A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

نقدم بروتوكولا لإعداد المكثفات الجزيئية الحيوية الاصطناعية التي تتكون من نجوم نانوية من الحمض النووي البرمائي بدءا من قليل النيوكليوتيدات المكونة لها من الحمض النووي. يتم إنتاج المكثفات إما من مكون نانوستار واحد أو مكونين ويتم تعديلها للحفاظ على النسخ في المختبر للحمض النووي الريبي من قالب الحمض النووي المضمن.

Abstract

أصبحت القطرات والمكثفات الاصطناعية مكونات شائعة بشكل متزايد لأنظمة المحاكاة الحيوية المتقدمة والخلايا الاصطناعية ، حيث يمكن استخدامها لإنشاء تجزئة والحفاظ على استجابات شبيهة بالحياة. أظهرت الهياكل النانوية للحمض النووي الاصطناعي إمكانات كبيرة ككتل بناء لتشكيل المكثفات بسبب شكلها القابل للبرمجة ، ووظائفها الكيميائية ، وسلوك التجميع الذاتي. لقد أثبتنا مؤخرا أن "النجوم النانوية" للحمض النووي البرمائي ، التي تم الحصول عليها عن طريق تسمية تقاطعات الحمض النووي بشقوق كارهة للماء ، تشكل حلا قويا ومتعدد الاستخدامات بشكل خاص. يمكن برمجة مكثفات الحمض النووي البرمائية الناتجة لعرض البنى الداخلية المعقدة والمتعددة الأجزاء ، والاستجابة هيكليا لمختلف المحفزات الخارجية ، وتوليف الجزيئات الكبيرة ، والتقاط الحمولات وإطلاقها، والخضوع للتحولات المورفولوجية ، والتفاعل مع الخلايا الحية. نوضح هنا بروتوكولات تحضير مكثفات الحمض النووي البرمائية بدءا من قليل النيوكليوتيدات المكونة للحمض النووي. سنتناول (i) الأنظمة أحادية المكون التي تشكل مكثفات موحدة ، (ii) الأنظمة المكونة من عنصرين والتي تشكل مكثفات الغلاف الأساسي ، و (iii) الأنظمة التي يتم فيها تعديل المكثفات لدعم النسخ في المختبر للهياكل النانوية للحمض النووي الريبي.

Introduction

الخلايا الاصطناعية عبارة عن أجهزة بمقياس ميكرومتر (10-50 ميكرومتر) تم إنشاؤها من الأسفل إلى الأعلى لتكرار وظائف وهياكل الخلايا البيولوجية الموجودة 1,2. غالبا ما ترتبط الخلايا الاصطناعية بأغشية مبنية من حويصلات ثنائية الطبقة الدهنية3،4،5،6،7 ، أو بوليميرسومات8،9 ، أو بروتينوسومات10،11 ، والتي يمكن استخدامها أيضا ....

Protocol

ملاحظة: ينقسم البروتوكول إلى ثلاثة أقسام. يصف القسم 1 الخطوات الأساسية ، بما في ذلك تحضير قليل النوكليوتيدات الحمض النووي والشعيرات الدموية الزجاجية. يصف القسم 2 تحضير مكثفات C-star ذات التصميمات المختلفة ، بما في ذلك التصميمات المكونة من مكون واحد ومكونين ، واستخراجها من الشعيرات الدموية الزجاجية. يصف القسم 3 استخدام مكثفات C-star المكونة من عنصر واحد لقوالب الحمض النووي الريبي لتخليق أبتامير الحمض النووي الريبي. يجب على المستخدم اتباع الممارسات المعملية الجيدة طوال الوقت ، والتأكد من وجود جميع تقييمات المخاطر اللازمة والتخفيف من حدتها ، وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) ، بما في ذلك القفازات ونظارات السلامة ومعطف المختبر. يتطلب تنظيف الأنابيب الشعرية الزج....

النتائج

بعد التلدين ، يمكن تصوير مكثفات C-star مباشرة في الأنبوب الشعري ، أو بعد الاستخراج ، لتأكيد تكوينها. بالنسبة لجميع الاختلافات في تصميم C-star ، يجب على المرء أن يلاحظ المكثفات الكروية أو متعددة السطوح المميزة التي يبلغ قطرها حوالي 10-50 ميكرومتر ، وتتشكل الأخيرة عند حدوث التبلور28,32

Discussion

يوفر البروتوكول الموصوف هنا نهجا لتحضير مكثفات مكونة من مكون واحد أو مكونين من نجوم الحمض النووي البرمائية النانوية ، مع اختلافات في التصميم لإدخال استجابات مختلفة في المكثفات. ينتج البروتوكول المعطى مكثفات في محلول عازل يبلغ 0.3 M NaCl في TE ، ولكن يمكن تعديل شروط المخزن المؤقت عن طريق تعديل ?.......

Disclosures

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تقر LM و LDM و DT بالدعم المقدم من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 (ERC-STG No 851667 - NANOCELL). تعترف LDM بالدعم المقدم من منحة أبحاث الجمعية الملكية للزملاء الباحثين (RGF / R1 / 180043) والدعم من زمالة أبحاث جامعة الجمعية الملكية (UF160152 ، URF / R / 221009).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm syringe filtersSigma-AldrichSLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel GläserVWR631-0853
2-PropanolSigma-Aldrich34683
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VACCole-ParmerWZ-08895-11
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy GlueRSARA-400005
Bio-Rad C1000 thermal cyclerBio-Rad1851197
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking LidFisher Scientific153386652 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates
Diamond Scribing PenRS394-217
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI)Sigma-AldrichSML1627
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge TubesFisher Scientific00301233010.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures
Ethanol Absolute 99.8+%Fisher Scientific1043734170% ethanol is sufficient for cleaning purposes
Fisherbrand ZX4 IR Vortex MixerFisherbrand13284769
Hellmanex IIIHellma9-307-011-4-507
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in lengthCM Scientific2540-50
Mineral oilSigma-Aldrich69794
Mini Centrifuge, 230 VPRISM(TM)Z763128
NaClSigma-AldrichS3014
NanoDrop One SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-WUsed to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations
OligonucleotidesIntegrated DNA TechnologiesCustomOligonucleotide sequences are unique to the C-star design required.
ScriptGuard RNase inhibitorCELLSCRIPTC-SRI6310KRNase inhibitor
T7-FlashScribe Transcription KitCambioC-ASF3507
Tris-EDTA buffer, 100x stock solutionSigma-Aldrich574793
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterInvitrogen10977035
VWR Spec-Wipe 3 WipersVWR21914-758

References

  1. Buddingh', B. C., Hest, J. C. M. v. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Acc Chem Res. 50 (4), 769-777 (2017).
  2. Fanalista, F., et al. Shape and size contro....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

We use cookies to enhance your experience on our website.

By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.

Learn More