استخدام الكائنات العضوية المعوية البشرية لفهم ظهارة الأمعاء الدقيقة على مستوى النسخ أحادي الخلية

Summary

يجمع البروتوكول بين تقنية العضوية المعوية البشرية والتحليل النسخي أحادي الخلية لتوفير نظرة ثاقبة مهمة في بيولوجيا الأمعاء غير المستكشفة سابقا.

Abstract

أحدثت ترانسكريبتوميا الخلية الواحدة ثورة في فهمنا لبيولوجيا الخلية في جسم الإنسان. توفر أحدث مزارع الأعضاء المعوية الدقيقة البشرية أنظمة نموذجية خارج الجسم الحي تسد الفجوة بين النماذج الحيوانية والدراسات السريرية. يكشف تطبيق نسخ الخلية الواحدة على نماذج الأعضاء المعوية البشرية (HIO) عن بيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية وعلم وظائف الأعضاء في الجهاز الهضمي غير المعترف بها سابقا. تستخدم منصات النسخ أحادية الخلية المتقدمة تقسيم الموائع الدقيقة والتشفير الشريطي لإنشاء مكتبات cDNA. يمكن تسلسل cDNAs المشفرة بسهولة بواسطة منصات تسلسل الجيل التالي واستخدامها بواسطة أدوات التصور المختلفة لإنشاء الخرائط. هنا ، نصف طرق زراعة وتمييز HIOs المعوية الدقيقة البشرية بتنسيقات وإجراءات مختلفة لعزل الخلايا القابلة للحياة عن هذه الأشكال المناسبة للاستخدام في منصات التنميط النسخي أحادي الخلية. تسهل هذه البروتوكولات والإجراءات استخدام HIOs المعوية الدقيقة للحصول على فهم متزايد للاستجابة الخلوية لظهارة الأمعاء البشرية على مستوى النسخ في سياق مجموعة متنوعة من البيئات المختلفة.

Introduction

تحتوي ظهارة الأمعاء الدقيقة على منطقتين متميزتين: القبو الذي يضم الخلايا الجذعية المعوية (ISC) والزغابات ، التي تتكون من خلايا متمايزة من السلالات الإفرازية والامتصاصية. إضافة إلى هذا التعقيد هو الخصوصية الإقليمية للظهارة التي توفر خصائص وظيفية فريدة بين مناطق الأمعاء الدقيقة. أنشأ العمل الرائد ظروفا استزراعية يمكن فيها إنشاء كل من سرداب الأمعاء الدقيقة البشرية ومناطق الزغابات خارج الجسم الحي من الأنسجة الجراحية أو خزعات الأنسجة¹. تعمل هذه الثقافات على سد الفجوة بين الدراسات على والتجارب السريرية وتكشف عن بيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية وعلم وظائف الأعضاء في الجهاز الهضمي غير المعترف بها سابقا. يتم نشر HIOs كهياكل كروية 3D باستخدام وسائط مع عوامل النمو التي تعزز صلاحية الخلايا الجذعية ومصفوفات الدعم خارج الخلية. تؤدي هذه الحالات إلى نموذج HIO يشبه القبو يتكون في الغالب من أسلاف وخلايا جذعية. تعزز إزالة عوامل النمو تمايز مركز الدراسات الدولي (نموذج يشبه الزغابات) وإنتاج الخلايا الظهارية المعوية الناضجة (الكأس ، الغدد الصماء المعوية ، الخصلة ، الخلايا المعوية) بنسب مناسبة جنبا إلى جنب مع تكاثر الخلايا والتمايز ، والاستقطاب ، وسلامة الحاجز ، والسمات الإقليمية المحددة ، والاستجابات الفسيولوجية المناسبة². ثقافات HIO مستقرة وراثيا ويمكن نشرها إلى أجل غير مسمى في حالتها الشبيهة بالسرداب. يتم توفير سهولة الوصول إلى السطح القمي لهذه الثقافات من خلال ظروف الاستزراع التي تسمح بالنمو في شكل أحادي الطبقة³. تسمح HIOs أيضا بتضمين اعتبارات التباين الفردي المضيف مثل الوراثة والعمر والجنس والعرق وحالة المرض في التحليلات البيولوجية. تتطابق أدوات التقييم التحليلي والوظيفي مع تلك المستخدمة في الأساليب التي تركز على خطوط الخلايا المحولة وتشمل مجموعة متنوعة من التقنيات الجزيئية مثل قياس التدفق الخلوي ، والفحص المجهري ، والنسخ ، والبروتينات ، والأيض.

