양친매성 DNA 나노 구조의 합성 응축물 및 세포와 같은 구조

요약

우리는 구성 DNA 올리고뉴클레오티드에서 시작하여 양친매성 DNA 나노스타로 구성된 합성 생체 분자 응축물을 제조하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 응축물은 단일 nanostar 구성 요소 또는 두 가지 구성 요소로 생성되며 내장된 DNA 템플릿에서 RNA의 시험관 내 전사를 유지하도록 변형됩니다.

초록

합성 액적과 응축물은 첨단 생체 모방 시스템 및 합성 세포의 점점 더 흔한 구성 요소가 되고 있으며, 여기서 구획화를 확립하고 실제와 같은 반응을 유지하는 데 사용할 수 있습니다. 합성 DNA 나노 구조는 프로그래밍 가능한 모양, 화학적 기능화 및 자체 조립 거동으로 인해 응축물 형성 빌딩 블록으로서 상당한 잠재력을 보여주었습니다. 우리는 최근에 소수성 부분으로 DNA 접합을 라벨링하여 얻은 양친매성 DNA "나노스타"가 특히 견고하고 다재다능한 솔루션을 구성한다는 것을 입증했습니다. 생성된 양친매성 DNA 응축물은 복잡한 다중 구획 내부 구조를 표시하고, 다양한 외부 자극에 구조적으로 반응하고, 거대분자를 합성하고, 페이로드를 포획 및 방출하고, 형태학적 변형을 겪고, 살아있는 세포와 상호 작용하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 여기에서는 구성 DNA 올리고뉴클레오티드에서 시작하여 양친매성 DNA 응축물을 준비하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. (i) 균일한 응축물을 형성하는 단일 성분 시스템, (ii) 코어 쉘 응축물을 형성하는 2액형 시스템, (iii) RNA 나노 구조의 시험관 내 전사를 지원하기 위해 응축물이 변형되는 시스템에 대해 다룰 것입니다.

서문

합성 세포는 현존하는 생물학적 세포의 기능과 구조를 복제하기 위해 상향식으로 구성된 마이크로미터 규모(10-50 μm) 장치입니다 ^1,2. 합성 세포는 종종 지질 이중층 소포 ^3,4,5,6,7, 폴리머솜 ^8,9 또는 단백질 소체^10,11로 구성된 막에 의해 결합되며, 이는 내부 구획화 ^(12,13)를 확립하는 데에도 사용될 수 있습니다. 살아있는 세포(¹⁴)에서 다양한 기능을 유지하는 것으로 알려진 막이 없는....

프로토콜

참고: 프로토콜은 세 개의 섹션으로 나뉩니다. 섹션 1에서는 DNA 올리고뉴클레오티드 및 유리 모세관의 준비를 포함한 사전 요구 사항 단계를 설명합니다. 섹션 2에서는 1액형 및 2액형 설계를 포함한 다양한 설계의 C-star 응축수를 준비하고 유리 모세관에서 추출하는 방법에 대해 설명합니다. 섹션 3에서는 RNA 압타머의 합성을 위해 C-star 응축물을 템플릿화하는 단일 성분 RNA의 사용에 대해 설명합니다. 사용자는 전체적으로 우수한 실험실 관행을 따르고, 필요한 모든 위험 평가 및 완화 조치가 마련되어 있는지 확인하고, 장갑, 보안경 및 실험실 가운을 포함한 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다. 유리 모세관의 청소는 먼저 계면 활성제 용액으로, 두 번째로 이소프로판올 또는 에탄올로 초음파 처리가 필요합니다. 모세관에서 C-star 응축수를 추출하려면 다이아몬드 스크라이빙 펜을 사용하여 유리에 점수를 매기고 스냅해야 하며, 이와 관련된 유리 파편으로 인한 부상 위험이 있습니다. 사용된 주요 재료, 장비 및 시약은 재료 표에 나열되어 있습니다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 정제와 함께 주문되는 "extended Core 1" 및 "Aptamer template" 가닥을 제외하고, 대부분의 비기능성 올리고뉴클레오티드는 공급업체가 표준 ....

토론

여기에 설명된 프로토콜은 양친매성 DNA 나노별에서 1개 또는 2개 성분의 응축물을 제조하기 위한 접근 방식을 제공하며, 응축물에 다양한 반응을 도입하기 위한 설계 변형을 제공합니다. 주어진 프로토콜은 TE에서 0.3M NaCl의 완충 용액에서 응축수를 생성하지만 위에 나열된 부피를 적절하게 수정하여 완충 조건을 수정할 수 있습니다. 이전 연구에서는 TE의 0.2M NaCl 및 TE의 0.1M NaCl 및 인산염 완충 식?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	SLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser	VWR	631-0853
2-Propanol	Sigma-Aldrich	34683
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC	Cole-Parmer	WZ-08895-11
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue	RS	ARA-400005
Bio-Rad C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851197
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid	Fisher Scientific	15338665	2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates
Diamond Scribing Pen	RS	394-217
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI)	Sigma-Aldrich	SML1627
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	0030123301	0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures
Ethanol Absolute 99.8+%	Fisher Scientific	10437341	70% ethanol is sufficient for cleaning purposes
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer	Fisherbrand	13284769
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length	CM Scientific	2540-50
Mineral oil	Sigma-Aldrich	69794
Mini Centrifuge, 230 V	PRISM(TM)	Z763128
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NanoDrop One Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	Custom	Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required.
ScriptGuard RNase inhibitor	CELLSCRIPT	C-SRI6310K	RNase inhibitor
T7-FlashScribe Transcription Kit	Cambio	C-ASF3507
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution	Sigma-Aldrich	574793
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977035
VWR Spec-Wipe 3 Wipers	VWR	21914-758