来自两亲性 DNA 纳米结构的合成凝聚物和细胞样结构

摘要

我们提出了一种制备合成生物分子缩合物的方案，该方案由两亲性 DNA 纳米星组成，从其组成 DNA 寡核苷酸开始。缩合物由单个纳米星组分或两个组分产生，并经过修饰以维持来自包埋 DNA 模板的 RNA 的 体外 转录。

摘要

合成液滴和冷凝物正成为先进仿生系统和合成细胞中越来越常见的成分，它们可用于建立区室化并维持栩栩如生的反应。由于其可编程形状、化学功能化和自组装行为，合成 DNA 纳米结构已显示出作为凝聚物形成结构单元的巨大潜力。我们最近证明，通过用疏水部分标记 DNA 连接获得的两亲性 DNA“纳米星”构成了一种特别强大且用途广泛的解决方案。所得的两亲性 DNA 凝聚物可以被编程为显示复杂的多区室内部结构，在结构上响应各种外部刺激，合成大分子，捕获和释放有效载荷，进行形态转变，并与活细胞相互作用。在这里，我们展示了从组成 DNA 寡核苷酸开始制备两亲性 DNA 缩合物的方案。我们将讨论 （i） 形成均匀缩合物的单组分系统，（ii） 形成核壳凝聚物的双组分系统，以及 （iii） 缩合物被修饰以支持 RNA 纳米结构的 体外 转录的系统。

引言

合成细胞是自下而上构建的微米级 （10-50 μm） 装置，用于复制现存生物细胞的功能和结构 ^1,2。合成细胞通常由脂质双层囊泡 3,4,5,6,7、聚合物体 ^8,9 或蛋白质小体^10,11 构建的膜结合，这些膜也可用于建立内部区室化^12,13。受已知可在活细胞中维持各种功能的无膜细胞器^{的启发 14}，聚合物凝聚物、生物分子凝聚物和水凝胶等结构作为在合成细胞中建立外部和内部区室化的多功能和稳健替代品越来越受欢迎 15,16,17,18。

研究方案

注意：该协议分为三个部分。第 1 节描述了先决条件步骤，包括 DNA 寡核苷酸和玻璃毛细管的制备。第 2 节介绍了各种设计的 C-star 冷凝物的制备，包括单组分和双组分设计，以及从玻璃毛细管中提取它们。第 3 节描述了使用单组分 RNA 模板 C-star 缩合物合成 RNA 适配体。用户必须全程遵循良好的实验室规范，确保所有必要的风险评估和缓解措施都已到位，并佩戴适当的个人防护设备 （PPE），包括手套、安全眼镜和实验室外套。玻璃毛细管的清洁需要进行超声处理，首先在表面活性剂溶液中，然后在异丙醇或乙醇中。从毛细管中提取 C-star 冷凝物需要使用金刚石划线笔对玻璃进行划痕和折断，这可能导致玻璃碎片造成伤害。材料 表中列出了使用的关键材料、设备和试剂。大多数非官能团化寡核苷酸由供应商使用标准脱盐进行纯化，但“扩展核心 1”和“适配体模板”链除外，它们与聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 纯化一起订购。胆固醇修饰的寡核苷酸由供应商使用反相高效液相色谱 （HPLC） 进行纯化。

1. 先决条件

注：以下溶液应在超纯（I 型）水中制备，并使用 0.22 μm 针式过滤器过滤：Tris-EDTA （TE） 缓冲液，包括 10 mM Tris、1 mM EDTA，pH ~8.0;补充有 2 M NaCl 的 TE 缓冲液;和补充有 0.3 M NaCl 的 TE ....

讨论

此处描述的方案提供了一种从两亲性 DNA 纳米星制备单组分或双组分缩合物的方法，其设计变化可将不同的响应引入缩合物中。给定的方案在 TE 中的 0.3 M NaCl 缓冲溶液中产生冷凝物，但可以通过适当修改上面列出的体积来修改缓冲条件。以前的工作研究了 TE 中 0.2 M NaCl 和 TE 中 0.1 M NaCl 以及磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中 C 星缩合物的形成³²。C-star 缩合物的末端浓度为 5 μM，但也可以.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	SLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser	VWR	631-0853
2-Propanol	Sigma-Aldrich	34683
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC	Cole-Parmer	WZ-08895-11
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue	RS	ARA-400005
Bio-Rad C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851197
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid	Fisher Scientific	15338665	2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates
Diamond Scribing Pen	RS	394-217
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI)	Sigma-Aldrich	SML1627
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	0030123301	0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures
Ethanol Absolute 99.8+%	Fisher Scientific	10437341	70% ethanol is sufficient for cleaning purposes
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer	Fisherbrand	13284769
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length	CM Scientific	2540-50
Mineral oil	Sigma-Aldrich	69794
Mini Centrifuge, 230 V	PRISM(TM)	Z763128
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NanoDrop One Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	Custom	Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required.
ScriptGuard RNase inhibitor	CELLSCRIPT	C-SRI6310K	RNase inhibitor
T7-FlashScribe Transcription Kit	Cambio	C-ASF3507
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution	Sigma-Aldrich	574793
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977035
VWR Spec-Wipe 3 Wipers	VWR	21914-758