Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Özet

Erken zebra balığı embriyolarının bir ışık tabakası mikroskobu kullanılarak bozulmamış bir koryon içinde görüntülenmesi için bir örnek hazırlama stratejisi açıklanmaktadır. Embriyoların %70 epiboli ve tomurcuk aşamalarında koryon içinde edindiği farklı yönelimleri analiz eder ve ışık tabakası sistemini kullanarak embriyo boyunca hücresel ölçekte çözünürlük elde etmek için görüntüleme stratejilerini detaylandırır.

Özet

Işık tabakası mikroskobu, zebra balığı embriyolarının minimum fototoksisite ile uzun zaman ölçeklerinde canlı görüntülenmesi için tercih edilen metodoloji haline gelmiştir. Özellikle, numune rotasyonuna izin veren bir çoklu görüntüleme sistemi, tüm embriyoların farklı açılardan görüntülenmesini sağlar. Bununla birlikte, çoklu görüntüleme sistemine sahip çoğu görüntüleme oturumunda, numuneler genellikle bir polimer tüp içinde hazırlandığından, numune montajı zahmetli bir süreçtir. Bu sürece yardımcı olmak için bu protokol, %70 epiboli ve erken somit aşamaları arasındaki erken zebra balığı gelişimini görüntülemek için temel montaj stratejilerini açıklar. Spesifik olarak, çalışma, embriyoların koryon içindeki% 70 epiboli ve tomurcuk aşamalarında varsayılan olarak bulunduğu çeşitli pozisyonlar hakkında istatistikler sağlar. Ayrıca, gelişimin erken aşamalarında bütün zebra balığı embriyolarını görüntülemek için gereken optimum açı sayısını ve açılar arasındaki aralığı tartışır, böylece hücresel ölçekli bilgiler farklı görünümleri birleştirerek çıkarılabilir. Son olarak, embriyo, hücresel ölçekte bir çözünürlük elde etmek için gerekli olan kameranın tüm görüş alanını kapsadığından, bu protokol, farklı görünümlerin kaydedilmesi için embriyonun üstünden veya altından boncuk bilgilerinin kullanılması sürecini detaylandırır.

Giriş

Minimal fototoksisitenin sağlanması, uzun süreler boyunca yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip canlı embriyoların görüntülenmesi için önemli bir gerekliliktir. Son on yılda, ışık tabakası mikroskobu bu gereksinimi karşılamak için tercih edilen metodoloji haline gelmiştir 1,2,3,4,5,6,7. Kısaca ilk kez 2004 yılında gelişimsel süreçleri yakalamak için kullanılan bu teknikte⁸, embriyonun içinden karşılıklı uçlardan hizalanmış ince iki lazer tabakası geçerek sadece ilgilenilen düzlemi aydınlatır. Bir algılama hedefi ortogonal olarak yerleştirilir ve ardından numunedeki tüm aydınlatılmış noktalardan yayılan floresan ışık aynı anda toplanır. Daha sonra embriyonun statik ışık tabakası boyunca sırayla hareket ettirilmesiyle bir 3D görüntü elde edilir.

Ek olarak, bu metodolojinin çoklu görüntü ışık tabakası mikroskobu olarak adlandırılan özel bir biçiminde, numuneler, aynı embriyonun birden fazla açıdan görüntülenmesini sağlayan bir rotor kullanılarak döndürülebilen bir polimer tüp içinde askıya alınabilir ^9,10,11. Görüntülemeyi takiben, çoklu açılardan gelen görüntüler, tipik olarak embriyo içinde (örneğin, çekirdekler) veya tüpte (örneğin, floresan boncuklar) küresel floresan belirteçler olan kayıt belirteçlerine dayalı olarak birleştirilir. Çoklu görüntüleme görüntüleme ve füzyon, eksenel çözünürlüğü önemli ölçüde iyileştirerek her üç boyutta^{da izotropik çözünürlük sağlar 12}. Bu büyük bir avantaj olsa da, çoklu görüntüleme metodolojisinin en büyük zorluğu, embriyoların tüm görüntüleme süresi boyunca tüplere monte edilmesi ve yerinde tutulması gereken numune montajıdır.

