Imágenes de microscopía de lámina de luz y estrategias de montaje para embriones tempranos de pez cebra

Resumen

Se describe una estrategia de preparación de muestras para obtener imágenes de embriones tempranos de pez cebra dentro de un corion intacto utilizando un microscopio de lámina de luz. Analiza las diferentes orientaciones que adquieren los embriones dentro del corion en las etapas de epibolia y yema del 70% y detalla estrategias de imagen para obtener una resolución a escala celular en todo el embrión utilizando el sistema de lámina de luz.

Resumen

La microscopía de lámina de luz se ha convertido en la metodología de elección para obtener imágenes en vivo de embriones de pez cebra en escalas de tiempo largas con una fototoxicidad mínima. En particular, un sistema multivista, que permite la rotación de la muestra, permite obtener imágenes de embriones completos desde diferentes ángulos. Sin embargo, en la mayoría de las sesiones de imágenes con un sistema multivista, el montaje de muestras es un proceso problemático, ya que las muestras generalmente se preparan en un tubo de polímero. Para ayudar en este proceso, este protocolo describe estrategias básicas de montaje para obtener imágenes del desarrollo temprano del pez cebra entre las etapas epiboly del 70% y somita temprana. En concreto, el estudio proporciona estadísticas sobre las distintas posiciones en las que se encuentran los embriones en las etapas de epíboly y yema del 70% dentro del corion. Además, discute el número óptimo de ángulos y el intervalo entre ángulos requerido para obtener imágenes de embriones enteros de pez cebra en las primeras etapas de desarrollo, de modo que la información a escala celular se pueda extraer fusionando las diferentes vistas. Finalmente, dado que el embrión cubre todo el campo de visión de la cámara, que es necesario para obtener una resolución a escala celular, este protocolo detalla el proceso de utilizar la información de las cuentas desde arriba o por debajo del embrión para el registro de las diferentes vistas.

Introducción

Garantizar una fototoxicidad mínima es un requisito importante para obtener imágenes de embriones vivos con alta resolución espacio-temporal durante largos períodos. Durante la última década, la microscopía de lámina ligera se ha convertido en la metodología de elección para cumplir con este requisito 1,2,3,4,5,6,7. Brevemente, en esta técnica que se utilizó por primera vez en 2004 para capturar los procesos de desarrollo⁸, dos láminas delgadas de láser alineadas atraviesan el embrión desde extremos opuestos, iluminando solo el plano de interés. Se coloca un objetivo de detección ortogonalmente y, a continuación, se recoge simultáneamente la luz fluorescente emitida desde todos los puntos iluminados de la muestra. A continuación, se obtiene una imagen en 3D moviendo secuencialmente el embrión a través de la lámina de luz estática.

Además, en una forma específica de esta metodología, denominada microscopía de lámina de luz multivista, las muestras pueden suspenderse en un tubo de polímero que se puede girar mediante un rotor, lo que permite obtener imágenes del mismo embrión desde múltiples ángulos ^9,10,11. Después de la toma de imágenes, las imágenes desde múltiples ángulos se fusionan en función de los marcadores de registro, que suelen ser marcadores fluorescentes globulares dentro del embrión (por ejemplo, núcleos) o en el tubo (por ejemplo, perlas fluorescentes). Las imágenes multivista y la fusión mejoran significativamente la resolución axial, proporcionando una resolución isotrópica en las tres dimensiones¹². Si bien esta es una gran ventaja, un desafío importante de la metodología de vista múltiple es el montaje de muestras, donde los embriones deben montarse y mantenerse en su lugar en los tubos durante todo el curso de tiempo de la imagen.

