المكثفات الاصطناعية والبنى الشبيهة بالخلايا من الهياكل النانوية للحمض النووي البرمائي

Summary

نقدم بروتوكولا لإعداد المكثفات الجزيئية الحيوية الاصطناعية التي تتكون من نجوم نانوية من الحمض النووي البرمائي بدءا من قليل النيوكليوتيدات المكونة لها من الحمض النووي. يتم إنتاج المكثفات إما من مكون نانوستار واحد أو مكونين ويتم تعديلها للحفاظ على النسخ في المختبر للحمض النووي الريبي من قالب الحمض النووي المضمن.

Abstract

أصبحت القطرات والمكثفات الاصطناعية مكونات شائعة بشكل متزايد لأنظمة المحاكاة الحيوية المتقدمة والخلايا الاصطناعية ، حيث يمكن استخدامها لإنشاء تجزئة والحفاظ على استجابات شبيهة بالحياة. أظهرت الهياكل النانوية للحمض النووي الاصطناعي إمكانات كبيرة ككتل بناء لتشكيل المكثفات بسبب شكلها القابل للبرمجة ، ووظائفها الكيميائية ، وسلوك التجميع الذاتي. لقد أثبتنا مؤخرا أن "النجوم النانوية" للحمض النووي البرمائي ، التي تم الحصول عليها عن طريق تسمية تقاطعات الحمض النووي بشقوق كارهة للماء ، تشكل حلا قويا ومتعدد الاستخدامات بشكل خاص. يمكن برمجة مكثفات الحمض النووي البرمائية الناتجة لعرض البنى الداخلية المعقدة والمتعددة الأجزاء ، والاستجابة هيكليا لمختلف المحفزات الخارجية ، وتوليف الجزيئات الكبيرة ، والتقاط الحمولات وإطلاقها، والخضوع للتحولات المورفولوجية ، والتفاعل مع الخلايا الحية. نوضح هنا بروتوكولات تحضير مكثفات الحمض النووي البرمائية بدءا من قليل النيوكليوتيدات المكونة للحمض النووي. سنتناول (i) الأنظمة أحادية المكون التي تشكل مكثفات موحدة ، (ii) الأنظمة المكونة من عنصرين والتي تشكل مكثفات الغلاف الأساسي ، و (iii) الأنظمة التي يتم فيها تعديل المكثفات لدعم النسخ في المختبر للهياكل النانوية للحمض النووي الريبي.

Introduction

الخلايا الاصطناعية عبارة عن أجهزة بمقياس ميكرومتر (10-50 ميكرومتر) تم إنشاؤها من الأسفل إلى الأعلى لتكرار وظائف وهياكل الخلايا البيولوجية الموجودة ^1,2. غالبا ما ترتبط الخلايا الاصطناعية بأغشية مبنية من حويصلات ثنائية الطبقة الدهنية^{3،4،5،6،7} ، أو بوليميرسومات^8،9 ، أو بروتينوسومات^10،11 ، والتي يمكن استخدامها أيضا ....

Protocol

ملاحظة: ينقسم البروتوكول إلى ثلاثة أقسام. يصف القسم 1 الخطوات الأساسية ، بما في ذلك تحضير قليل النوكليوتيدات الحمض النووي والشعيرات الدموية الزجاجية. يصف القسم 2 تحضير مكثفات C-star ذات التصميمات المختلفة ، بما في ذلك التصميمات المكونة من مكون واحد ومكونين ، واستخراجها من الشعيرات الدموية الزجاجية. يصف القسم 3 استخدام مكثفات C-star المكونة من عنصر واحد لقوالب الحمض النووي الريبي لتخليق أبتامير الحمض النووي الريبي. يجب على المستخدم اتباع الممارسات المعملية الجيدة طوال الوقت ، والتأكد من وجود جميع تقييمات المخاطر اللازمة والتخفيف من حدتها ، وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) ، بما في ذلك القفازات ونظارات السلامة ومعطف المختبر. يتطلب تنظيف الأنابيب الشعرية الزج....

النتائج

بعد التلدين ، يمكن تصوير مكثفات C-star مباشرة في الأنبوب الشعري ، أو بعد الاستخراج ، لتأكيد تكوينها. بالنسبة لجميع الاختلافات في تصميم C-star ، يجب على المرء أن يلاحظ المكثفات الكروية أو متعددة السطوح المميزة التي يبلغ قطرها حوالي 10-50 ميكرومتر ، وتتشكل الأخيرة عند حدوث التبلور^28,32

Discussion

يوفر البروتوكول الموصوف هنا نهجا لتحضير مكثفات مكونة من مكون واحد أو مكونين من نجوم الحمض النووي البرمائية النانوية ، مع اختلافات في التصميم لإدخال استجابات مختلفة في المكثفات. ينتج البروتوكول المعطى مكثفات في محلول عازل يبلغ 0.3 M NaCl في TE ، ولكن يمكن تعديل شروط المخزن المؤقت عن طريق تعديل ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	SLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser	VWR	631-0853
2-Propanol	Sigma-Aldrich	34683
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC	Cole-Parmer	WZ-08895-11
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue	RS	ARA-400005
Bio-Rad C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851197
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid	Fisher Scientific	15338665	2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates
Diamond Scribing Pen	RS	394-217
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI)	Sigma-Aldrich	SML1627
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	0030123301	0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures
Ethanol Absolute 99.8+%	Fisher Scientific	10437341	70% ethanol is sufficient for cleaning purposes
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer	Fisherbrand	13284769
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length	CM Scientific	2540-50
Mineral oil	Sigma-Aldrich	69794
Mini Centrifuge, 230 V	PRISM(TM)	Z763128
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NanoDrop One Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	Custom	Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required.
ScriptGuard RNase inhibitor	CELLSCRIPT	C-SRI6310K	RNase inhibitor
T7-FlashScribe Transcription Kit	Cambio	C-ASF3507
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution	Sigma-Aldrich	574793
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977035
VWR Spec-Wipe 3 Wipers	VWR	21914-758