استخدام الكائنات العضوية المعوية البشرية لفهم ظهارة الأمعاء الدقيقة على مستوى النسخ أحادي الخلية

Summary

يجمع البروتوكول بين تقنية العضوية المعوية البشرية والتحليل النسخي أحادي الخلية لتوفير نظرة ثاقبة مهمة في بيولوجيا الأمعاء غير المستكشفة سابقا.

Abstract

أحدثت ترانسكريبتوميا الخلية الواحدة ثورة في فهمنا لبيولوجيا الخلية في جسم الإنسان. توفر أحدث مزارع الأعضاء المعوية الدقيقة البشرية أنظمة نموذجية خارج الجسم الحي تسد الفجوة بين النماذج الحيوانية والدراسات السريرية. يكشف تطبيق نسخ الخلية الواحدة على نماذج الأعضاء المعوية البشرية (HIO) عن بيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية وعلم وظائف الأعضاء في الجهاز الهضمي غير المعترف بها سابقا. تستخدم منصات النسخ أحادية الخلية المتقدمة تقسيم الموائع الدقيقة والتشفير الشريطي لإنشاء مكتبات cDNA. يمكن تسلسل cDNAs المشفرة بسهولة بواسطة منصات تسلسل الجيل التالي واستخدامها بواسطة أدوات التصور المختلفة لإنشاء الخرائط. هنا ، نصف طرق زراعة وتمييز HIOs المعوية الدقيقة البشرية بتنسيقات وإجراءات مختلفة لعزل الخلايا القابلة للحياة عن هذه الأشكال المناسبة للاستخدام في منصات التنميط النسخي أحادي الخلية. تسهل هذه البروتوكولات والإجراءات استخدام HIOs المعوية الدقيقة للحصول على فهم متزايد للاستجابة الخلوية لظهارة الأمعاء البشرية على مستوى النسخ في سياق مجموعة متنوعة من البيئات المختلفة.

Introduction

تحتوي ظهارة الأمعاء الدقيقة على منطقتين متميزتين: القبو الذي يضم الخلايا الجذعية المعوية (ISC) والزغابات ، التي تتكون من خلايا متمايزة من السلالات الإفرازية والامتصاصية. إضافة إلى هذا التعقيد هو الخصوصية الإقليمية للظهارة التي توفر خصائص وظيفية فريدة بين مناطق الأمعاء الدقيقة. أنشأ العمل الرائد ظروفا استزراعية يمكن فيها إنشاء كل من سرداب الأمعاء الدقيقة البشرية ومناطق الزغابات خارج الجسم الحي من الأنسجة الجراحية أو خزعات الأنسجة¹. تعمل هذه الثقافات على سد الفجوة بين الدراسات على والتجارب السريرية وتكشف عن بيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية وعلم وظائف الأعضاء في الجهاز الهضمي غير المعترف بها سابقا. يتم نشر HIOs كهياكل كروية 3D باستخدام و....

Protocol

تم الحصول على الخطوط العضوية المستخدمة هنا من مركز أمراض الجهاز الهضمي في مركز تكساس الطبي GEMS Core. باختصار ، لإنشاء خطوط عضوية في البداية ، تم غسل عينات الأنسجة المانحة وهضمها إنزيميا لتحرير الخبايا المعوية. تم تضمين الخبايا في غشاء قاعدي واستزراعها في وسط. وافق مجلس المراجعة المؤسسية في كلية بايلور للطب على بروتوكول الدراسة للحصول على عينات الأنسجة التي تم إنشاء خطوط عضوية منها ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المتبرعين لإنشاء خطوط عضوية من الأنسجة المتبرع بها.

1. تمرير HIOs 3D لتوسيع التمايز

1. قم بإزالة وتجاهل الوسط من آبار المواد العضوية المزروعة في 24 لوحة بئر (حول الغشاء القاعدي الصلب) باستخدام ماصة P....

النتائج

تم تجميع المعلقات أحادية الخلية من 2-3 آبار من إدخال زراعة الخلايا الغشائية ، والطبقة الأحادية ، و HIOs ثلاثية الأبعاد لضمان إنتاجية كافية للخلايا وتقليل التباين من بئر إلى بئر. تم إعداد مكتبات الخلية المفردة باستخدام كواشف خاصة بمنصة التنميط النسخي أحادي الخلية. وتسلسلها مع قراءات نهاية مق?.......

Discussion

باستخدام منصات الجينوم أحادية الخلية ، يمكن تقسيم الأنظمة البيولوجية المعقدة ، مثل ثقافات HIO المشتقة من الأنسجة التي تشكل ظهارة الأمعاء ، للحصول على مساهمات خلوية فردية في الاستجابة البيولوجية الشاملة^4،5،6. يمكن أيضا تحديد عدم التجانس ال.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145	10 nM
0.05% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.4% Trypan blue	Millipore-Sigma	T8154
0.5 M EDTA	Corning	46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-	Corning	21-040-CM
24 mm Transwell	Costar	3412
24 well Nunclon delta surface tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
40 µm cell strainer	Falcon	352340
40 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0040
70 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0070
96 well plate	Corning	3595
A-83-01	Tocris	2939	500 nM
Accutase	StemCell Technologies	7920
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	1X
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000128
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG	33 µg/mL
Corning Cell Recovery Solution	VWR	354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)	Invitrogen	14190-136	1X
GlutaMAX-I	Invitrogen	35050-061	2 mM
HEPES 1M	Invitrogen	15630-080	10 mM
L-WRN conditioned media	ATCC	CRL-3276
Matrigel, GFR, phenol free	Corning	356231
mouse recombinant EGF	Invitrogen	PMG8043	50 ng/mL
N2 supplement	Invitrogen	17502-048	1X
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G	500 µM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	10 mM
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067	10 µM
Transwell	Corning	3413
Y27632	Stem Cell Technologies	72308	10 µM