تحدث ترانسكريبتوميا الخلية الواحدة ثورة في فهمنا لبيولوجيا وفسيولوجيا الأمعاء الدقيقة من خلال توفير نظرة ثاقبة للمساهمات الفردية لكل نوع من الخلايا في عملية بيولوجية. قدم العمل الرائد باستخدام هذه التقنية مشهدا لأنواع الخلايا الموجودة في الأمعاء البشرية^{الأصلية 4،5،6}. تسمح منصات التنميط النسخي أحادي الخلية باستكشاف المشهد النسخي للخلايا الفردية ، مما يسمح لعدم تجانس الخلية بالظهور في طليعة الاستكشاف العلمي. في بعض منصات التنميط النسخي أحادي الخلية ، يتم استخدام تقسيم الموائع الدقيقة والتشفير الشريطي لإنشاء مكتبات cDNA من mRNAs الخلوية متعددة الأدينيل التي تم الحصول عليها من ما يصل إلى 10000 خلية لكل عينة. على هذه المنصة ، تشكل القطرات التي تحتوي على خلايا مفردة ، وقليل النيوكليوتيدات المشفر ، وكواشف النسخ العكسي ، والزيت حويصلة تفاعل ينتج عنها جميع cDNAs من خلية واحدة لها نفس الرمز الشريطي. يمكن بعد ذلك تسلسل cDNAs المشفرة بكفاءة باستخدام تسلسل الجيل التالي. يمكن التعامل مع البيانات التي تم إنشاؤها من خلال البرامج وأدوات التصور ، والتي تحول التسلسلات المشفرة إلى خرائط تصور وملفات تعريف نسخ خلية واحدة. يمكن تحديد مجموعات الخلايا باستخدام قواعد البيانات المتاحة للجمهور لظهارة الأمعاء الدقيقة^{البشرية 4،5،6}. على الرغم من أن العديد من الدراسات قد استخدمت هذه المنصة لاستجواب عضويات الأمعاء في الفئران على مستوى الخلية المفردة ، إلا أن تحليل استجابات النسخ أحادية الخلية ل HIOs قد تخلف عن^{7،8،9،10،11،12}.

هنا ، نقدم دليلا تفصيليا لعزل الخلايا القابلة للحياة من HIOs المعوية الدقيقة للمعالجة على منصات التنميط النسخي أحادي الخلية (الشكل 1). نحن نقدم إرشادات الثقافة والتمايز جنبا إلى جنب مع مكونات الوسائط التي تم تحسينها للتمايز الظهاري. نحدد طرق استعادة الخلايا لثلاثة تنسيقات مختلفة للثقافة: الثقافات ثلاثية الأبعاد (3D) وأحادية الطبقة إما على البلاستيك أو على إدراج ثقافة الخلايا الغشائية. نحن نقدم عينات من بيانات التجميع التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج مفتوح المصدر لاشتقاق الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي في كل مجموعة.

Protocol

تم الحصول على الخطوط العضوية المستخدمة هنا من مركز أمراض الجهاز الهضمي في مركز تكساس الطبي GEMS Core. باختصار ، لإنشاء خطوط عضوية في البداية ، تم غسل عينات الأنسجة المانحة وهضمها إنزيميا لتحرير الخبايا المعوية. تم تضمين الخبايا في غشاء قاعدي واستزراعها في وسط. وافق مجلس المراجعة المؤسسية في كلية بايلور للطب على بروتوكول الدراسة للحصول على عينات الأنسجة التي تم إنشاء خطوط عضوية منها ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المتبرعين لإنشاء خطوط عضوية من الأنسجة المتبرع بها.