Çok görüntülü görüntüleme yapmak, embriyoları yerinde tutmak ve görüntüleme sırasında hareketi önlemek için embriyolar agaroz içine gömülebilir. Bununla birlikte, bu genellikle, özellikle burada tartışılan model sistem olan erken evre zebra balığı embriyoları¹³ için zararlı büyüme ve gelişmeye yol açar. İkinci bir montaj stratejisi, embriyonun çapından sadece biraz daha büyük olan ince bir tüp kullanmaktır, burada embriyo, embriyo ortamı ile birlikte tüpe çekilebilir, ardından tüpün altını bir agaroz tıkaç¹⁴ ile kapatmaktır. Bu yöntemde, tüp embriyo ortamı ile doldurulduğundan, farklı görünümlerin füzyonu için floresan boncuklar gibi kayıt belirteçleri kullanılamaz ve bu nedenle kayıt, embriyo içindeki belirteçlere bağlıdır. Genel olarak, boncuklar, herhangi bir mikroskobun hem aydınlatma hem de algılama sınırlamaları nedeniyle, embriyo içindeki belirteçlerin sinyali, numunenin daha derinlerine inildiğinde bozulduğunda daha iyi kayıt belirteçleri olarak işlev görür.

Bu nedenle, burada detaylandırılacak olan ve daha önce ^{5,13,14,15,16} kullanılan üçüncü bir yaklaşım, erken zebra balığı embriyolarının sağlam bir koryon ile görüntülenmesi ve tüpün, kayıt belirteçleri olarak boncuklar içeren minimum oranda agaroz ile doldurulmasıdır. Bu senaryoda, embriyoları bir koryon içinde konumlandırmak için manuel müdahale mümkün olmadığından, bu çalışma, özellikle %70 epiboli ve tomurcuk aşamalarına odaklanarak, erken zebra balığı embriyolarının düştüğü varsayılan yönelim hakkında istatistikler sağlar. Daha sonra, erken evre embriyoları hücresel ölçekte çözünürlükte görüntülemek için gereken en uygun görüntüleme sayısını tartışır ve FIJI tabanlı bir eklenti^olan BigStitcher'ı kullanarak füzyon sürecini detaylandırır 10,17,18. Birlikte, 20x/1 NA objektifi kullanan bu protokol, zebra balığı embriyologlarının, gastrulasyondan erken somit evrelerine kadar çekirdek ve zar belirteçleri olan embriyoları görüntülemek için çok görüntülü ışık tabakası sistemlerini kullanmalarını kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan zebra balığı bakım ve deneysel prosedürleri, kurumsal hayvan etik komitesi tarafından onaylanmıştır, vide Referans TIFR/IAEC/2023-1 ve TIFR/IAEC/2023-5. Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)¹⁹ eksprese eden heterozigot balıkların çaprazlanmasıyla elde edilen embriyolara tek hücreli aşamada H2A-mCherry mRNA (30 pg) enjekte edildi. H2A-mCherry mRNA, in vitro transkripsiyon ile pCS2+ H2A-mCherry plazmidi (Oates laboratuvarı, EPFL'den bir hediye) kullanılarak sentezlendi. Protokolün geri kalanında sırasıyla Utr-GFP ve H2A-mCherry olarak adlandırılan her iki belirteci de eksprese eden embriyolar,% 70 epiboli ve tomurcuk aşamalarında görüntülendi. Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Çoklu görüntüleme için numune hazırlama