Para la realización de imágenes multivista, para mantener los embriones en su lugar y evitar el movimiento durante la obtención de imágenes, los embriones se pueden incrustar en agarosa. Sin embargo, esto a menudo conduce a un crecimiento y desarrollo perjudiciales, particularmente para los embriones de pez cebra en etapa temprana¹³, el sistema modelo que se discute aquí. Una segunda estrategia de montaje es utilizar un tubo delgado que es solo un poco más grande que el diámetro del embrión, donde el embrión puede ser arrastrado hacia el tubo junto con el medio embrionario, seguido de cerrar la parte inferior del tubo con un tapón de agarosa¹⁴. En este método, debido a que el tubo está lleno de medio embrionario, los marcadores de registro, como las perlas fluorescentes, no se pueden usar para la fusión de las diferentes vistas y, por lo tanto, el registro depende de los marcadores dentro del embrión. En general, las perlas actúan como mejores marcadores de registro, ya que la señal de los marcadores dentro del embrión se degrada al adentrarse más en la muestra debido a las limitaciones de iluminación y detección de cualquier microscopio.

Por lo tanto, un tercer enfoque, que se detallará aquí y que se utilizó anteriormente 5,13,14,15,16, es obtener imágenes tempranas de embriones de pez cebra con un corion intacto y llenar el tubo con un porcentaje mínimo de agarosa, que contiene perlas como marcadores de registro. En este escenario, debido a que la intervención manual para posicionar los embriones dentro de un corion no es posible, este estudio proporciona estadísticas sobre la orientación predeterminada en la que caen los embriones tempranos de pez cebra, centrándose particularmente en las etapas de epíboly y yema del 70%. A continuación, se analiza el número óptimo de vistas necesarias para obtener imágenes de embriones en fase temprana con una resolución a escala celular y se detalla el proceso de fusión utilizando BigStitcher, un complemento basado en FIJI 10,17,18. En conjunto, este protocolo, que utiliza un objetivo NA 20x/1, tiene como objetivo facilitar a los embriólogos de pez cebra el uso de sistemas de láminas de luz multivista para obtener imágenes de embriones con núcleos y marcadores de membrana desde la gastrulación hasta las primeras etapas de somita.

Protocolo

Los procedimientos experimentales y de mantenimiento del pez cebra utilizados en este estudio fueron aprobados por el comité institucional de ética animal, vide Referencia TIFR/IAEC/2023-1 y TIFR/IAEC/2023-5. Los embriones obtenidos por cruzamiento de peces heterocigotos que expresan Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)¹⁹ fueron inyectados con ARNm H2A-mCherry (30 pg) en la etapa unicelular. El ARNm de H2A-mCherry se sintetizó utilizando el plásmido pCS2+ H2A-mCherry (un regalo del laboratorio de Oates, EPFL) mediante transcripción in vitro . Los embriones que expresaban ambos marcadores, denominados Utr-GFP y H2A-mCherry, respectivamente, en el resto del protocolo, se fotografiaron en las etapas de epíboly y yema al 70%. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de muestras para imágenes multivista