1. تمرير HIOs 3D لتوسيع التمايز

1. قم بإزالة وتجاهل الوسط من آبار المواد العضوية المزروعة في 24 لوحة بئر (حول الغشاء القاعدي الصلب) باستخدام ماصة P1000. أضف 300 ميكرولتر من 0.05٪ Trypsin-EDTA إلى البئر وقم بتفتيت المواد العضوية ميكانيكيا عن طريق السحب باستخدام ماصة P1000 لأعلى ولأسفل 5x.
2. احتضان الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. أضف 500 ميكرولتر من الوسائط الكاملة بدون عوامل نمو (CMGF- متوسط) مع 10٪ FBS لكل بئر (الجدول 1). استخدم ماصة P1000 وماصة CMGF متوسطة وخليط HIO ، 10x ذهابا وإيابا في البئر. انقل الحجم بالكامل إلى أنبوب سعة 15 مل. اجمع بين المرور من آبار متعددة في نفس الأنبوب سعة 15 مل. لا تجمع بين أكثر من 10 آبار لكل أنبوب.
3. قم بتدوير الخلايا عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي دوار متأرجح عند 100 × جم لمدة 5 دقائق. إزالة كل الوسط ، والحفاظ على بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. الحفاظ على الأنبوب على الجليد.
4. احسب كمية الغشاء القاعدي اللازمة لعدد مطلي HIO ، وأعد تعليق حبيبات HIO في 30 ميكرولتر / بئر من الغشاء القاعدي باستخدام أطراف ماصة P200 الباردة. ماصة خليط الغشاء القاعدي HIO كقطرة في وسط صفيحة 24 بئرا باستخدام أطراف ماصة P200 الباردة.
5. انقل اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية. دع الغشاء القاعدي يتجمد لمدة 5-10 دقائق ، ثم أضف 500 ميكرولتر من وسط درجة حرارة الغرفة الكامل الذي يحتوي على مثبط WNT و R-spondin و noggin و EGF و ROCK (WRNE + Y ؛ الجدول 1) لكل بئر وثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية. قم بتحديث الثقافة باستخدام WRNE + Y كل يوم لمدة 7 أيام.
   ملاحظة: سيكون HIO الصحي كيسي الشكل مع ظهارة ناشئة لامعة (الشكل 2). لا يمكن تصور الخلايا الموجودة في منتصف الكيس. سيبدو HIO غير الصحي باهتا وله ظهارة سميكة ذات وسط صلب. السمة الأكثر أهمية هي المظهر اللامع.

2. التمايز هيو: تنسيق 3D

1. استخدم بئرا واحدا من HIOs ثلاثي الأبعاد ل 3 آبار من HIOs المتمايزة ثلاثية الأبعاد بعد أسبوع من الزراعة.
2. إزالة الوسائط من الآبار. قم بتفريق الغشاء القاعدي و HIOs باستخدام ماصة P1000 وإضافة 500 ميكرولتر باردة من CMGF- لكل بئر وماصة لأعلى ولأسفل على الأقل 5x. قم بتدوير HIOs عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي دوار متأرجح عند 100 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة كل الوسط مع إبقاء الحبيبات في قاع الأنبوب.
3. أضف 30 ميكرولتر من الغشاء القاعدي لكل بئر من HIOs المطلية. ماصة قطرة 30 ميكرولتر من الغشاء القاعدي مع HIOs في بئر من لوحة 24 بئر. احتضان على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أضف 500 ميكرولتر من وسائط WRNE + Y / Diff (50/50).
4. قم بتبديل الوسيط إلى وسيط التمايز بعد 24 ساعة لمدة 3 أيام إضافية ، مع تحديث الوسيط كل يوم. قم بإعداد 3 آبار لكل عينة للتجميع لتقليل التباين الفني.

