שימוש באורגנואידים של המעי האנושי כדי להבין את אפיתל המעי הדק ברמת השעתוק של תא בודד

Summary

הפרוטוקול משלב טכנולוגיית אורגנואיד מעיים אנושיים עם ניתוח תעתיק של תא בודד כדי לספק תובנה משמעותית לגבי ביולוגיית המעי שלא נחקרה בעבר.

Abstract

תעתיק תא בודד חולל מהפכה בהבנתנו את הביולוגיה התאית של גוף האדם. תרביות אורגנואידים אנושיות חדישות במעי דק מספקות מערכות מודל ex vivo המגשרות על הפער בין מודלים של בעלי חיים לבין מחקרים קליניים. היישום של תעתיק תא בודד למודלים של אורגנואידים במעי אנושי (HIO) חושף ביולוגיה של התא, ביוכימיה ופיזיולוגיה של מערכת העיכול שלא היו מוכרים עד כה. פלטפורמות השעתוק המתקדמות של תא בודד משתמשות בחלוקה מיקרופלואידית וברקוד כדי ליצור ספריות cDNA. cDNA ברקודים אלה ניתנים לריצוף בקלות על ידי פלטפורמות ריצוף של הדור הבא ומשמשים כלי הדמיה שונים ליצירת מפות. במאמר זה אנו מתארים שיטות לתרבית ולהבחנה בין HIOs אנושיים במעי דק בפורמטים ונהלים שונים לבידוד תאים בני קיימא מתבניות אלה המתאימות לשימוש בפלטפורמות פרופיל שעתוק של תא יחיד. פרוטוקולים ונהלים אלה מאפשרים שימוש ב- HIOs של המעי הדק כדי להשיג הבנה מוגברת של התגובה התאית של אפיתל המעי האנושי ברמת השעתוק בהקשר של מגוון סביבות שונות.

Introduction

לאפיתל המעי הדק שני אזורים נפרדים: הקריפטה המאחסנת את תאי גזע המעי (ISC) והווילוס המורכב מתאים ממוינים של השושלות המפרישות והספיגה. למורכבות זו מתווספת הספציפיות האזורית של האפיתל המספקת תכונות פונקציונליות ייחודיות בין אזורי המעי הדק. עבודה חלוצית קבעה תנאי תרבית שבהם ניתן ליצור הן את קריפטת המעי הדק האנושית והן את אזורי הווילוס ex vivo מרקמות כירורגיות או ביופסיות רקמות¹. תרביות אלה מגשרות על הפער בין מחקרים בבעלי חיים לבין ניסויים קליניים וחושפות ביולוגיה של התא, ביוכימיה ופיזיולוגיה של מערכת העיכול שלא הוכרו עד כה. ה-HIOs מופצים כמבנים כדוריים תלת-ממדיים באמצעות מדיה עם גורמי גדילה המקדמים את יכולת הקיום של תאי גזע ומטריצות תמיכה חוץ-תאיות. תנאים אלה יוצרים מודל HIO דמוי קריפטה המורכב בעיקר מאבות ותאי גזע. הסרת גורמי הגדילה מקדמת התמיינות ISC (מודל דמוי וילוס) וייצור תאי אפיתל מעיים בוגרים (גביע, אנטרואנדוקריני, ציצית, אנטרוציט) ביחסים מתאימים יחד עם התרבות והתמיינות תאים, קיטוב, שלמות המחסום, מאפיינים ספציפיים אזוריים ותגובות פיזיולוגיות מתאימות². תרביות HIO יציבות גנטית וניתן להפיץ אותן ללא הגבלת זמן במצבן דמוי הקריפטה. גישה נוחה למשטח האפי של תרבויות אלה מסופקת על ידי תנאי תרבות המאפשרים צמיחה בפורמט חד-שכבתי³. HIOs מאפשרים גם לכלול בניתוחים ביולוגיים שיקולים של שונות הפרט המארח כגון גנטיקה, גיל, מין, מוצא אתני וסטטוס המחלה. כלי הערכה אנליטיים ופונקציונליים זהים לאלה המשמשים בגישות המתמקדות בקווי תאים מותמרים וכוללים מגוון טכניקות מולקולריות כגון ציטומטריית זרימה, מיקרוסקופיה, תעתוק, פרוטאומיקה ומטבולומיקה.

תעתיק תא בודד מחולל מהפכה בהבנתנו את הביולוגיה והפיזיולוגיה של המעי הדק על ידי מתן תובנה לגבי התרומות האינדיבידואליות של כל סוג תא לתהליך ביולוגי. עבודה חלוצית באמצעות טכנולוגיה זו סיפקה נוף של סוגי התאים הקיימים במעי האנושי המקומי ^4,5,6. פלטפורמות פרופיל שעתוק של תא בודד מאפשרות לחקור את נוף השעתוק של תאים בודדים, ומאפשרות להטרוגניות התא להגיע לחזית המחקר המדעי. בכמה פלטפורמות פרופיל שעתוק של תא בודד, מחיצות מיקרופלואידיות וברקוד משמשים ליצירת ספריות cDNA מ-mRNA פוליאדנילציה תאית, המתקבלות מעד 10,000 תאים לדגימה. על פלטפורמה זו, טיפות המכילות תאים בודדים, אוליגונוקלאוטידים ברקודים, ריאגנטים של שעתוק לאחור ושמן יוצרים שלפוחית תגובה שגורמת לכל cDNA מתא בודד להיות באותו ברקוד. לאחר מכן ניתן לרצף ביעילות את cDNA המקודד באמצעות ריצוף הדור הבא. ניתן לטפל בנתונים שנוצרו באמצעות תוכנה וכלי ויזואליזציה, הממירים את הרצפים המקודדים למפות ויזואליזציה ולפרופילי שעתוק של תא בודד. ניתן לזהות אוכלוסיות תאים באמצעות מאגרי מידע זמינים לציבור של אפיתל המעי הדק האנושי ^4,5,6. למרות שמחקרים רבים השתמשו בפלטפורמה זו כדי לחקור אורגנואידים במעי מורין ברמת התא הבודד, הניתוח של תגובות שעתוק של תא בודד של HIOs פיגר מאחורי 7,8,9,10,11,12.