1. Preparación de tubos FEP/PTFE
   1. Limpie los tubos de FEP/PTFE siguiendo los procedimientos descritos anteriormente¹⁴.
   2. Después de la limpieza, corte los tubos en longitudes de 2-2,5 cm según sea necesario y guárdelos en tubos de microcentrífuga de 2 ml que contengan agua destilada doble. Los tubos se pueden almacenar de esta manera durante aproximadamente un mes.
   3. Antes de preparar la muestra, caliente los tubos a 70-75 °C durante aproximadamente 25 minutos para enderezar los tubos. Evite el apiñamiento en cada tubo de microcentrífuga para evitar la aglomeración, asegurando suficiente espacio para un enderezamiento eficaz del tubo.
      NOTA: Use guantes durante todo el procedimiento de manipulación de los tubos, ya que cualquier huella dactilar/partícula de polvo que quede en los tubos puede interferir con la toma de imágenes.
2. Preparación de agarosa
   1. Prepare las soluciones madre del tampón E3 50x de la siguiente manera:
      1. Stock 1 - 3,252 g de Na₂HPO₄, 0,285 g de KH₂PO₄, 11,933 g de NaCl, 0,477 g de KCl en 1 L de agua desionizada
      2. Stock 2 - 2.426 g de CaCl₂, 4.067 g de MgSO₄ en 1 L de agua desionizada.
   2. Para hacer 1x tampón E3, agregue 20 mL de cada una de las soluciones stock 1 y 2 en 960 mL de agua desionizada.
      NOTA: No agregue azul de metileno en el tampón E3 utilizado para la toma de imágenes, ya que provoca la dispersión de la luz.
   3. Disuelva la agarosa de bajo punto de fusión en 1x E3 calentándola a 70-75 °C en un bloque de calor con agitación hasta que la solución se vuelva clara sin grumos ni cristales.
   4. Para la obtención de imágenes multivista, agregue perlas fluorescentes disponibles comercialmente (consulte la Tabla de materiales) a la solución de agarosa, lo que permite el registro de imágenes durante el análisis. Sonicar las perlas a temperatura ambiente con una frecuencia de 40 kHz durante 20-30 min en un ultrasonido en baño de agua para desagregar las perlas.
   5. Después de la sonicación, añadir 1 μL de perlas a 10 mL de solución de agarosa en un tubo de 15 mL y vórtear bien el tubo para asegurar una dispersión uniforme de las perlas.
      NOTA: El volumen de solución de perlas que se debe agregar a la agarosa depende de la solución madre y del fabricante. Pruebe una gama de volúmenes y elija una concentración en la que las cuentas parezcan bien dispersas cuando se visualicen en el sistema de láminas ligeras. Demasiadas cuentas pueden agregarse a pesar de la sonicación y el vórtice, mientras que muy pocas cuentas pueden afectar al registro de la imagen.
   6. Mantener el tubo de agarosa con perlas añadidas en un baño de agua cerrado mantenido a 37 °C durante al menos 30 minutos antes de la preparación de la muestra. Esto asegura que la temperatura de la agarosa baje de 70 °C a 37 °C.
3. Preparación de la muestra
   1. Coloque los peces en parejas con divisores por la noche antes del día de la toma de imágenes. Retire los divisores durante unos 15 minutos y recoja los embriones utilizando el procedimiento estándar²⁰.
   2. Una vez que los embriones alcancen la etapa de interés para la preparación de la muestra, vierta los 10 ml enteros de agarosa (con perlas) que se mantienen a 37 °C en una placa de Petri de 6 cm.
   3. Espere unos 2-3 minutos para que la temperatura baje de 33 °C antes de transferir de 10 a 15 embriones a la solución de agarosa.
      NOTA: Este es un paso importante para prevenir cualquier posible choque térmico en los embriones transferidos a la agarosa.
   4. Asegúrese de que se agregue la menor cantidad posible de tampón E3 a la solución de agarosa mientras se transfieren los embriones. Agite la placa de Petri para que el pequeño tampón que se habría transferido se disperse bien.
   5. Use guantes para el resto del procedimiento de preparación de la muestra.
   6. Tome una micropipeta de 200 μL con una punta de pipeta adecuada e inserte un tubo recto limpio extraído del tubo de microcentrífuga hasta la punta de la pipeta como se muestra en la figura 1A,B.
   7. Aspirar un poco de agarosa en el tubo, seguido de 2-3 embriones utilizando la micropipeta (Figura 1C,D). Asegúrese de que los embriones estén cerca de la parte inferior del tubo (Figura 1E), lo que será importante al preparar las imágenes. Además, asegúrese de que haya un poco de agarosa entre los diferentes embriones (Figura 1E) para que las cuentas de esta región puedan usarse como marcadores de registro.
   8. Sin liberar la presión de la pipeta, separe el tubo de la punta de la pipeta y colóquelo en la tapa de la placa de Petri llena de E3 para que la agarosa se solidifique (Figura 1F).
   9. Repita los pasos 1.3.6 a 1.3.8 hasta que todos los embriones de la placa de Petri se transfieran a los tubos.
   10. Una vez que la agarosa se haya solidificado (lo que puede tardar de 5 a 10 minutos y se puede confirmar revisando la agarosa en la placa de Petri), transfiera los tubos a un tubo de microcentrífuga de 2 mL lleno de E3 (Figura 1G).
   11. Guarde los tubos con los embriones en una incubadora a 28 °C o 33 °C, según sea necesario, antes de proceder a la obtención de imágenes multivista.