1. FEP/PTFE tüplerin hazırlanması
   1. FEP/PTFE tüplerini daha önce açıklanan prosedürleri izleyerek temizleyin¹⁴.
   2. Temizledikten sonra, tüpleri ihtiyaca göre 2-2,5 cm uzunluklarda kesin ve çift distile su içeren 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde saklayın. Tüpler bu şekilde yaklaşık bir ay saklanabilir.
   3. Numune hazırlamadan önce, tüpleri düzleştirmek için tüpleri 70-75 °C'de yaklaşık 25 dakika ısıtın. Topaklanmayı önlemek için her bir mikrosantrifüj tüpünde aşırı kalabalıktan kaçının ve etkili tüp düzleştirme için yeterli alan sağlayın.
      NOT: Tüpler üzerinde kalan herhangi bir parmak izi/toz parçacığı görüntülemeyi engelleyebileceğinden, tüm tüp taşıma prosedürü boyunca eldiven giyin.
2. Agaroz hazırlanması
   1. E3 tampon 50x stok çözeltilerini aşağıdaki gibi hazırlayın:
      1. Stok 1 - 3.252 g Na₂HPO₄, 0.285 g KH₂PO₄, 11.933 g NaCl, 0.477 g KCl 1 L deiyonize su
      2. Stok 2 - 2.426 g CaCl₂, 1 L deiyonize suda 4.067 g MgS04.
   2. 1x E3 tamponu yapmak için, 960 mL deiyonize suya stok 1 ve 2 çözeltilerinin her birine 20 mL ekleyin.
      NOT: Işığın saçılmasına neden olduğu için görüntüleme için kullanılan E3 tamponuna metilen mavisi eklemeyin.
   3. Düşük erime noktalı agarozu, bir ısı bloğu üzerinde 70-75 °C'de ısıtarak 1x E3 içinde çözün ve çözelti topak veya kristal olmadan berraklaşana kadar karıştırın.
   4. Çok görüntülü görüntüleme için, analiz sırasında görüntü kaydını sağlayan agaroz çözeltisine ticari olarak temin edilebilen floresan boncuklar ( Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin. Boncukları ayırmak için bir su banyosu ultrasonicator'da 20-30 dakika boyunca 40 kHz frekansında boncukları oda sıcaklığında sonikasyon.
   5. Sonikasyondan sonra, 15 mL'lik bir tüpte 10 mL agaroz çözeltisine 1 μL boncuk ekleyin ve boncukların düzgün dağılmasını sağlamak için tüpü iyice vorteksleyin.
      NOT: Agaroza eklenecek boncuk çözeltisinin hacmi, stok çözeltisine ve üreticiye bağlıdır. Bir dizi hacim deneyin ve hafif levha sisteminde görüntülendiğinde boncukların iyi dağılmış göründüğü bir konsantrasyon seçin. Sonikasyon ve girdaplamaya rağmen çok fazla boncuk toplanabilirken, çok az boncuk görüntü kaydını etkileyebilir.
   6. Eklenen boncuklarla birlikte agaroz tüpünü, numune hazırlamadan önce en az 30 dakika boyunca 37 °C'de tutulan kapalı bir su banyosunda tutun. Bu, agarozun sıcaklığının 70 °C'den 37 °C'ye düşmesini sağlar.
3. Numune hazırlama
   1. Görüntüleme gününden önceki akşam balıkları bölücülerle çiftler halinde yerleştirin. Bölücüleri yaklaşık 15 dakika çıkarın ve standart prosedür^20'yi kullanarak embriyoları toplayın.
   2. Embriyolar numune hazırlama aşamasına geldiğinde, 37 ° C'de tutulan 10 mL agarozun tamamını (boncuklu) 6 cm'lik bir Petri kabına dökün.
   3. 10 ila 15 embriyoyu agaroz çözeltisine aktarmadan önce sıcaklığın 33 ° C'nin altına düşmesi için yaklaşık 2-3 dakika bekleyin.
      NOT: Bu, agaroza transfer edilen embriyolara olası bir ısı şokunu önlemek için önemli bir adımdır.
   4. Embriyoları transfer ederken agaroz çözeltisine mümkün olduğunca az E3 tamponu eklendiğinden emin olun. Petri kabını, aktarılacak olan küçük tamponun iyice dağılması için döndürün.
   5. Numune hazırlama prosedürünün geri kalanında eldiven giyin.
   6. Uygun bir pipet ucu ile 200 μL'lik bir mikropipet alın ve mikrosantrifüj tüpünden çıkarılan temizlenmiş düz bir tüpü Şekil 1A,B'de gösterildiği gibi pipet ucuna yerleştirin.
   7. Tüpe biraz agaroz aspire edin, ardından mikropipet kullanarak 2-3 embriyo elde edin (Şekil 1C,D). Embriyoların tüpün dibine yakın olduğundan emin olun (Şekil 1E), bu görüntüleme yapılırken önemli hale gelecektir. Ayrıca, farklı embriyolar arasında biraz agaroz olduğundan emin olun (Şekil 1E), böylece bu bölgedeki boncuklar kayıt belirteçleri olarak kullanılabilir.
   8. Pipetteki basıncı serbest bırakmadan, tüpü pipet ucundan ayırın ve agarozun katılaşması için E3 ile doldurulmuş petri kabının kapağına yerleştirin (Şekil 1F).
   9. Petri kabındaki tüm embriyolar tüplere aktarılana kadar 1.3.6 ila 1.3.8 arasındaki adımları tekrarlayın.
   10. Agaroz katılaştıktan sonra (5-10 dakika sürebilir ve Petri kabındaki agaroz kontrol edilerek doğrulanabilir), tüpleri E3 ile doldurulmuş 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın (Şekil 1G).
   11. Çoklu görüntülemeye geçmeden önce, embriyoların bulunduğu tüpleri gerektiği gibi 28 °C veya 33 °C'lik bir inkübatörde saklayın.

