Condensados sintéticos y arquitecturas similares a células a partir de nanoestructuras de ADN anfifílico

Resumen

Presentamos un protocolo para la preparación de condensados biomoleculares sintéticos consistentes en nanoestrellas de ADN anfifílico a partir de sus oligonucleótidos de ADN constituyentes. Los condensados se producen a partir de un solo componente de nanoestrella o de dos componentes y se modifican para mantener la transcripción in vitro de ARN a partir de una plantilla de ADN incrustada.

Resumen

Las gotas y condensados sintéticos se están convirtiendo en constituyentes cada vez más comunes de los sistemas biomiméticos avanzados y las células sintéticas, donde se pueden utilizar para establecer la compartimentación y mantener respuestas similares a las de la vida. Las nanoestructuras de ADN sintético han demostrado un potencial significativo como bloques de construcción formadores de condensado debido a su forma programable, funcionalización química y comportamiento de autoensamblaje. Recientemente hemos demostrado que las "nanoestrellas" de ADN anfifílico, obtenidas mediante el marcaje de uniones de ADN con fracciones hidrofóbicas, constituyen una solución particularmente robusta y versátil. Los condensados de ADN anfifílico resultantes pueden programarse para mostrar arquitecturas internas complejas de múltiples compartimentos, responder estructuralmente a diversos estímulos externos, sintetizar macromoléculas, capturar y liberar cargas útiles, sufrir transformaciones morfológicas e interactuar con células vivas. Aquí, demostramos protocolos para la preparación de condensados de ADN anfifílico a partir de oligonucleótidos de ADN constituyentes. Abordaremos (i) sistemas de un solo componente que forman condensados uniformes, (ii) sistemas de dos componentes que forman condensados de núcleo y (iii) sistemas en los que los condensados se modifican para soportar la transcripción in vitro de nanoestructuras de ARN.

Introducción

Las células sintéticas son dispositivos a escala micrométrica (10-50 μm) construidos de abajo hacia arriba para replicar funciones y estructuras de las células biológicas existentes ^1,2. Las células sintéticas a menudo están unidas por membranas construidas a partir de vesículas bicapa lipídica 3,4,5,6,7, polimerosomas ^8,9 o proteinosomas^10,11

Protocolo

NOTA: El protocolo se divide en tres secciones. En la sección 1 se describen los pasos previos, incluida la preparación de oligonucleótidos de ADN y capilares de vidrio. La sección 2 describe la preparación de condensados de estrella C de varios diseños, incluidos diseños de uno y dos componentes, y su extracción de los capilares de vidrio. En la sección 3 se describe el uso de condensados de estrella C de plantillas de ARN de un componente para la síntesis de un aptámero de ARN. El usuario debe seguir las buenas prácticas de laboratorio en todo momento, asegurarse de que se implementen todas las evaluaciones y mitigaciones de riesgos necesarias y usar el equipo de pr....

Discusión

El protocolo descrito aquí proporciona un enfoque para la preparación de condensados de uno o dos componentes a partir de nanoestrellas de ADN anfifílico, con variaciones de diseño para introducir diferentes respuestas en los condensados. El protocolo dado produce condensados en una solución tampón de 0,3 M de NaCl en TE, pero las condiciones tampón pueden modificarse modificando adecuadamente los volúmenes enumerados anteriormente. Trabajos previos han estudiado la formación de condensados de estrella C en 0,2 .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	SLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser	VWR	631-0853
2-Propanol	Sigma-Aldrich	34683
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC	Cole-Parmer	WZ-08895-11
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue	RS	ARA-400005
Bio-Rad C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851197
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid	Fisher Scientific	15338665	2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates
Diamond Scribing Pen	RS	394-217
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI)	Sigma-Aldrich	SML1627
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	0030123301	0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures
Ethanol Absolute 99.8+%	Fisher Scientific	10437341	70% ethanol is sufficient for cleaning purposes
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer	Fisherbrand	13284769
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length	CM Scientific	2540-50
Mineral oil	Sigma-Aldrich	69794
Mini Centrifuge, 230 V	PRISM(TM)	Z763128
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NanoDrop One Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	Custom	Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required.
ScriptGuard RNase inhibitor	CELLSCRIPT	C-SRI6310K	RNase inhibitor
T7-FlashScribe Transcription Kit	Cambio	C-ASF3507
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution	Sigma-Aldrich	574793
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977035
VWR Spec-Wipe 3 Wipers	VWR	21914-758