3. تمايز HIO: تنسيق أحادي الطبقة

1. قم بتغطية حشوات زراعة الخلايا الغشائية أو آبار صفيحة 96 بئرا مع 100 ميكرولتر / بئر من كولاجين المشيمة البشري IV (1 مجم / مل في حمض الأسيتيك 100mM) المخفف في H₂O البارد (1:30). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1.5 ساعة أو الحد الأقصى بين عشية وضحاها. لإدراج زراعة الخلايا الغشائية ، أضف H₂O المعقم في مساحة اللوحة لترطيب اللوحة ؛ بالنسبة للوحة 96 بئرا ، أضف H₂O المعقمة في الآبار غير المستخدمة.
2. اجمع 3D HIOs المزروعة في WRNE لمدة 7 أيام عن طريق إزالة الوسائط واستعادة الغشاء القاعدي والخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر / بئر بارد 0.5 mM EDTA (0.5 M EDTA مخفف 1: 1000 في PBS معقم). استخدم ماصة P1000 لسحب المواد العضوية والحل لأعلى ولأسفل 5x وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 15 مل. لا تجمع أكثر من 10 آبار من المواد العضوية لكل أنبوب. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم في دوار دلو متأرجح عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: لإعداد 3 آبار على لوحة 96 بئر ، استخدم 1 بئر من HIOs ثلاثية الأبعاد. لتحضير 1 إدراج زراعة خلية غشائية ، استخدم بئرا واحدا من 3D HIOs (كثافة البذر للخلايا المفردة حوالي 1-2 × 10⁵ خلايا / بئر للوحة 96 بئرا ، 2.5-3 × 10⁵ خلايا / بئر لإدراج ثقافة الخلايا الغشائية).
3. قم بإزالة 500 ميكرولتر من الوسائط ، وترك الحبيبات في قاع الأنبوب. افصل HIOs عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من 0.05٪ تربسين / 0.5 مللي متر EDTA واحتضانها لمدة 4-5 دقائق عند 37 درجة مئوية. ماصة بقوة صعودا وهبوطا ل ~ 50x باستخدام P1000. تجنب صنع الفقاعات عن طريق الانزلاق على جانب الأنبوب.
4. قم بإلغاء تنشيط التربسين بإضافة 1 مل من CMGF - يحتوي على 10٪ FBS. قم بتصفية كتل كبيرة من الخلايا غير المهضومة عن طريق ترطيب مصفاة خلايا 40 ميكرومتر مع 1 مل من CMGF - تحتوي على 10٪ FBS وإضافة الخلايا إلى أعلى مصفاة الخلية. استخدم الجاذبية للسماح للخلايا بالمرور عبر المصفاة وتجاهل مصفاة الخلية التي تحتوي على كتل خلوية.
5. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 400 × جم في دوار دلو متأرجح في درجة حرارة الغرفة.
6. قم بإزالة السائل من ملحق زراعة الخلايا الغشائية المغلفة بالكولاجين أو من لوحة 96 بئرا. أعد تعليق حبيبات HIO في 100 ميكرولتر / بئر من WRNE تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 ، ثم ماصة في الجزء العلوي من إدخال زراعة الخلايا الغشائية أو في لوحة 96 بئرا. لإدخال زراعة الخلايا الغشائية ، أضف 600 ميكرولتر من WRNE تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 في الجزء السفلي من البئر.
7. قم بإزالة الوسط بعد 24 ساعة من كل من الجزء العلوي والسفلي من إدخال زراعة الخلايا الغشائية أو من لوحة 96 بئرا واستبدلها بوسط تمايز لمدة 5 أيام. قم بإعداد 3 آبار لكل عينة للتجميع لتقليل التباين الفني.

