Synthetische Kondensate und zellähnliche Architekturen aus amphiphilen DNA-Nanostrukturen

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll zur Herstellung synthetischer biomolekularer Kondensate vor, die aus amphiphilen DNA-Nanosternen bestehen, ausgehend von ihren DNA-Oligonukleotiden. Kondensate werden entweder aus einer einzelnen Nanosternkomponente oder aus zwei Komponenten hergestellt und so modifiziert, dass sie die In-vitro-Transkription von RNA aus einem eingebetteten DNA-Template aufrechterhalten.

Zusammenfassung

Synthetische Tröpfchen und Kondensate werden immer häufiger Bestandteile fortschrittlicher biomimetischer Systeme und synthetischer Zellen, wo sie zur Etablierung von Kompartimenten und zur Aufrechterhaltung lebensechter Reaktionen verwendet werden können. Synthetische DNA-Nanostrukturen haben aufgrund ihrer programmierbaren Form, ihrer chemischen Funktionalisierung und ihres Selbstorganisationsverhaltens ein erhebliches Potenzial als kondensatbildende Bausteine gezeigt. Wir haben kürzlich gezeigt, dass amphiphile DNA-"Nanosterne", die durch Markierung von DNA-Verbindungen mit hydrophoben Anteilen gewonnen werden, eine besonders robuste und vielseitige Lösung darstellen. Die resultierenden amphiphilen DNA-Kondensate können so programmiert werden, dass sie komplexe, mehrteilige interne Architekturen aufweisen, strukturell auf verschiedene externe Reize reagieren, Makromoleküle synthetisieren, Nutzlasten einfangen und freisetzen, morphologische Transformationen durchlaufen und mit lebenden Zellen interagieren. Hier demonstrieren wir Protokolle zur Herstellung amphiphiler DNA-Kondensate ausgehend von den DNA-Oligonukleotiden. Wir werden uns mit (i) Einkomponenten-Systemen befassen, die einheitliche Kondensate bilden, (ii) Zweikomponenten-Systemen, die Kern-Schale-Kondensate bilden, und (iii) Systemen, in denen die Kondensate modifiziert werden, um die In-vitro-Transkription von RNA-Nanostrukturen zu unterstützen.

Einleitung

Synthetische Zellen sind Geräte im Mikrometermaßstab (10-50 μm), die von unten nach oben konstruiert sind, um Funktionen und Strukturen bestehender biologischer Zellen nachzubilden ^1,2. Synthetische Zellen sind häufig durch Membranen gebunden, die aus Lipid-Doppelschichtvesikeln 3,4,5,6,7, Polymersomen ^8,9 oder Proteinosomen^10,11 aufge....

Protokoll

HINWEIS: Das Protokoll ist in drei Abschnitte unterteilt. Abschnitt 1 beschreibt die erforderlichen Schritte, einschließlich der Herstellung von DNA-Oligonukleotiden und Glaskapillaren. Abschnitt 2 beschreibt die Aufbereitung von C-Stern-Kondensaten unterschiedlicher Bauart, einschließlich Ein- und Zweikomponenten-Ausführungen, und deren Extraktion aus den Glaskapillaren. Abschnitt 3 beschreibt die Verwendung von Einkomponenten-RNA-Templating-C-Stern-Kondensaten für die Synthese eines RNA-Aptamers. Der Benutzer muss die gute Laborpraxis durchgehend befolgen, sicherstellen, dass alle erforderlichen Risikobewertungen und -minderungen vorhanden sind, und geeignete persön....

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet einen Ansatz für die Herstellung von Ein- oder Zweikomponenten-Kondensaten aus amphiphilen DNA-Nanosternen, mit Designvariationen, um unterschiedliche Reaktionen in die Kondensate einzuführen. Das gegebene Protokoll erzeugt Kondensate in einer Pufferlösung von 0,3 M NaCl in TE, aber die Pufferbedingungen können durch entsprechende Modifikation der oben aufgeführten Volumina geändert werden. Frühere Arbeiten haben die Bildung von C-Stern-Kondensaten in 0,2 M NaCl in TE und 0,1.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	SLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser	VWR	631-0853
2-Propanol	Sigma-Aldrich	34683
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC	Cole-Parmer	WZ-08895-11
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue	RS	ARA-400005
Bio-Rad C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851197
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid	Fisher Scientific	15338665	2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates
Diamond Scribing Pen	RS	394-217
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI)	Sigma-Aldrich	SML1627
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	0030123301	0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures
Ethanol Absolute 99.8+%	Fisher Scientific	10437341	70% ethanol is sufficient for cleaning purposes
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer	Fisherbrand	13284769
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length	CM Scientific	2540-50
Mineral oil	Sigma-Aldrich	69794
Mini Centrifuge, 230 V	PRISM(TM)	Z763128
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NanoDrop One Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	Custom	Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required.
ScriptGuard RNase inhibitor	CELLSCRIPT	C-SRI6310K	RNase inhibitor
T7-FlashScribe Transcription Kit	Cambio	C-ASF3507
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution	Sigma-Aldrich	574793
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977035
VWR Spec-Wipe 3 Wipers	VWR	21914-758