A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
نقدم بروتوكولا لإعداد المكثفات الجزيئية الحيوية الاصطناعية التي تتكون من نجوم نانوية من الحمض النووي البرمائي بدءا من قليل النيوكليوتيدات المكونة لها من الحمض النووي. يتم إنتاج المكثفات إما من مكون نانوستار واحد أو مكونين ويتم تعديلها للحفاظ على النسخ في المختبر للحمض النووي الريبي من قالب الحمض النووي المضمن.
أصبحت القطرات والمكثفات الاصطناعية مكونات شائعة بشكل متزايد لأنظمة المحاكاة الحيوية المتقدمة والخلايا الاصطناعية ، حيث يمكن استخدامها لإنشاء تجزئة والحفاظ على استجابات شبيهة بالحياة. أظهرت الهياكل النانوية للحمض النووي الاصطناعي إمكانات كبيرة ككتل بناء لتشكيل المكثفات بسبب شكلها القابل للبرمجة ، ووظائفها الكيميائية ، وسلوك التجميع الذاتي. لقد أثبتنا مؤخرا أن "النجوم النانوية" للحمض النووي البرمائي ، التي تم الحصول عليها عن طريق تسمية تقاطعات الحمض النووي بشقوق كارهة للماء ، تشكل حلا قويا ومتعدد الاستخدامات بشكل خاص. يمكن برمجة مكثفات الحمض النووي البرمائية الناتجة لعرض البنى الداخلية المعقدة والمتعددة الأجزاء ، والاستجابة هيكليا لمختلف المحفزات الخارجية ، وتوليف الجزيئات الكبيرة ، والتقاط الحمولات وإطلاقها، والخضوع للتحولات المورفولوجية ، والتفاعل مع الخلايا الحية. نوضح هنا بروتوكولات تحضير مكثفات الحمض النووي البرمائية بدءا من قليل النيوكليوتيدات المكونة للحمض النووي. سنتناول (i) الأنظمة أحادية المكون التي تشكل مكثفات موحدة ، (ii) الأنظمة المكونة من عنصرين والتي تشكل مكثفات الغلاف الأساسي ، و (iii) الأنظمة التي يتم فيها تعديل المكثفات لدعم النسخ في المختبر للهياكل النانوية للحمض النووي الريبي.
الخلايا الاصطناعية عبارة عن أجهزة بمقياس ميكرومتر (10-50 ميكرومتر) تم إنشاؤها من الأسفل إلى الأعلى لتكرار وظائف وهياكل الخلايا البيولوجية الموجودة 1,2. غالبا ما ترتبط الخلايا الاصطناعية بأغشية مبنية من حويصلات ثنائية الطبقة الدهنية3،4،5،6،7 ، أو بوليميرسومات8،9 ، أو بروتينوسومات10،11 ، والتي يمكن استخدامها أيضا ....
ملاحظة: ينقسم البروتوكول إلى ثلاثة أقسام. يصف القسم 1 الخطوات الأساسية ، بما في ذلك تحضير قليل النوكليوتيدات الحمض النووي والشعيرات الدموية الزجاجية. يصف القسم 2 تحضير مكثفات C-star ذات التصميمات المختلفة ، بما في ذلك التصميمات المكونة من مكون واحد ومكونين ، واستخراجها من الشعيرات الدموية الزجاجية. يصف القسم 3 استخدام مكثفات C-star المكونة من عنصر واحد لقوالب الحمض النووي الريبي لتخليق أبتامير الحمض النووي الريبي. يجب على المستخدم اتباع الممارسات المعملية الجيدة طوال الوقت ، والتأكد من وجود جميع تقييمات المخاطر اللازمة والتخفيف من حدتها ، وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) ، بما في ذلك القفازات ونظارات السلامة ومعطف المختبر. يتطلب تنظيف الأنابيب الشعرية الزج....
بعد التلدين ، يمكن تصوير مكثفات C-star مباشرة في الأنبوب الشعري ، أو بعد الاستخراج ، لتأكيد تكوينها. بالنسبة لجميع الاختلافات في تصميم C-star ، يجب على المرء أن يلاحظ المكثفات الكروية أو متعددة السطوح المميزة التي يبلغ قطرها حوالي 10-50 ميكرومتر ، وتتشكل الأخيرة عند حدوث التبلور28,32
يوفر البروتوكول الموصوف هنا نهجا لتحضير مكثفات مكونة من مكون واحد أو مكونين من نجوم الحمض النووي البرمائية النانوية ، مع اختلافات في التصميم لإدخال استجابات مختلفة في المكثفات. ينتج البروتوكول المعطى مكثفات في محلول عازل يبلغ 0.3 M NaCl في TE ، ولكن يمكن تعديل شروط المخزن المؤقت عن طريق تعديل ?.......
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
تقر LM و LDM و DT بالدعم المقدم من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 (ERC-STG No 851667 - NANOCELL). تعترف LDM بالدعم المقدم من منحة أبحاث الجمعية الملكية للزملاء الباحثين (RGF / R1 / 180043) والدعم من زمالة أبحاث جامعة الجمعية الملكية (UF160152 ، URF / R / 221009).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | SLGVR33RB | |
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | VWR | 631-0853 | |
2-Propanol | Sigma-Aldrich | 34683 | |
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC | Cole-Parmer | WZ-08895-11 | |
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue | RS | ARA-400005 | |
Bio-Rad C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851197 | |
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid | Fisher Scientific | 15338665 | 2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates |
Diamond Scribing Pen | RS | 394-217 | |
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI) | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 0030123301 | 0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures |
Ethanol Absolute 99.8+% | Fisher Scientific | 10437341 | 70% ethanol is sufficient for cleaning purposes |
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer | Fisherbrand | 13284769 | |
Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length | CM Scientific | 2540-50 | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | 69794 | |
Mini Centrifuge, 230 V | PRISM(TM) | Z763128 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
NanoDrop One Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations |
Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Custom | Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required. |
ScriptGuard RNase inhibitor | CELLSCRIPT | C-SRI6310K | RNase inhibitor |
T7-FlashScribe Transcription Kit | Cambio | C-ASF3507 | |
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution | Sigma-Aldrich | 574793 | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10977035 | |
VWR Spec-Wipe 3 Wipers | VWR | 21914-758 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ISSN 2578-2614
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved
We use cookies to enhance your experience on our website.
By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.