2. Çoklu görüntüleme görüntüleme

NOT: Bu adım, zebra balığı embriyolarının erken gelişim aşamalarında çoklu görüntüleme için genel bir prosedür sunar. Aşağıda ayrıntıları verilen yöntem, herhangi bir çoklu görüntü ışık tabakası mikroskobu sistemine kolayca uyarlanabilir.

1. Embriyonun yerinin belirlenmesi
   NOT: Mikroskobun numune haznesini embriyo ortamı²⁰ ile doldurun ve numune haznesinin sıcaklığını, görüntülemeden en az 10 dakika önce ilgilenilen sıcaklığa ayarlayın.
   1. Numune tutucuyu daha önce^{açıklandığı gibi 21} monte edin, ancak bir değişiklikle. Görüntüleme tüp içinden yapılacağı için, embriyoların bulunduğu tüpü, agarozu dışarı itmeden ve alttaki embriyoları rahatsız etmeden yerinde tutulacak şekilde doğrudan doğru çaptaki bir kılcal damara yerleştirin (Şekil 1H).
      NOT: Numune haznesi tanımlanmış bir yüksekliğe sahip olduğundan, numune hazırlama sırasında embriyoların tüpün dibine doğru yerleştirildiğinden emin olmak (adım 1.3.7'de belirtildiği gibi), embriyonun odanın tabanına çarpmadan görüş alanına yerleştirilmesini sağlayacaktır.
   2. Numune tutucuyu çoklu görüntüleme sistemine yerleştirin ve embriyoyu görüş alanının merkezine getirmek için x ve y kontrollerini kullanın.
   3. Daha sonra embriyoyu odak noktasına getirmek için örnek navigatörünün z kontrolünü kullanın.
   4. Bu noktada, embriyonun koryon içindeki oryantasyonu açıkça görülecektir ve tatmin edici değilse, yeni bir tüp yerleştirin ve ilgilenilen bir oryantasyona sahip embriyoyu seçin.
2. Işık levhalarının hizalanması
   1. Embriyo yerleştirildikten sonra, tüm deneysel ayarları ayarlayın - lazerler, ışık yolu, filtre, ışın ayırıcı ve kamera.
   2. Alım parametrelerini ayarlarken, yazılım pivot tarama için bir seçenek sunuyorsa, onu seçin. Bir pivot taraması, numunedeki herhangi bir yapı veya opak bölgeyle karşılaştığında ışık tabakasından çıkan gölgeleme etkisini azaltacaktır.
   3. Numunenin canlı taramasını başlatın. Işık tabakasının kalınlığını ve dolayısıyla eksenel çözünürlüğü belirleyecek olan bit boyutunu, lazer gücünü ve istenen yakınlaştırmayı ayarlayın.
   4. Işık levhalarını hizalamak için önce tek taraflı aydınlatmaya geçin ve iki ışık levhasının (sol ve sağ) ayarlarını sırayla değiştirin. Numunenin net ilgi yapılarının görülebildiği bir bölgesine dijital olarak yakınlaştırın.
      NOT: Bu çalışmada, tabakaları hizalamak için bir nükleer (H2A-mCherry) veya bir membran (Utr-GFP) işaretleyici kullanılmıştır. İlgili bölgede en keskin sinyal kontrastının elde edilmesi için yazılımdaki ışık sayfası ayarlarının değiştirilmesi önerilir.
   5. En iyi sinyali elde etmek için iki ışık levhası ayrı ayrı optimize edildikten sonra, her iki ışık levhasını da açın. İkinci bir hizalama turu gerçekleştirin ve titremenin minimum düzeyde olduğundan emin olun, bu da iki sayfanın oldukça iyi hizalandığını gösterir.
   6. Hizalama yapıldıktan sonra, yazılım izin veriyorsa, iki sayfa tarafından oluşturulan görüntüleri otomatik olarak birleştirme seçeneğini etkinleştirin. Alternatif olarak, önce numunenin etrafındaki boncuklara odaklanarak hafif tabakaları kaba bir şekilde hizalayabilir ve ardından numuneden gelen bilgileri kullanarak hizalamada ince ayar yapılabilir.
      NOT: İki florofor (nükleer ve membran belirteçleri gibi) ile görüntüleme yaparken, optimal hizalama genellikle iki yapı için marjinal olarak farklıdır. Bu senaryoda, aşağı akış işlemedeki kısıtlamalara dayalı bir ayar seçin. Örneğin, hücre sınırları bölümlere ayrılacaksa, ki bu nispeten daha yoğun işlem gerektirir, ışık tabakalarını zar işaretleyicisine göre hizalayın.
3. Çoklu görüntüleme görüntülemeyi ayarlama
   1. Işık levhalarını hizaladıktan sonra, çoklu görüntüleme görüntülemenin yanı sıra z-stack gerçekleştirme seçeneklerini etkinleştirin.
   2. Canlı taramayı başlatın ve ilk görünümü seçmek için numune navigatörünü kullanarak gezinin. Bu görünümde, dilim aralığını ve ardından z yığınının ilk ve son dilimlerini ayarlayın. Bu konumu, bu görünüm için konum ve z yığını bilgilerini not alan çoklu görünüm iletişim kutusuna ekleyin.
   3. Numune gezginindeki açıyı değiştirerek bir sonraki görünüme geçin. İkinci görünüm için z-stack'i ayarlayın ve bilgileri çoklu görüntü iletişim kutusuna ekleyin.
   4. Ek görünümler için de aynısını tekrarlayın.
      NOT: Farklı görünümler arasında yeterli örtüşme olması için her görünümde belirli bir minimum sayıda dilimin görüntülendiğinden emin olun, bu da işleme sırasında görünümlerin kaydedilmesine yardımcı olur. Minimum dilim sayısı, yakınlaştırma faktörünün yanı sıra görüntüleme için seçilen açı sayısına da bağlı olacaktır.
   5. Tüm görünümleri ayarladıktan sonra, bu bilgileri, z-yığını bilgilerini, tüpün (x, y, z) koordinatlarını ve her görünüm için açı özelliklerini içerecek bir metin dosyasına (örneğin 'embriyo pozisyonları' olarak adlandırılır) kaydedin. Kaydettikten sonra, çoklu görüntü iletişim kutusundan tüm konumları temizleyin.
   6. Görüntüleme nispeten büyük olan sağlam bir koryon ile yapıldığından, tüp içindeki boncukları aynı ayarlarla görüntülemek mümkün değildir. Bu nedenle, boncuk bilgisinin tüp içinde farklı bir konumdan elde edilmesi gerekir. Bunu yapmak için, boncukların göründüğü embriyodan uzakta farklı bir 'y' koordinatına çevirin. Bu konumu çoklu görüntü iletişim kutusuna ekleyin ve bu konumu bir metin dosyasına kaydedin (örneğin, 'beads-y' olarak adlandırılır).
      NOT: İki pozisyondaki tüp eğriliğindeki olası farklılıkların etkilerini en aza indirmek için boncukları embriyo örneğine mümkün olduğunca yakın görüntüleyin. Bu nedenle, tüpe birden fazla embriyo monte edilmişse, boncukları oluşturmak için tüpler arasında biraz agaroz bırakmak önemlidir (adım 1.3.7'de belirtildiği gibi).
   7. Metin dosyalarının kaydedildiği klasöre gidin ve 'embriyo pozisyonları' dosyasını 'boncuk pozisyonları' adlı yeni bir dosyaya çoğaltın. 'beads-positions' dosyasındaki tüm görünümler için y koordinatını 'beads-y' dosyasındaki y koordinatıyla değiştirin. Bu, boncukların aynı sayıda görünüm, z-yığını ve x-koordinatlarıyla, ancak tüpte farklı bir y konumunda görüntülenmesini sağlayacaktır.
   8. Görüntüleme yazılımına geri dönün ve yazılıma 'boncuk pozisyonları' dosyasını yükleyin. Zaman serisi seçeneği etkinleştirilirse, bir döngü seçin ve denemeyi başlatın. Boncuk görüntülerini, görüntü işleme sırasında farklı görünümleri kaydetmek için kullanılacak olan 'boncuklar' olarak kaydedin.
   9. Boncuk görüntülerini çektikten sonra, pozisyonları temizleyin ve yazılıma ilk 'embriyo pozisyonları' dosyasını yükleyin. İstenilen döngü sayısını uygun bir zaman aralığı ile ayarlayın ve deneyi başlatın.

