Amfifilik DNA Nanoyapılarından Sentetik Kondensatlar ve Hücre Benzeri Mimariler

Özet

Kurucu DNA oligonükleotidlerinden başlayarak amfifilik DNA nanoyıldızlarından oluşan sentetik biyomoleküler kondensatların hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Kondensatlar, tek bir nanostar bileşeninden veya iki bileşenden üretilir ve gömülü bir DNA şablonundan RNA'nın in vitro transkripsiyonunu sürdürmek için modifiye edilir.

Özet

Sentetik damlacıklar ve kondensatlar, bölümlere ayırma oluşturmak ve yaşam benzeri tepkileri sürdürmek için kullanılabilecekleri gelişmiş biyomimetik sistemlerin ve sentetik hücrelerin giderek daha yaygın bileşenleri haline gelmektedir. Sentetik DNA nanoyapıları, programlanabilir şekilleri, kimyasal işlevselleştirmeleri ve kendi kendine montaj davranışları nedeniyle yoğuşma oluşturan yapı taşları olarak önemli bir potansiyel göstermiştir. Son zamanlarda, DNA bağlantılarının hidrofobik kısımlarla etiketlenmesiyle elde edilen amfifilik DNA "nanostarlarının" özellikle sağlam ve çok yönlü bir çözüm oluşturduğunu gösterdik. Elde edilen amfifilik DNA kondensatları, karmaşık, çok bölmeli iç mimarileri sergilemek, çeşitli dış uyaranlara yapısal olarak yanıt vermek, makromolekülleri sentezlemek, yükleri yakalamak ve serbest bırakmak, morfolojik dönüşümlere uğramak ve canlı hücrelerle etkileşime girmek üzere programlanabilir. Burada, kurucu DNA oligonükleotidlerinden başlayarak amfifilik DNA kondensatlarının hazırlanması için protokoller gösteriyoruz. (i) Tek tip kondensatlar oluşturan tek bileşenli sistemleri, (ii) çekirdek-kabuk kondensatları oluşturan iki bileşenli sistemleri ve (iii) kondensatların RNA nanoyapılarının in vitro transkripsiyonunu desteklemek için modifiye edildiği sistemleri ele alacağız.

Giriş

Sentetik hücreler, mevcut biyolojik hücrelerin işlevlerini ve yapılarını çoğaltmak için aşağıdan yukarıya doğru yapılmış mikrometre ölçekli (10-50 μm) cihazlardır ^1,2. Sentetik hücreler genellikle lipid çift katmanlı veziküller 3,4,5,6,7, polimeromlar ^8,9 veya proteinozomlar ^10,11'den yapılmış zarlarla bağlanır ....

Protokol

NOT: Protokol üç bölüme ayrılmıştır. Bölüm 1, DNA oligonükleotidlerinin ve cam kılcal damarların hazırlanması da dahil olmak üzere ön koşul adımlarını açıklamaktadır. Bölüm 2, bir ve iki bileşenli tasarımlar dahil olmak üzere çeşitli tasarımlardaki C-yıldız kondensatlarının hazırlanmasını ve bunların cam kılcal damarlardan çıkarılmasını açıklar. Bölüm 3, bir RNA aptamerinin sentezi için tek bileşenli RNA şablonlama C-yıldız kondensatlarının kullanımını açıklar. Kullanıcı, baştan sona iyi laboratuvar uygulamalarını takip etmeli, gerekli tüm risk değerlendirmelerinin ve hafifletmelerin yapıldığından emin olmalı ve eldivenler, koruyucu gözlükler ve laboratuvar önlüğü dah....

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol, amfifilik DNA nanoyıldızlarından bir veya iki bileşenli kondensatların hazırlanması için, kondensatlara farklı tepkiler vermek için tasarım varyasyonları ile bir yaklaşım sağlar. Verilen protokol, TE'de 0.3 M NaCl'lik bir tampon çözeltisinde kondensatlar üretir, ancak tampon koşulları, yukarıda listelenen hacimler uygun şekilde değiştirilerek değiştirilebilir. Önceki çalışmalar, TE'de 0.2 M NaCl ve TE'de 0.1 M NaCl'de ve fosfat tamponlu salin (PBS) içinde C-yıl.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	SLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser	VWR	631-0853
2-Propanol	Sigma-Aldrich	34683
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC	Cole-Parmer	WZ-08895-11
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue	RS	ARA-400005
Bio-Rad C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851197
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid	Fisher Scientific	15338665	2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates
Diamond Scribing Pen	RS	394-217
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI)	Sigma-Aldrich	SML1627
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	0030123301	0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures
Ethanol Absolute 99.8+%	Fisher Scientific	10437341	70% ethanol is sufficient for cleaning purposes
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer	Fisherbrand	13284769
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length	CM Scientific	2540-50
Mineral oil	Sigma-Aldrich	69794
Mini Centrifuge, 230 V	PRISM(TM)	Z763128
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NanoDrop One Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	Custom	Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required.
ScriptGuard RNase inhibitor	CELLSCRIPT	C-SRI6310K	RNase inhibitor
T7-FlashScribe Transcription Kit	Cambio	C-ASF3507
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution	Sigma-Aldrich	574793
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977035
VWR Spec-Wipe 3 Wipers	VWR	21914-758