2. Imágenes multivista

NOTA: Este paso presenta un procedimiento general para la obtención de imágenes multivista de embriones de pez cebra en sus primeras etapas de desarrollo. El método que se detalla a continuación se puede adaptar fácilmente a cualquier sistema de microscopía de lámina de luz multivista.

1. Localización del embrión
   NOTA: Llene la cámara de muestras del microscopio con el medio embrionario²⁰ y ajuste la temperatura de la cámara de muestras a la temperatura de interés al menos 10 minutos antes de la toma de imágenes.
   1. Ensamble el portamuestras como se describió anteriormente²¹, sin embargo, con una modificación. Dado que las imágenes se realizarán a través del tubo, inserte el tubo con embriones directamente en un capilar del diámetro correcto, de modo que se mantenga en su lugar sin empujar la agarosa hacia afuera y perturbar los embriones en la parte inferior (Figura 1H).
      NOTA: Dado que la cámara de muestras tiene una altura definida, asegurarse de que los embriones estén ubicados hacia el fondo del tubo durante la preparación de la muestra (como se mencionó en el paso 1.3.7) permitiría colocar el embrión en el campo de visión sin golpear el suelo de la cámara.
   2. Inserte el portamuestras en el sistema multivista y utilice los controles x e y para llevar el embrión al centro del campo de visión.
   3. Utilice el control z del navegador de muestras para enfocar el embrión.
   4. En este punto, la orientación del embrión dentro del corion será claramente visible, y si no es satisfactoria, inserte un nuevo tubo y elija el embrión con una orientación de interés.
2. Alineación de las láminas de luz
   1. Una vez que el embrión esté en posición, configure todos los ajustes experimentales: láseres, trayectoria de luz, filtro, divisor de haz y cámara.
   2. Al configurar los parámetros de adquisición, si el software ofrece una opción para el escaneo de pivote, selecciónela. Un escaneo pivotante reducirá el efecto de sombreado que emerge de la hoja de luz a medida que encuentra cualquier estructura o región opaca en la muestra.
   3. Inicie el escaneo en vivo de la muestra. Configure el tamaño de la broca, la potencia del láser y el zoom deseado, lo que determinará el grosor de la lámina de luz y, por lo tanto, la resolución axial.
   4. Para alinear las hojas de luz, primero cambie a la iluminación de un solo lado y cambie la configuración de las dos hojas de luz (izquierda y derecha) secuencialmente. Acérquese digitalmente a una región de la muestra donde se vean estructuras claras de interés.
      NOTA: En este estudio, se utilizó un marcador nuclear (H2A-mCherry) o un marcador de membrana (Utr-GFP) para alinear las láminas. Se recomienda cambiar la configuración de la hoja de luz en el software para que se logre el contraste más nítido de la señal en la región de interés.
   5. Una vez que las dos hojas de luz estén optimizadas individualmente para lograr la mejor señal, encienda ambas hojas de luz. Realice una segunda ronda de alineación y asegúrese de que el parpadeo sea mínimo, lo que indica una alineación bastante buena de las dos hojas.
   6. Una vez realizada la alineación, active la opción de fusionar automáticamente las imágenes generadas por las dos hojas, si el software lo permite. Alternativamente, primero se pueden alinear de manera gruesa las láminas de luz enfocándose en las cuentas alrededor de la muestra y luego ajustar la alineación utilizando la información de la muestra.
