Синтетические конденсаты и клеточные архитектуры из наноструктур амфифильной ДНК

Резюме

Представлен протокол получения синтетических биомолекулярных конденсатов, состоящих из нанозвезд амфифильной ДНК, начиная с входящих в их состав ДНК-олигонуклеотидов. Конденсаты производятся либо из одного нанозвездного компонента, либо из двух компонентов и модифицируются для поддержания транскрипции РНК in vitro из встроенной матрицы ДНК.

Аннотация

Синтетические капли и конденсаты становятся все более распространенными компонентами передовых биомиметических систем и синтетических клеток, где они могут быть использованы для создания компартментализации и поддержания жизненных реакций. Синтетические наноструктуры ДНК продемонстрировали значительный потенциал в качестве строительных блоков, образующих конденсат, благодаря своей программируемой форме, химической функционализации и способности к самосборке. Недавно мы продемонстрировали, что амфифильные ДНК-нанозвезды, полученные путем мечения ДНК-соединений гидрофобными фрагментами, представляют собой особенно надежное и универсальное решение. Полученные конденсаты амфифильной ДНК могут быть запрограммированы на отображение сложных, многокомпонентных внутренних архитектур, структурно реагировать на различные внешние стимулы, синтезировать макромолекулы, захватывать и высвобождать полезную нагрузку, подвергаться морфологическим трансформациям и взаимодействовать с живыми клетками. В данной работе мы демонстрируем протоколы получения конденсатов амфифильных ДНК, начиная с входящих в состав ДНК олигонуклеотидов. Мы рассмотрим (i) однокомпонентные системы, образующие однородные конденсаты, (ii) двухкомпонентные системы, образующие конденсаты ядро-оболочка, и (iii) системы, в которых конденсаты модифицируются для поддержки транскрипции наноструктур РНК in vitro .

Введение

Синтетические клетки представляют собой устройства микрометрового масштаба (10-50 мкм), сконструированные снизу вверх для воспроизведения функций и структур существующих биологических клеток ^1,2. Синтетические клетки часто связаны мембранами, состоящими из липидных двухслойных везикул 3,4,5,6,7, полимерсом ^8,9 или протеиносом^10,11, ко....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол разделен на три раздела. В разделе 1 описаны предварительные этапы, включая получение олигонуклеотидов ДНК и стеклянных капилляров. В разделе 2 описывается приготовление конденсатов типа С-звезда различных конструкций, в том числе одно- и двухкомпонентных, и их извлечение из стеклянных капилляров. В разделе 3 описывается использование однокомпонентных РНК-шаблонов конденсатов C-звезды для синтеза аптамера РНК. Пользователь должен следовать надлежащей лабораторной практике на протяжении всего процесса, убедиться в наличии всех необходимых оценок и мер по снижению рисков, а также носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая п....

Результаты

После отжига конденсаты C-звезды могут быть визуализированы непосредственно в капиллярной трубке или после экстракции, чтобы подтвердить их образование. Для всех вариантов конструкции C-звезды следует наблюдать отчетливые сферические или многогранные конденсаты диаметром примерно 10.......

Обсуждение

Описанный здесь протокол обеспечивает подход к получению одно- или двухкомпонентных конденсатов из нанозвезд амфифильной ДНК с вариациями конструкции для введения различных ответов в конденсаты. В соответствии с данным протоколом образуются конденсаты в буферном растворе 0,3 М NaCl в TE,.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	SLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser	VWR	631-0853
2-Propanol	Sigma-Aldrich	34683
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC	Cole-Parmer	WZ-08895-11
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue	RS	ARA-400005
Bio-Rad C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851197
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid	Fisher Scientific	15338665	2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates
Diamond Scribing Pen	RS	394-217
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI)	Sigma-Aldrich	SML1627
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	0030123301	0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures
Ethanol Absolute 99.8+%	Fisher Scientific	10437341	70% ethanol is sufficient for cleaning purposes
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer	Fisherbrand	13284769
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length	CM Scientific	2540-50
Mineral oil	Sigma-Aldrich	69794
Mini Centrifuge, 230 V	PRISM(TM)	Z763128
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NanoDrop One Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	Custom	Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required.
ScriptGuard RNase inhibitor	CELLSCRIPT	C-SRI6310K	RNase inhibitor
T7-FlashScribe Transcription Kit	Cambio	C-ASF3507
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution	Sigma-Aldrich	574793
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977035
VWR Spec-Wipe 3 Wipers	VWR	21914-758