속 진행한 다음 OK를 클릭합니다.
      참고: 모든 뷰에 대해 PSF 추출이 성공하면 로그 파일에 'Extracted n/n PSFs'가 표시됩니다.
   4. 그런 다음 .xml 파일을 다시 저장하십시오. 'Multiview Explorer' 대화 상자의 PSF 열에 체크된 체크박스가 나타나고, 추출된 모든 PSF와 함께 해당 폴더에 'psf' 폴더가 생성됩니다.
   5. embryo.xml 파일을 열고 각 보기에 대해 개별적으로 PSF를 할당합니다. "a view"→를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Point Spread Functions를 클릭한 → Assign을 선택한 → Advanced를 선택한 다음 선택한 모든 뷰에 새 PSF를 Assign new PSF를 차례로 선택합니다. 찾아보기를 클릭하고 .xml 파일 경로로 이동한 다음 psf 폴더를 엽니다.
   6. 선택한 보기에서 해당 ID와 일치하는 PSF를 선택하고 OK를 클릭하면 PSF 확인란이 'Multiview Explorer' 창에 체크 표시되어 나타납니다.
   7. 다른 모든 뷰에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
4. 멀티뷰(Multiview) 융합 및 디콘볼루션(deconvolution)
   1. 모든 뷰에 포인트 스프레드 기능을 할당한 후 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Multiview Deconvolution을 선택합니다.
   2. 경계 상자를 현재 선택된 뷰로 선택합니다. 이 작업에서는 기본 OSEM 가속 및 반복 횟수가 잘 작동합니다.
   3. 더 빠른 계산이 필요하거나 CPU 메모리가 제한되는 경우 필요에 따라 이미지를 다운샘플링합니다.
      참고: 필요한 RAM이 기존 메모리를 초과하면 창 하단에 빨간색 경고 오류 메시지가 나타납니다. 이 경고가 나타나면 플러그인이 처리 중 어느 시점에서 멈추고 응답을 중지하므로 디콘볼루션을 시작하지 마십시오.
   4. 디콘볼루션의 진행 상황을 평가하려면 5회 반복마다 결과를 표시하는 로그 파일을 확인합니다.
   5. 계산 속도를 높이려면 GPU가 이전에 설치된 경우 GPU에서 멀티뷰 디콘볼루션을 수행합니다.
      참고: 이 과정이 끝나면 tiff 파일로 저장할 수 있는 융합 이미지 창이 나타납니다.

결과

정확한 방식으로 샘플의 방향을 지정하는 것은 현미경 설정을 효율적으로 사용하는 데 있어 중요한 부분입니다. 그러나 튜브에서 샘플을 준비해야 하는 요구 사항을 감안할 때 멀티뷰 라이트 시트 시스템을 사용할 때 샘플의 방향을 수동으로 지정하는 것이 불가능한 경우가 많습니다. 따라서 배아가 융모막 내에서 차지하는 정형화된 위치가 있는지 확인하기 위해 제브?...

토론

관심 영역을 이미지화하기 위해 배아를 올바른 방향으로 배치하는 것은 종종 사용자의 현미경 세션 실패를 초래하는 속도 제한 단계 중 하나입니다. 이는 샘플이 튜브 내에 내장되어 있기 때문에 방향을 수동으로 조작하기 어려운 멀티뷰 광시트 현미경에서 더욱 그렇습니다. 이 과정을 돕기 위해 이 연구는 배아가 있는 고분자 튜브가 미세 원심분리기 튜브에 똑바로 세?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Calcium Chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Version: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspension	Sigma-Aldrich	L3280
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	ThermoFischer Scientific	AM1340	For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05	Adtech Innovations in Fluoroplastics	STW15	PTFE tubes
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640
Ultrasonic Cleaner	Labman	LMUC3	Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 System	Zeiss