4. إعداد معلقات خلية واحدة من HIOs 3D متمايزة لنسخ خلية واحدة

1. ضع كاشف هضم الخلايا الأنزيمية عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ لإذابة الجليد وتسخينه قبل 30 دقيقة من بدء الهضم ثلاثي الأبعاد HIO. تحقق من HIOs باستخدام مجهر المجال الساطع عند 10x لضمان صحة الخلية.
2. قم بإزالة الوسائط من الآبار وأضف 500 ميكرولتر من محلول استعادة الخلايا الباردة إلى الآبار. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لتحرير الخلايا من الغشاء القاعدي باستخدام ماصة P1000 وأطراف ماصة قياسية. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
   ملاحظة: يضمن استخدام الآبار المكررة أعداد كافية من الخلايا ويقلل من التباين من بئر إلى بئر. لا تجمع الآبار قبل الخطوة 4.7 أدناه.
3. احتضان أنابيب الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق ، ماصة صعودا وهبوطا كل 5 دقائق. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 400 × غرام عند 4 درجات مئوية.
4. أخرج السائل من الأنبوب ، مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الخلية. إعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من كاشف هضم الخلايا الأنزيمية قبل التسخين. ماصة صعودا وهبوطا مع P1000 على الأقل 10x.
5. احتضان HIOs لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ . كل 10 دقائق ، ماصة الحجم بالكامل 10x باستخدام ماصة P1000 للمساعدة في فصل الخلايا. تجنب إدخال فقاعات الهواء في تعليق الخلية.
6. حبيبات الخلايا لمدة 3 دقائق عند 400 × غرام عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسائط التمايز ، وتخزينها على الجليد.
   ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، يجب دائما الاحتفاظ ب HIOs على الجليد.
7. ماصة الخلايا لأعلى ولأسفل بسرعة 50x باستخدام P1000 لضمان فصل HIOs إلى خلايا مفردة. احرص على عدم إدخال فقاعات الهواء في هذه الخطوة ، لأنها ستسبب فقدان الخلايا.
8. قم بتصفية الحجم بالكامل من خلال مصفاة طرف 70 ميكرومتر باستخدام طرف ماصة P1000. استخدم أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل لجمع الشحم.
   ملاحظة: لن يتم انسداد طرف المرشح إذا كان وقت الهضم كافيا. استخدم نصائح تصفية متعددة إذا أصبح الفلتر مسدودا ؛ لا تجبر مستوى الصوت من خلال الفلتر.
9. كرر الخطوة 4.8 باستخدام مصفاة طرف 40 ميكرومتر. تخزين العينات على الجليد.
10. عد الخلايا المفردة القابلة للحياة في غرفة عد الخلايا باستخدام استبعاد التريبان الأزرق عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان أزرق إلى 5 ميكرولتر من تعليق الخلية. خفف العينة حسب الحاجة إلى 1000 خلية / ميكرولتر. إذا كانت كثافة الخلية أقل من 1000 خلية / ميكرولتر ، خلايا الحبيبات لمدة 2 دقيقة عند 400 × جم عند 4 درجات مئوية ، قم بإزالة الوسائط الأصلية ، وأعد التعليق في وسائط زراعة الخلايا. ينتج عن هذا البروتوكول عادة 5 × 10^5-1 × 10⁶ خلايا.
    ملاحظة: يعد تحضير معلق عالي الجودة (90٪ قابل للتطبيق و 90٪ خلية مفردة) أمرا ضروريا للحصول على بيانات أحادية الخلية عالية الجودة. ومع ذلك ، تشير التجربة إلى أنه يمكن قبول قابلية منخفضة تصل إلى 75٪ في الحالات التي يؤثر فيها العلاج ، مثل العدوى أو تطبيق جزيء صغير ، على قابلية البقاء.
11. قم بإعداد مكتبات الحمض النووي لمنصات التنميط النسخي أحادي الخلية وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة. معالجة البيانات وفقا لبروتوكولات أفضل الممارسات لتحليل بيانات scRNAseq^13,14.