      NOTA: Al obtener imágenes con dos fluoróforos (como marcadores nucleares y de membrana), la alineación óptima suele ser marginalmente diferente para las dos estructuras. En este escenario, elija una configuración basada en las restricciones del procesamiento posterior. Por ejemplo, si se van a segmentar los límites de las celdas, lo que requiere un procesamiento relativamente más intensivo, alinee las láminas de luz en función del marcador de membrana.
3. Configuración de imágenes multivista
   1. Después de alinear las hojas de luz, active las opciones para realizar una pila z, así como imágenes multivista.
   2. Inicie el escaneo en vivo y navegue con el navegador de muestras para seleccionar la primera vista. En esta vista, configure el intervalo de segmentos, seguido del primer y el último segmento de la pila z. Agregue esta posición en el cuadro de diálogo multivista, que toma nota de la posición y la información de la pila z para esta vista.
   3. Desplácese a la siguiente vista cambiando el ángulo en el navegador de muestras. Configure la pila z para la segunda vista y agregue la información en el cuadro de diálogo multivista.
   4. Repita lo mismo para vistas adicionales.
      NOTA: Asegúrese de que se muestre un cierto número mínimo de sectores en cada vista para que haya suficiente superposición entre las diferentes vistas, lo que eventualmente ayudará a registrar las vistas durante el procesamiento. El número mínimo de cortes dependerá del factor de zoom, así como del número de ángulos elegidos para la imagen.
   5. Después de configurar todas las vistas, guarde esta información en un archivo de texto (llamado 'posiciones de embriones', por ejemplo), que contendrá información de la pila z, coordenadas (x, y, z) del tubo, así como especificaciones del ángulo para cada vista. Después de guardar, borre todas las posiciones del cuadro de diálogo multivista.
   6. Dado que las imágenes se realizan con un corion intacto, que es relativamente grande, no es posible ver las perlas en el tubo con los mismos ajustes. Por lo tanto, la información del cordón debe adquirirse desde una posición diferente en el tubo. Para hacer esto, traduzca a una coordenada 'y' diferente lejos del embrión donde las cuentas son visibles. Añada esta posición al cuadro de diálogo multivista y guárdela en un archivo de texto (llamado 'beads-y', por ejemplo).
      NOTA: Tome una imagen de las perlas lo más cerca posible de la muestra del embrión para minimizar los efectos de las posibles diferencias en la curvatura del tubo en las dos posiciones. Por lo tanto, si se montan varios embriones en el tubo, es importante dejar un poco de agarosa entre los tubos para obtener imágenes de las cuentas (como se mencionó en el paso 1.3.7).
   7. Vaya a la carpeta donde se guardan los archivos de texto y duplique el archivo 'embryo-positions' en un nuevo archivo llamado 'beads-positions'. Reemplace la coordenada y para todas las vistas en el archivo 'beads-positions' por la coordenada y del archivo 'beads-y'. Esto asegurará que las cuentas se visualicen con el mismo número de vistas, pilas z y coordenadas x, pero en una posición y diferente en el tubo.
   8. Regrese al software de imágenes y cargue el archivo 'bead-positions' en el software. Si la opción de serie temporal está activada, seleccione un ciclo e inicie el experimento. Guarde las imágenes de cuentas como 'cuentas', que se utilizarán para registrar las diferentes vistas durante el procesamiento de la imagen.
   9. Después de tomar las imágenes de las cuentas, borre las posiciones y cargue el archivo inicial de "posiciones de embriones" en el software. Establezca el número deseable de ciclos con un intervalo de tiempo adecuado e inicie el experimento.

