両親媒性DNAナノ構造からの合成凝縮物と細胞様構造

要約

両親媒性DNAナノスターからなる合成生体分子凝縮体を、その構成DNAオリゴヌクレオチドから調製するためのプロトコールを提示します。縮合物は、単一のナノスター成分または2つの成分から産生され、埋め込まれたDNAテンプレートからのRNAの in vitro 転写を維持するように修飾されます。

要約

合成液滴や凝縮物は、高度な生体模倣システムや合成細胞の成分としてますます一般的になりつつあり、それらを使用して区画化を確立し、生命のような応答を維持することができます。合成DNAナノ構造は、そのプログラム可能な形状、化学的官能基化、および自己組織化挙動により、凝縮物形成ビルディングブロックとして大きな可能性を示しています。私たちは最近、DNA結合部を疎水性部分で標識することによって得られる両親媒性DNA「ナノスター」が、特に堅牢で汎用性の高い溶液を構成することを実証しました。得られた両親媒性DNA凝縮体は、複雑なマルチコンパートメントの内部構造を示し、さまざまな外部刺激に構造的に応答し、高分子を合成し、ペイロードを捕捉して放出し、形態学的形質転換を受け、生細胞と相互作用するようにプログラムできます。ここでは、構成DNAオリゴヌクレオチドから始まる両親媒性DNA凝縮体を調製するためのプロトコルを示します。(i)均一な凝縮体を形成する単一成分システム、(ii)コアシェル凝縮体を形成する2成分システム、および(iii)凝縮物がRNAナノ構造の in vitro 転写をサポートするために修飾されるシステムについて説明します。

概要

合成細胞は、現存する生体細胞の機能や構造を再現するためにボトムアップで構築されたマイクロメートルスケール(10-50μm)のデバイスです^1,2。合成細胞は、脂質二重層小胞3,4,5,6,7、ポリマーソーム^8,9、またはプロテオソーム^10,11から構築された膜によって結合されることが多く、これらは内部区画^化12,13を確立するためにも使用できます。生細胞¹⁴で様々な機能を維持することが知られている膜のないオルガネラに触発されて、ポリマーコアセルベイト、生体分....

プロトコル

注:プロトコルは3つのセクションに分かれています。セクション1では、DNAオリゴヌクレオチドやガラスキャピラリーの調製など、前提条件となるステップについて説明します。セクション2では、1成分および2成分設計を含むさまざまな設計のC-star凝縮物の調製と、ガラスキャピラリーからの抽出について説明します。セクション3では、RNAアプタマーの合成のための一成分RNAテンプレートC-スター縮合物の使用について説明します。ユーザーは、全体を通して優れたラボの実践に従い、必要なすべてのリスク評価と軽減策が実施されていることを確認し、手袋、安全メガネ、白衣などの適切な個人用保護具(PPE)を着用する必要があります。ガラス毛細管の洗浄には、最初に界面活性剤溶液で、次にイソプロパノールまたはエタノールで、それらの超音波処理が必要です。キャピラリーチューブからC-star凝縮液を抽出するには、ダイヤモンドスクライビングペンを使用してガラスに切り込みを入れ、スナップする必要がありますが、ガラスの破片による損傷のリスクがあります。使用した主な材料、機器、試薬は 、材料表に記載されています。ほとんどの非官能基化オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)精製で注文される「拡張コア1」および「アプタマーテンプレート」鎖を除き、標準的な脱塩を使用してサプライヤーによって精製されます。コレステロール修飾オリゴヌクレオチドは、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用してサプライヤーによって精製されます....

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、両親媒性DNAナノスターから1成分または2成分の凝縮物を調製するためのアプローチを提供し、凝縮物に異なる応答を導入するための設計バリエーションを備えています。所与のプロトコルは、TE中の0.3 M NaClの緩衝液中で縮合物を生成しますが、上記の容量を適切に変更することにより、緩衝条件を修正することができます。以前の研究では、TEの0.2 M NaCl、TEの0.1.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	SLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser	VWR	631-0853
2-Propanol	Sigma-Aldrich	34683
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC	Cole-Parmer	WZ-08895-11
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue	RS	ARA-400005
Bio-Rad C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851197
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid	Fisher Scientific	15338665	2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates
Diamond Scribing Pen	RS	394-217
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI)	Sigma-Aldrich	SML1627
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	0030123301	0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures
Ethanol Absolute 99.8+%	Fisher Scientific	10437341	70% ethanol is sufficient for cleaning purposes
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer	Fisherbrand	13284769
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length	CM Scientific	2540-50
Mineral oil	Sigma-Aldrich	69794
Mini Centrifuge, 230 V	PRISM(TM)	Z763128
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NanoDrop One Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	Custom	Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required.
ScriptGuard RNase inhibitor	CELLSCRIPT	C-SRI6310K	RNase inhibitor
T7-FlashScribe Transcription Kit	Cambio	C-ASF3507
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution	Sigma-Aldrich	574793
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977035
VWR Spec-Wipe 3 Wipers	VWR	21914-758