5. إعداد معلقات خلية واحدة من HIOs متباينة على إدراج ثقافة الخلايا الغشائية

1. ضع كاشف هضم الخلايا الأنزيمية عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ لإذابة الجليد وتسخينه قبل 30 دقيقة من بدء عملية الهضم في زراعة الخلايا الغشائية HIO. قسم كاشف هضم الخلايا الأنزيمية الذي تم تسخينه مسبقا إلى 200 ميكرولتر من القسامات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل ، وأنبوب واحد لكل إدراج لثقافة الخلايا الغشائية. احتفظ بالأنابيب في حاضنة 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
2. قم بإعداد PBS-EDTA بإضافة 5 ميكرولتر من 0.5 M EDTA إلى 5 مل من PBS. القسمة 500 ميكرولتر من PBS-EDTA في لوحة 24 بئر ، 1 بئر لكل إدراج ثقافة خلية غشاء.
3. اغسل الخلايا باستخدام PBS-EDTA: انقل إدخالات زراعة الخلايا الغشائية من الآبار التي تحتوي على وسائط نمو إلى الآبار التي تحتوي على PBS-EDTA. قم بإزالة وسائط زراعة الخلايا من الجانب القمي واستبدلها ب 100 ميكرولتر من PBS-EDTA. احرص على عدم إزعاج طبقة الخلية.
4. تخلص على الفور من PBS-EDTA المضاف إلى الجانب القمي من إدخالات زراعة الخلايا الغشائية. قم بإزالة ملحق زراعة الخلايا الغشائية من البئر ، وامسحه عن طريق لمس الحافة برفق بمنشفة ورقية ، ثم قلبه على سطح الطاولة. استخدم شفرة مشرط حادة لإزالة الغشاء من الملحق عن طريق قطع المحيط الداخلي للغشاء. العمل بسرعة لمنع الجفاف.
5. استخدم ملقط لنقل الغشاء إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل المسخن مسبقا والمملوء بكاشف هضم الخلايا الأنزيمية وتأكد من غمر الغشاء بالكامل. كرر لجميع حشوات زراعة الخلايا الغشائية الإضافية.
   ملاحظة: زيادة حجم كاشف هضم الخلايا الأنزيمية إلى 500 ميكرولتر قد يساعد في فصل الطبقات الأحادية الكثيفة.
6. فصل الخلايا عن طريق احتضان الأنابيب مع الأغشية عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ . امزج عن طريق سحب الحجم بالكامل برفق 5 أضعاف مع ماصة 200 ميكرولتر كل 10 دقائق بإجمالي 30 دقيقة. تجنب الفقاعات وشفط الغشاء للحفاظ على صلاحيته.
7. نقل حصة صغيرة من الخلايا (1-2 ميكرولتر) إلى شريحة زجاجية كل 10 دقائق لتقييم التفكك عن طريق التقييم النوعي لنسبة الخلايا المفردة. قد يستغرق الأمر ما يصل إلى 50 دقيقة مع سحب إضافي لتحقيق 80٪ -90٪ خلايا مفردة ، اعتمادا على نوع HIO. اكشط الغشاء برفق بطرف ماصة أثناء خطوات الخلط لتشجيع التفكك ، خاصة بالنسبة للخلايا التي يصعب فصلها ، ولكن الكشط قد يؤثر على قابلية الحياة.
8. اجمع بين 3 آبار مكررة لكل حالة في أنبوب طرد مركزي واحد سعة 1.5 مل (إجمالي 600 ميكرولتر). أضف 400 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا (فرق) + 10 ميكرومتر ROCKi (الحجم الإجمالي 1 مل). تخلط بلطف عن طريق الماصة.
   ملاحظة: يضمن استخدام الآبار المكررة أعداد كافية من الخلايا ويقلل من التباين من بئر إلى بئر. يجب تجميع الآبار في هذه الخطوة.
9. قم بتصفية الحجم بالكامل من خلال مصفاة طرف 70 ميكرومتر باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل. اجمع التدفق في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل.
   ملاحظة: لن يتم انسداد طرف المرشح إذا كان وقت الهضم كافيا. استخدم نصائح تصفية متعددة إذا أصبح الفلتر مسدودا ؛ لا تجبر مستوى الصوت على المرور.
10. كرر الخطوة 5.9 باستخدام مصفاة طرف 40 ميكرومتر. تخزين العينات على الجليد.
11. عد الخلايا المفردة القابلة للحياة في غرفة عد الخلايا باستخدام استبعاد التريبان الأزرق عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان أزرق إلى 5 ميكرولتر من تعليق الخلية. تمييع العينة حسب الحاجة إلى 1000 خلية / ميكرولتر. إذا كانت كثافة الخلية أقل من 1000 خلية / ميكرولتر, تدور 2 دقيقة عند 400 × غرام عند 4 °C لتكوير الخلايا, إزالة الوسائط الأصلية, وإعادة التعليق في WRNE + Y عند كثافة الخلية المطلوبة. ينتج هذا البروتوكول عادة 4 × 10⁵ - 6 × 10⁵ خلايا.
    ملاحظة: يعد تحضير معلق عالي الجودة (90٪ خلايا قابلة للحياة و 90٪ خلايا مفردة) أمرا ضروريا للحصول على بيانات أحادية الخلية عالية الجودة. ومع ذلك ، تشير التجربة إلى أنه يمكن قبول قابلية منخفضة تصل إلى 75٪ في الحالات التي يؤثر فيها العلاج ، مثل العدوى أو تطبيق جزيء صغير ، على قابلية البقاء.
12. قم بإعداد مكتبات الحمض النووي لمنصات التنميط النسخي أحادي الخلية وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة. معالجة البيانات وفقا لبروتوكولات أفضل الممارسات لتحليل بيانات scRNAseq^13,14.