3. Çoklu görüntü analizi

NOT: Çoklu görüntüleme görüntülerini kaynaştırmak için, Çoklu Görüntü Yeniden Yapılandırma eklentisinin en son sürümü olan bir FIJI eklentisi olan BigStitcher kullanılır 10,17,18. Eklenti, 'Yardım' menüsü altındaki 'Güncelle' seçeneğinden erişilebilen 'Güncelleme Sitelerini Yönet' işlevine BigStitcher eklentisi eklenerek yüklenebilir. Eklenti kurulduktan sonra 'Eklentiler' menüsü altında görünecektir. Füzyonda yer alan geniş adımlar aşağıdaki gibidir: (1) Hem boncuklar hem de embriyolar için .xml/.h5 dosya çiftlerini tanımlayın; (2) Tüm görünümleri boncuk dosyasıyla kaydedin; (3) Dekonvolüsyon için kullanılabilen boncuklar için Ekstraksiyon Noktası Yayılma Fonksiyonu (PSF) (Şekil 2A); (4) Kayıt ve PSF bilgilerini boncuk dosyasından embriyo dosyasına aktarın ve çoklu görüntü evrişimini başlatın. Bu adımların çoğu daha önce ayrıntılı^{olarak açıklanmıştır 21} ve burada farklı şekilde işlenen adımlar açıklanmaktadır.