3. Análisis de imágenes multivista

NOTA: Para fusionar las imágenes multivista, se utiliza un complemento FIJI, BigStitcher, que es la última versión del complemento Multiview Reconstruction, 10,17,18. El complemento se puede instalar agregando el complemento BigStitcher en la función 'Administrar sitios de actualización', a la que se puede acceder en la opción 'Actualizar' en el menú 'Ayuda'. Una vez instalado, el plugin aparecerá en el menú 'Plugins'. Los pasos generales involucrados en la fusión son los siguientes: (1) Definir pares de archivos .xml/.h5 tanto para las cuentas como para los embriones; (2) Registre todas las vistas con el archivo de cuentas; (3) Función de dispersión de punto de extracción (PSF) para las cuentas, que se puede utilizar para la deconvolución (Figura 2A); (4) Transfiera el registro y la información de PSF del archivo de cuentas al archivo de embriones y comience la deconvolución multivista. La mayoría de estos pasos se han descrito previamente en detalle²¹, y aquí se describen los pasos que se procesan de manera diferente.

1. Definición de un conjunto de datos .xml
   1. Defina un nuevo conjunto de datos para las cuentas y el embrión como 'beads.xml' y 'embryo.xml', respectivamente, como se describió anteriormente²¹.
2. Detección y registro mediante puntos de interés
   1. Después de la exportación exitosa del archivo beads.xml, seleccione las vistas necesarias para el registro en el cuadro de diálogo 'Explorador multivista' (Figura 2B). Haga clic con el botón derecho y elija Detectar puntos de interés. Continúe con los pasos descritos²¹.
   2. Después de detectar los puntos de interés, seleccione todas las vistas, haga clic con el botón derecho y elija Registrar con puntos de interés. Siga el protocolo descrito²¹.
   3. Compruebe cuidadosamente si el registro de la cuenta ha funcionado correctamente. Tras el registro exitoso, se superponen cuentas superpuestas de diferentes vistas (Figura 2C). Para comprobar la precisión con la que ha funcionado el registro, seleccione dos vistas consecutivas, vaya a la región superpuesta y alterne entre las dos vistas para observar si las cuentas visualizadas desde diferentes ángulos están superpuestas. Repita esto para cada vista consecutiva.
   4. Si la superposición no es precisa, vuelva a intentar el registro relajando la significación requerida para el registro y/o el error aceptable de superposición (denominado "error RANSAC" en el cuadro de diálogo "Registro").
   5. Después de un registro exitoso, haga clic en Guardar en la ventana 'Explorador multivista' para guardar el archivo de .xml actualizado.
      NOTA: Guarde también el archivo de registro, ya que contiene información más detallada sobre la eficiencia del registro. Para traducir la información de registro de las cuentas al embrión, siga los pasos que se describen a continuación.
   6. Abra el archivo bead.xml en el editor de texto de su elección y copie todo el bloque en "ViewRegistrations".
   7. Abra el embryo.xml y reemplace el bloque "ViewRegistrations" con el bloque copiado del archivo de cuentas. Si hay varios canales, reemplace la información de registro para cada canal como se indicó anteriormente. La información de registro se puede transferir manualmente o mediante el código de MATLAB escrito a medida que se puede descargar aquí: https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
   8. Abra el archivo embryo.xml en "BigStitcher" y compruebe cuidadosamente si el registro ha funcionado correctamente para el embrión. Repita lo mismo que se hizo para las cuentas, comprobando la superposición de estructuras de interés en cada dos vistas consecutivas.
      NOTA: Ocasionalmente, el registro de embriones puede no ser tan deseable a pesar de que las cuentas se registran perfectamente. Esto es posible si hay ligeros cambios en la curvatura del tubo desde la posición en la que se obtienen las perlas hasta la posición del embrión. Además, podría haber movimientos sutiles del embrión entre las vistas, ya que flota libremente dentro del corion. En este caso, se realiza una segunda ronda de registro utilizando un marcador nuclear en el embrión.
   9. Para ello, abra el archivo embryo.xml en "BigStitcher", haga clic con el botón derecho del ratón en todas las vistas que tengan el marcador nuclear y elija Detectar puntos de interés.
   10. Cambie el nombre de los puntos de interés a "núcleos" y continúe con los pasos tal como se realizaron para las cuentas.
   11. Al establecer los parámetros de 'Diferencia de gaussianos', asegúrese de que la mayoría de los núcleos, si no todos, se detecten y que no haya detección nuclear ectópica. A continuación, haga clic en Listo.
   12. A continuación, registre estas vistas seleccionando Registrar con puntos de interés y opte por la opción Basado en descriptor preciso (invariante de traducción). Asegúrese de que la opción "comparar todas las vistas y puntos de interés" esté seleccionada y utilice los "núcleos" como puntos de interés. Utilice la opción para fijar la primera vista y no volver a asignarla.
