Imágenes de microscopía de lámina de luz y estrategias de montaje para embriones tempranos de pez cebra

Resumen

Se describe una estrategia de preparación de muestras para obtener imágenes de embriones tempranos de pez cebra dentro de un corion intacto utilizando un microscopio de lámina de luz. Analiza las diferentes orientaciones que adquieren los embriones dentro del corion en las etapas de epibolia y yema del 70% y detalla estrategias de imagen para obtener una resolución a escala celular en todo el embrión utilizando el sistema de lámina de luz.

Resumen

La microscopía de lámina de luz se ha convertido en la metodología de elección para obtener imágenes en vivo de embriones de pez cebra en escalas de tiempo largas con una fototoxicidad mínima. En particular, un sistema multivista, que permite la rotación de la muestra, permite obtener imágenes de embriones completos desde diferentes ángulos. Sin embargo, en la mayoría de las sesiones de imágenes con un sistema multivista, el montaje de muestras es un proceso problemático, ya que las muestras generalmente se preparan en un tubo de polímero. Para ayudar en este proceso, este protocolo describe estrategias básicas de montaje para obtener imágenes del desarrollo temprano del pez cebra entre las etapas epiboly del 70% y somita temprana. En concreto, el estudio proporciona estadísticas sobre las distintas posiciones en las que se encuentran los embriones en las etapas de epíboly y yema del 70% dentro del corion. Además, discute el número óptimo de ángulos y el intervalo entre ángulos requerido para obtener imágenes de embriones enteros de pez cebra en las primeras etapas de desarrollo, de modo que la información a escala celular se pueda extraer fusionando las diferentes vistas. Finalmente, dado que el embrión cubre todo el campo de visión de la cámara, que es necesario para obtener una resolución a escala celular, este protocolo detalla el proceso de utilizar la información de las cuentas desde arriba o por debajo del embrión para el registro de las diferentes vistas.

Introducción

Garantizar una fototoxicidad mínima es un requisito importante para obtener imágenes de embriones vivos con alta resolución espacio-temporal durante largos períodos. Durante la última década, la microscopía de lámina ligera se ha convertido en la metodología de elección para cumplir con este requisito 1,2,3,4,5,6,7. Brevemente, en esta técnica que se utilizó por primera vez en 2004 para capturar los proce....

Protocolo

Los procedimientos experimentales y de mantenimiento del pez cebra utilizados en este estudio fueron aprobados por el comité institucional de ética animal, vide Referencia TIFR/IAEC/2023-1 y TIFR/IAEC/2023-5. Los embriones obtenidos por cruzamiento de peces heterocigotos que expresan Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)¹⁹ fueron inyectados con ARNm H2A-mCherry (30 pg) en la etapa unicelular. El ARNm de H2A-mCherry se sintetizó utilizando el plásmido pCS2+ H2A-mCherry (un regalo del laboratorio de Oates, EPFL) mediante transcripción in vitro . Los embriones que expresaban ambos marcadores, denominados Utr-GF....

Discusión

Posicionar un embrión en la orientación correcta para obtener imágenes de la región de interés es uno de los pasos limitantes de la velocidad que a menudo resulta en una sesión de microscopía fallida para un usuario. Esto es más cierto en un microscopio de lámina de luz multivista donde la manipulación manual de la orientación es difícil ya que las muestras están incrustadas dentro de un tubo. Para ayudar en este proceso, este estudio reporta las estadísticas de varias posi.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Calcium Chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Version: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspension	Sigma-Aldrich	L3280
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	ThermoFischer Scientific	AM1340	For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05	Adtech Innovations in Fluoroplastics	STW15	PTFE tubes
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640
Ultrasonic Cleaner	Labman	LMUC3	Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 System	Zeiss