6. تحضير معلقات أحادية الخلية من HIOs متباينة على أنها 96 بئرا أحادية الطبقة

1. ضع كاشف هضم الخلايا الأنزيمية عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ لإذابة الجليد وتسخينه قبل 30 دقيقة من بدء هضم HIO أحادي الطبقة.
2. قم بإعداد PBS-EDTA بإضافة 5 ميكرولتر من 0.5 M EDTA إلى 5 مل من PBS. تخلص من وسائط زراعة الخلايا من لوحة 96 بئرا واستبدلها ب 100 ميكرولتر من PBS-EDTA. احرص على عدم إزعاج طبقة الخلية.
3. فصل الخلايا: تخلص من PBS-EDTA وأضف 100 ميكرولتر من كاشف هضم الخلايا الأنزيمية الدافئة إلى كل بئر. ضع اللوحة في درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ بنسبة 5٪ واخلطها عن طريق سحب الحجم بالكامل برفق 5x بطرف ماصة 200 ميكرولتر كل 10 دقائق لمدة 20-30 دقيقة. تجنب الفقاعات للحفاظ على الجدوى.
   ملاحظة: زيادة حجم كاشف هضم الخلايا الأنزيمية إلى 500 ميكرولتر قد يساعد في فصل الطبقات الأحادية الكثيفة.
4. انقل حصة صغيرة من الخلايا (1-2 ميكرولتر) إلى شريحة زجاجية كل 10 دقائق لتقييم التفكك. قد يستغرق الأمر ما يصل إلى 50 دقيقة لتحقيق 80٪ -90٪ خلايا مفردة ، اعتمادا على نوع HIO. اكشط اللوحة برفق بطرف ماصة أثناء خطوات الخلط لتشجيع التفكك ، خاصة بالنسبة للخلايا التي يصعب فصلها ؛ ومع ذلك ، قد يؤثر القشط على الجدوى.
5. اجمع بين 3 آبار مكررة لكل حالة في أنبوب طرد مركزي واحد سعة 1.5 مل (إجمالي 300 ميكرولتر). أضف 700 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا (فرق) + 10 ميكرومتر ROCKi (حجم إجمالي 1 مل). تخلط بلطف عن طريق الماصة.
   ملاحظة: يضمن استخدام الآبار المزروعة المكررة أعدادا كافية من الخلايا ويقلل من التباين من بئر إلى بئر.
6. قم بتصفية الحجم بالكامل من خلال مصفاة طرف 70 ميكرومتر باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل. اجمع التدفق في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل.
   ملاحظة: لن يتم انسداد طرف المرشح إذا كان وقت هضم كاشف هضم الخلايا الأنزيمية كافيا. استخدم نصائح تصفية متعددة إذا أصبح الفلتر مسدودا ؛ لا تجبر مستوى الصوت على المرور.
7. كرر الخطوة 6.6 باستخدام مصفاة طرف 40 ميكرومتر. تخزين العينات على الجليد.
8. عد الخلايا المفردة القابلة للحياة في غرفة عد الخلايا باستخدام استبعاد التريبان الأزرق عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان أزرق إلى 5 ميكرولتر من تعليق الخلية. خفف حسب الحاجة إلى 1000 خلية / ميكرولتر. إذا كانت كثافة الخلية أقل من 1000 خلية / ميكرولتر ، فقم بتدوير 2 دقيقة عند 400 × جم 4 درجة مئوية لتكوير الخلايا وإزالة الوسائط الأصلية وإعادة التعليق في وسائط زراعة الخلايا + ROCKi بكثافة الخلية المطلوبة. ينتج عن هذا البروتوكول عادة 2 × 10⁵ - 6 × 10⁵ خلايا.
   ملاحظة: يعد تحضير معلق عالي الجودة (90٪ خلايا قابلة للحياة و 90٪ خلايا مفردة) أمرا ضروريا للحصول على بيانات أحادية الخلية عالية الجودة. ومع ذلك ، تشير التجربة إلى أنه يمكن قبول قابلية منخفضة تصل إلى 75٪ في الحالات التي يؤثر فيها العلاج ، مثل العدوى أو تطبيق جزيء صغير ، على قابلية البقاء.
9. قم بإعداد مكتبات الحمض النووي وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة لمنصة التنميط النسخي أحادية الخلية. معالجة البيانات وفقا لبروتوكولات أفضل الممارسات لتحليل بيانات scRNAseq^13,14.