1. .xml veri kümesi tanımlama
   1. Daha önce açıklandığı gibi hem boncuklar hem de embriyo için sırasıyla 'beads.xml' ve 'embryo.xml' olarak yeni bir veri seti tanımlayın²¹.
2. İlgi alanlarını kullanarak tespit ve kayıt
   1. beads.xml dosyasının başarılı bir şekilde dışa aktarılmasının ardından, 'Çoklu Görünüm Gezgini' iletişim kutusunda kayıt için gerekli olan görünümleri seçin (Şekil 2B). Sağ tıklayın ve İlgi Alanlarını Algıla'yı seçin. Açıklanan adımlara^{devam edin 21}.
   2. İlgi alanlarını belirledikten sonra, tüm görünümleri seçin, sağ tıklayın ve İlgi Alanı Puanlarını Kullanarak Kaydol'u seçin. Açıklanan protokolü izleyin²¹.
   3. Boncuk kaydının başarıyla çalışıp çalışmadığını dikkatlice kontrol edin. Başarılı bir kayıttan sonra, farklı görünümlerden üst üste binen boncuklar üst üste bindirilir (Şekil 2C). Kaydın ne kadar hassas bir şekilde çalıştığını kontrol etmek için, art arda iki görünüm seçin, çakışan bölgeye gidin ve farklı açılardan görüntülenen boncukların üst üste bindirilip bindirilmediğini gözlemlemek için iki görünüm arasında geçiş yapın. Bunu art arda her görünüm için tekrarlayın.
   4. Çakışma kesin değilse, kayıt için gereken önemi ve/veya kabul edilebilir çakışma hatasını ('Kayıt' iletişim kutusunda 'RANSAC hatası' olarak adlandırılır) gevşeterek kaydı yeniden deneyin.
   5. Başarılı bir kaydın ardından, güncellenmiş .xml dosyasını kaydetmek için 'Multiview Explorer' penceresinde Kaydet'e tıklayın.
      NOT: Kayıt verimliliği hakkında daha ayrıntılı bilgi içerdiğinden günlük dosyasını da kaydedin. Kayıt bilgilerini boncuklardan embriyoya çevirmek için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
   6. bead.xml dosyasını tercih ettiğiniz bir metin düzenleyicide açın ve tüm bloğu "ViewRegistrations" altında kopyalayın.
   7. embryo.xml açın ve "ViewRegistrations" bloğunu boncuk dosyasından kopyalanan blokla değiştirin. Birden fazla kanal varsa, her kanal için kayıt bilgilerini yukarıdaki gibi değiştirin. Kayıt bilgileri manuel olarak veya buradan indirilebilen özel olarak yazılmış MATLAB kodu kullanılarak aktarılabilir: https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
   8. embryo.xml dosyasını "BigStitcher"da açın ve kaydın embriyo için başarıyla çalışıp çalışmadığını dikkatlice kontrol edin. Her iki ardışık görünümde ilgilenilen yapıların örtüşmesini kontrol ederek boncuklar için yapılanın aynısını tekrarlayın.
      NOT: Bazen, boncukların mükemmel bir şekilde kaydedilmesine rağmen embriyo kaydı arzu edilen kadar olmayabilir. Bu, boncukların görüntülendiği pozisyondan embriyo pozisyonuna kadar tüp eğriliğinde küçük değişiklikler varsa mümkündür. Ek olarak, koryon içinde serbestçe yüzdüğü için embriyonun görünümler arasında ince hareketleri olabilir. Bu durumda, embriyoda bir nükleer belirteç kullanarak ikinci bir kayıt turu gerçekleştirin.
   9. Bunu yapmak için, embryo.xml dosyasını "BigStitcher"da açın, nükleer işaretleyiciye sahip tüm görünümlere sağ tıklayın ve İlgi Noktalarını Tespit Et'i seçin.
   10. İlgi noktalarını 'çekirdek' olarak yeniden adlandırın ve boncuklar için gerçekleştirilen adımlara devam edin.
   11. 'Gauss Farkı' parametrelerini ayarlarken, çekirdeğin tamamının olmasa da çoğunun tespit edildiğinden ve ektopik nükleer tespit olmadığından emin olun. Ardından, Bitti'ye tıklayın.
