Condensats synthétiques et architectures cellulaires à partir de nanostructures d’ADN amphiphiles

Résumé

Nous présentons un protocole pour la préparation de condensats biomoléculaires synthétiques constitués de nanoétoiles d’ADN amphiphiles à partir de leurs oligonucléotides d’ADN constitutifs. Les condensats sont produits à partir d’un seul composant nano-étoile ou de deux composants et sont modifiés pour soutenir la transcription in vitro de l’ARN à partir d’une matrice d’ADN intégrée.

Résumé

Les gouttelettes et les condensats synthétiques deviennent des constituants de plus en plus courants des systèmes biomimétiques avancés et des cellules synthétiques, où ils peuvent être utilisés pour établir une compartimentation et maintenir des réponses réalistes. Les nanostructures d’ADN synthétique ont démontré un potentiel important en tant que blocs de construction formant des condensats en raison de leur forme programmable, de leur fonctionnalisation chimique et de leur comportement d’auto-assemblage. Nous avons récemment démontré que les « nanoétoiles » d’ADN amphiphile, obtenues par marquage de jonctions d’ADN avec des fractions hydrophobes, constituent une solution particulièrement robuste et polyvalente. Les condensats d’ADN amphiphiles qui en résultent peuvent être programmés pour afficher des architectures internes complexes à plusieurs compartiments, répondre structurellement à divers stimuli externes, synthétiser des macromolécules, capturer et libérer des charges utiles, subir des transformations morphologiques et interagir avec des cellules vivantes. Ici, nous démontrons des protocoles de préparation de condensats d’ADN amphiphiles à partir d’oligonucléotides d’ADN constitutifs. Nous aborderons (i) les systèmes à un composant formant des condensats uniformes, (ii) les systèmes à deux composants formant des condensats cœur-coquille, et (iii) les systèmes dans lesquels les condensats sont modifiés pour soutenir la transcription in vitro des nanostructures d’ARN.

Introduction

Les cellules synthétiques sont des dispositifs à l’échelle micrométrique (10-50 μm) construits de bas en haut pour reproduire les fonctions et les structures des cellules biologiques existantes ^1,2. Les cellules synthétiques sont souvent liées par des membranes construites à partir de vésicules bicouches lipidiques 3,4,5,6,7, de polymères ^8,9 ou de protéinosomes

Protocole

REMARQUE : Le protocole est divisé en trois sections. La section 1 décrit les étapes préalables, y compris la préparation des oligonucléotides d’ADN et des capillaires en verre. La section 2 décrit la préparation des condensats en étoile C de divers modèles, y compris les modèles à un et deux composants, et leur extraction des capillaires en verre. La section 3 décrit l’utilisation de condensats d’étoiles C à un composant pour la synthèse d’un aptamère d’ARN. L’utilisateur doit suivre les bonnes pratiques de laboratoire tout au long du processus, s’assurer que toutes les évaluations et mesures d’atténuation des risques nécessaires sont en place, et porter un équipemen....

Discussion

Le protocole décrit ici fournit une approche pour la préparation de condensats à un ou deux composants à partir de nanoétoiles d’ADN amphiphiles, avec des variations de conception pour introduire différentes réponses dans les condensats. Le protocole donné produit des condensats dans une solution tampon de 0,3 M de NaCl dans l’TE, mais les conditions tampons peuvent être modifiées en modifiant de manière appropriée les volumes énumérés ci-dessus. Des travaux antérieurs ont étudié la formation de con.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	SLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser	VWR	631-0853
2-Propanol	Sigma-Aldrich	34683
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC	Cole-Parmer	WZ-08895-11
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue	RS	ARA-400005
Bio-Rad C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851197
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid	Fisher Scientific	15338665	2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates
Diamond Scribing Pen	RS	394-217
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI)	Sigma-Aldrich	SML1627
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	0030123301	0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures
Ethanol Absolute 99.8+%	Fisher Scientific	10437341	70% ethanol is sufficient for cleaning purposes
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer	Fisherbrand	13284769
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length	CM Scientific	2540-50
Mineral oil	Sigma-Aldrich	69794
Mini Centrifuge, 230 V	PRISM(TM)	Z763128
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NanoDrop One Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	Custom	Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required.
ScriptGuard RNase inhibitor	CELLSCRIPT	C-SRI6310K	RNase inhibitor
T7-FlashScribe Transcription Kit	Cambio	C-ASF3507
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution	Sigma-Aldrich	574793
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977035
VWR Spec-Wipe 3 Wipers	VWR	21914-758