Imagem de microscopia de folha de luz e estratégias de montagem para embriões iniciais de peixe-zebra

Resumo

Uma estratégia de preparação de amostras para imagens de embriões iniciais de peixe-zebra dentro de um córion intacto usando um microscópio de folha de luz é descrita. Ele analisa as diferentes orientações que os embriões adquirem dentro do córion nos estágios de 70% de epibólia e gema e detalha estratégias de imagem para obter resolução em escala celular em todo o embrião usando o sistema de folha de luz.

Resumo

A microscopia de folha de luz tornou-se a metodologia de escolha para imagens ao vivo de embriões de peixe-zebra em longas escalas de tempo com fototoxicidade mínima. Em particular, um sistema multiview, que permite a rotação da amostra, permite a obtenção de imagens de embriões inteiros de diferentes ângulos. No entanto, na maioria das sessões de imagem com um sistema multiview, a montagem da amostra é um processo problemático, pois as amostras geralmente são preparadas em um tubo de polímero. Para auxiliar nesse processo, este protocolo descreve estratégias básicas de montagem para imagens do desenvolvimento inicial do peixe-zebra entre os estágios de 70% de epicolia e somite inicial. Especificamente, o estudo fornece estatísticas sobre as várias posições padrão dos embriões nos estágios de 70% de epibólio e botão dentro do córion. Além disso, discute o número ideal de ângulos e o intervalo entre os ângulos necessários para a obtenção de imagens de embriões inteiros de peixe-zebra nos estágios iniciais de desenvolvimento, para que as informações em escala celular possam ser extraídas pela fusão das diferentes visualizações. Finalmente, como o embrião cobre todo o campo de visão da câmera, que é necessário para obter uma resolução em escala celular, este protocolo detalha o processo de uso de informações de esferas de cima ou de baixo do embrião para o registro das diferentes visualizações.

Introdução

Garantir o mínimo de fototoxicidade é um requisito importante para a obtenção de imagens de embriões vivos com alta resolução espaço-temporal por longos períodos. Na última década, a microscopia de folha de luz tornou-se a metodologia de escolha para atender a esse requisito 1,2,3,4,5,6,7. Resumidamente, nesta técnica que foi usada pela primeira vez em 2004 para capturar processos de desenvolvimento

Protocolo

A manutenção do peixe-zebra e os procedimentos experimentais utilizados neste estudo foram aprovados pelo comitê institucional de ética animal, vide Referência TIFR/IAEC/2023-1 e TIFR/IAEC/2023-5. Embriões obtidos pelo cruzamento de peixes heterozigotos expressando Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)¹⁹ foram injetados com mRNA H2A-mCherry (30 pg) no estágio unicelular. O mRNA de H2A-mCherry foi sintetizado usando o plasmídeo pCS2+ H2A-mCherry (um presente do laboratório de Oates, EPFL) por transcrição in vitro . Embriões que expressam ambos os marcadores, referidos como Utr-GFP e H2A-mCherry, respectivamen....

Discussão

Posicionar um embrião na orientação correta para obter imagens da região de interesse é uma das etapas de limitação de taxa que geralmente resulta em uma sessão de microscopia com falha para um usuário. Isso é mais verdade em um microscópio de folha de luz multiview, onde a manipulação manual da orientação é difícil, pois as amostras são incorporadas em um tubo. Para auxiliar nesse processo, este estudo relata as estatísticas de várias posições que um embrião de pe.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Calcium Chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Version: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspension	Sigma-Aldrich	L3280
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	ThermoFischer Scientific	AM1340	For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05	Adtech Innovations in Fluoroplastics	STW15	PTFE tubes
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640
Ultrasonic Cleaner	Labman	LMUC3	Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 System	Zeiss