   12. Bunu takiben, İlgi Alanlarını kullanarak kaydol'u seçerek bu görünümleri kaydedin ve Kesin tanımlayıcı tabanlı (çeviri değişmez) seçeneğini seçin. 'Tüm görüntülemeleri ve ilgi noktalarını karşılaştır' seçeneğinin seçili olduğundan emin olun ve ilgi noktası olarak 'çekirdekler' kullanın. İlk görünümü düzeltme seçeneğini kullanın ve geri eşlemeyin.
   13. Kayıt için, katı düzenlemeli bir afin model ve eklentideki varsayılan parametreler kullanın.
   14. Her iki ardışık görünümü karşılaştırarak kaydın başarısını yeniden kontrol edin.
   15. Başarılı bir kaydın ardından, güncellenmiş .xml dosyasını kaydetmek için 'Multiview Explorer' penceresinde Kaydet'e tıklayın.
   16. embryo.xml dosyasını tercih ettiğiniz bir metin düzenleyicide açın ve kayıt bilgilerini nükleer belirteçlerden diğer kanallara kopyalayın.
3. Nokta yayılma fonksiyonu çıkarma ve atama
   1. Çoklu görüntü dekonvolüsyonunu gerçekleştirmek için, görüntüleme sisteminin PSF'sini kayıtlı boncuk veri setinden çıkarın ve embriyo dosyasına uygulayın.
   2. Bu bilgileri almak için, boncuk dosyasındaki tüm görünümleri seçin ve ardından sağ tıklatıp Nokta Yayılma İşlevleri ve Ayıkla seçeneklerini belirleyin.
   3. Görünen iletişim kutusunda, Karşılık Gelen İlgi Noktalarını Kullan ve PSF'den minimum yoğunluk projeksiyonlarını kaldır seçeneklerinin işaretli olduğundan emin olun, varsayılan PSF boyutlarıyla ilerleyin ve Tamam'a tıklayın.
      NOT: PSF ayıklama işlemi tüm görünümler için başarılı olursa, günlük dosyasında 'Çıkarılan n/n PSF'ler' görüntülenir
   4. Bunu takiben, .xml dosyasını yeniden kaydedin. 'Multiview Explorer' iletişim kutusunun PSF sütununda işaretli bir onay kutusu görünecek ve çıkarılan tüm PSF'lerle birlikte ilgili klasörde bir 'psf' klasörü oluşturulacaktır.
   5. embryo.xml dosyasını açın ve her görünüm için PSF'yi ayrı ayrı atayın. "Bir görünüme" sağ tıklayın → Nokta Yayılma İşlevleri'ne tıklayın → Ata'yı seçin → Gelişmiş'i seçin, ardından Tüm seçili görünümlere yeni PSF ata'yı seçin. Gözat'a tıklayın, .xml dosya yoluna gidin ve psf klasörünü açın.
   6. Seçilen görünümde karşılık gelen kimliğe sahip eşleşen PSF'yi seçin ve Tamam'a tıklayın, ardından 'Çoklu Görünüm Gezgini' penceresinde PSF onay kutusu işaretli olarak görünecektir.
   7. Diğer tüm görünümler için işlemi tekrarlayın.
4. Çoklu görüntü füzyonu ve evrişim çözme
   1. Tüm görünümler için nokta yayılma işlevi atandıktan sonra, sağ tıklayın ve Çoklu Görüntü Evrişimini Çözme'yi seçin.
   2. Sınırlayıcı kutuyu şu anda seçili görünümler olarak seçin. Bu iş için, varsayılan OSEM hızlandırması ve yineleme sayısı iyi çalışır.
   3. Daha hızlı hesaplama isteniyorsa veya CPU belleği sınırlanıyorsa görüntüleri gerektiği gibi alt örnekleyin.
      NOT: Gerekli RAM mevcut belleği aşarsa, pencerenin altında kırmızı renkli bir uyarı hata mesajı açılır. Bu uyarı açılırsa evrişimi kaldırmayı başlatmayın, çünkü eklenti işleme sırasında bir noktada duracak ve yanıt vermeyi durduracaktır.
   4. Evrişimin ilerlemesini değerlendirmek için, her 5 yinelemede bir sonuçları görüntüleyecek olan günlük dosyasını kontrol edin.
   5. Hesaplama hızını artırmak için, daha önce kuruluysa GPU'da çoklu görüntü evrişimini çözme işlemi gerçekleştirin.
      NOT: Bu işlemin sonunda, tiff dosyası olarak kaydedilebilen kaynaşmış bir görüntü penceresi açılacaktır.