النتائج

تم تجميع المعلقات أحادية الخلية من 2-3 آبار من إدخال زراعة الخلايا الغشائية ، والطبقة الأحادية ، و HIOs ثلاثية الأبعاد لضمان إنتاجية كافية للخلايا وتقليل التباين من بئر إلى بئر. تم إعداد مكتبات الخلية المفردة باستخدام كواشف خاصة بمنصة التنميط النسخي أحادي الخلية. وتسلسلها مع قراءات نهاية مق?...

Discussion

باستخدام منصات الجينوم أحادية الخلية ، يمكن تقسيم الأنظمة البيولوجية المعقدة ، مثل ثقافات HIO المشتقة من الأنسجة التي تشكل ظهارة الأمعاء ، للحصول على مساهمات خلوية فردية في الاستجابة البيولوجية الشاملة^4،5،6. يمكن أيضا تحديد عدم التجانس ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145	10 nM
0.05% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.4% Trypan blue	Millipore-Sigma	T8154
0.5 M EDTA	Corning	46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-	Corning	21-040-CM
24 mm Transwell	Costar	3412
24 well Nunclon delta surface tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
40 µm cell strainer	Falcon	352340
40 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0040
70 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0070
96 well plate	Corning	3595
A-83-01	Tocris	2939	500 nM
Accutase	StemCell Technologies	7920
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	1X
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000128
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG	33 µg/mL
Corning Cell Recovery Solution	VWR	354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)	Invitrogen	14190-136	1X
GlutaMAX-I	Invitrogen	35050-061	2 mM
HEPES 1M	Invitrogen	15630-080	10 mM
L-WRN conditioned media	ATCC	CRL-3276
Matrigel, GFR, phenol free	Corning	356231
mouse recombinant EGF	Invitrogen	PMG8043	50 ng/mL
N2 supplement	Invitrogen	17502-048	1X
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G	500 µM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	10 mM
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067	10 µM
Transwell	Corning	3413
Y27632	Stem Cell Technologies	72308	10 µM