   13. Para el registro, utilice un modelo afín con regularización rígida y los parámetros predeterminados en el complemento.
   14. Vuelva a comprobar el éxito del registro comparando cada dos vistas consecutivas.
   15. Después de un registro exitoso, haga clic en Guardar en la ventana 'Explorador multivista' para guardar el archivo de .xml actualizado.
   16. Abra el archivo embryo.xml en el editor de texto de su elección y copie la información de registro de los marcadores nucleares a los otros canales.
3. Extracción y asignación de la función de dispersión de puntos
   1. Para realizar la deconvolución multivista, extraiga la PSF del sistema de imágenes del conjunto de datos de cuentas registradas y aplíquela al archivo de embriones.
   2. Para obtener esta información, seleccione todas las vistas del archivo de cuentas y, a continuación, haga clic con el botón derecho y elija Funciones de dispersión de puntos y Opciones de extracción .
   3. En el cuadro de diálogo que aparece, asegúrese de que las proyecciones Usar puntos de interés correspondientes y Eliminar intensidad mínima de PSF estén marcadas, proceda con los tamaños de PSF predeterminados y haga clic en Aceptar.
      NOTA: Si la extracción de PSF se realiza correctamente para todas las vistas, el archivo de registro mostrará 'Extraídas n/n PSF'
   4. Después de esto, vuelva a guardar el archivo .xml. Aparecerá una casilla de verificación marcada en la columna PSF del cuadro de diálogo 'Explorador multivista', y se generará una carpeta 'psf' en la carpeta respectiva con todos los PSF extraídos.
   5. Abra el archivo embryo.xml y asigne el PSF para cada vista por separado. Haga clic con el botón derecho en "una vista" → haga clic en Funciones de dispersión de puntos → elija Asignar → seleccione Avanzado, seguido de Asignar nuevo PSF a todas las vistas seleccionadas. Haga clic en Examinar, vaya a la ruta del archivo .xml y abra la carpeta psf .
   6. Elija el PSF correspondiente con el ID correspondiente en la vista seleccionada y haga clic en Aceptar, después de lo cual aparecerá la casilla de verificación PSF marcada en la ventana 'Explorador multivista'.
   7. Repita el proceso para todas las demás vistas.
4. Fusión y deconvolución multivista
   1. Una vez asignada la función de dispersión de puntos para todas las vistas, haga clic con el botón derecho y elija Deconvolución multivista.
   2. Seleccione el cuadro delimitador como vistas seleccionadas actualmente. Para este trabajo, la aceleración predeterminada de OSEM y el número de iteraciones funcionan bien.
   3. Reduzca la resolución de las imágenes según sea necesario si se desea un cálculo más rápido o si la memoria de la CPU es limitante.
      NOTA: Si la RAM requerida excede la memoria existente, aparecerá un mensaje de error de advertencia en color rojo en la parte inferior de la ventana. No inicie la deconvolución si aparece esta advertencia, ya que el complemento se detendrá y dejará de responder en algún momento durante el procesamiento.
   4. Para evaluar el progreso de la deconvolución, compruebe el archivo de registro, que mostrará los resultados cada 5 iteraciones.
   5. Para aumentar la velocidad de cálculo, realice la deconvolución multivista en la GPU si está instalada anteriormente.
      NOTA: Al final de este proceso, aparecerá una ventana de imagen fusionada, que se puede guardar como un archivo tiff.

Resultados

Orientar la muestra de manera precisa es una parte vital del uso eficiente de una configuración de microscopía. Sin embargo, la orientación manual de las muestras a menudo no es posible cuando se utiliza un sistema de láminas ligeras multivista, dado el requisito de preparar las muestras en un tubo. Por lo tanto, para comprobar si existen posiciones estereotipadas que adoptan los embriones dentro del corion, se tomaron imágenes de embriones de pez cebra al 70% de la epíbolia (aprox...

Discusión

Posicionar un embrión en la orientación correcta para obtener imágenes de la región de interés es uno de los pasos limitantes de la velocidad que a menudo resulta en una sesión de microscopía fallida para un usuario. Esto es más cierto en un microscopio de lámina de luz multivista donde la manipulación manual de la orientación es difícil ya que las muestras están incrustadas dentro de un tubo. Para ayudar en este proceso, este estudio reporta las estadísticas de varias posi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Calcium Chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Version: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspension	Sigma-Aldrich	L3280
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	ThermoFischer Scientific	AM1340	For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05	Adtech Innovations in Fluoroplastics	STW15	PTFE tubes
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640
Ultrasonic Cleaner	Labman	LMUC3	Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 System	Zeiss