Sonuçlar

Numuneyi hassas bir şekilde yönlendirmek, bir mikroskopi kurulumunu verimli bir şekilde kullanmanın hayati bir parçasıdır. Bununla birlikte, numunelerin bir tüpte hazırlanması gerekliliği göz önüne alındığında, çok görüntülü bir ışık tabakası sistemi kullanılırken numunelerin manuel olarak yönlendirilmesi genellikle mümkün değildir. Bu nedenle, embriyoların koryon içinde aldığı stereotipik pozisyonlar olup olmadığını kontrol etmek için, zebra ba...

Tartışmalar

Bir embriyoyu ilgilenilen bölgeyi görüntülemek için doğru yönde konumlandırmak, bir kullanıcı için genellikle başarısız bir mikroskopi seansı ile sonuçlanan hız sınırlayıcı adımlardan biridir. Bu, numuneler bir tüp içine gömüldüğü için oryantasyonun manuel olarak manipüle edilmesinin zor olduğu çok görüşlü bir ışık tabakası mikroskobunda daha fazladır. Bu sürece yardımcı olmak için, bu çalışma, embriyolu polimer tüp bir mikrosantrifüj t?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Calcium Chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Version: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspension	Sigma-Aldrich	L3280
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	ThermoFischer Scientific	AM1340	For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05	Adtech Innovations in Fluoroplastics	STW15	PTFE tubes
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640
Ultrasonic Cleaner	Labman	LMUC3	Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 System	Zeiss