כאן, אנו מספקים מדריך שלב אחר שלב לבידוד תאים בני קיימא מתאי HIO של מעי דק לצורך עיבוד בפלטפורמות פרופיל של תא בודד (איור 1). אנו מספקים הנחיות לגידול ובידול יחד עם רכיבי מדיה שהותאמו לבידול אפיתל. אנו מתארים שיטות שחזור תאים עבור שלושה פורמטים שונים של תרביות: תרביות תלת ממדיות (3D) וחד-שכבתיות על פלסטיק או על תוספות תרבית תאים ממברנה. אנו מספקים נתוני אשכולות לדוגמה המתקבלים באמצעות תוכנת קוד פתוח כדי לגזור גנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי בכל אשכול.

Protocol

קווי האורגנואידים המשמשים כאן התקבלו מהמרכז הרפואי למחלות עיכול של טקסס GEMS Core. בקצרה, כדי להקים בתחילה קווי אורגנואידים, דגימות רקמת התורם נשטפו ועוכלו אנזימטית כדי לשחרר את קריפטים המעי. הקריפטות הוטמעו בקרום מרתף ותורבתו בתווך. ועדת הביקורת המוסדית במכללת ביילור לרפואה אישרה את פרוטוקול המחקר לקבלת דגימות רקמה שמהן נקבעו קווי אורגנואידים, והתקבלה הסכמה מדעת מכל התורמים לקבוע קווי אורגנואידים מהרקמה שנתרמה.

1. העברת HIOs תלת ממדיים להתרחבות לצורך בידול

1. הסר והשלך מדיום מבארות אורגנואידים הגדלים בצלחות של 24 בארות (סביב קרום המרתף המוצק) עם פיפט P1000. הוסף 300 μL של 0.05% Trypsin-EDTA לבאר ולפרק באופן מכני אורגנואידים על ידי pipetting עם צינור P1000 למעלה ולמטה 5x.
2. דגירה על צלחת ב 37 ° C במשך 4 דקות. הוסף 500 μL של מדיה שלמה ללא גורמי גדילה (CMGF - בינוני) עם 10% FBS לכל באר (טבלה 1). השתמשו בפיפט P1000 ופיפט CMGF בינוני ובתערובת HIO, פי 10 הלוך ושוב בבאר. מעבירים את כל עוצמת הקול לצינור של 15 מ"ל. שלב מעבר מבארות מרובות לתוך אותו צינור 15 מ"ל. אין לשלב יותר מ -10 בארות לכל צינור.
3. סובב תאים כלפי מטה ב- 4 ° C באמצעות צנטריפוגת רוטור נדנדה ב- 100 x גרם למשך 5 דקות. הסר את כל המדיום, שמירה על הגלולה בתחתית הצינור. שמור את הצינור על קרח.
4. חשב את כמות קרום המרתף הדרוש למספר ציפוי HIO, והשהה מחדש את גלולת HIO ב 30 μL / באר של קרום המרתף באמצעות קצות פיפט P200 קרים. פיפטה תערובת קרום מרתף HIO כטיפה למרכז צלחת 24 בארות באמצעות קצוות פיפט P200 קרים.
5. מעבירים את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. תן לקרום המרתף להתמצק למשך 5-10 דקות, ולאחר מכן הוסף 500 μL של מדיום שלם בטמפרטורת החדר המכיל WNT, R-spondin, noggin, EGF ומעכב ROCK (WRNE+Y; טבלה 1) לכל באר ותרבות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. רענן את התרבות עם WRNE+Y פעם ביומיים במשך 7 ימים.
   הערה: HIO בריא יהיה ציסטי בצורתו עם אפיתל ניצני מבריק (איור 2). תאים באמצע הציסטה לא ניתן לדמיין. HIO לא בריא ייראה משעמם ובעל אפיתל עבה עם אמצע מוצק. המאפיין החשוב ביותר הוא המראה המבריק.

2. בידול HIO: פורמט תלת מימד

1. השתמש באר אחת של HIOs 3D עבור 3 בארות של HIOs מובחנים 3D 1 שבוע לאחר תרבית.
2. הסר מדיה מבארות. פזרו את קרום המרתף ואת ה-HIOs באמצעות צינור P1000 והוסיפו 500 מיקרוליטר קר של CMGF לכל באר וצינור למעלה ולמטה לפחות פי 5. סובב HIOs ב 4 ° C באמצעות צנטריפוגת רוטור נדנדה ב 100 x גרם במשך 5 דקות. מוציאים את כל המדיום ושומרים את הגלולה בתחתית הצינור.
3. הוסף 30 μL של קרום מרתף לכל באר של HIOs להיות מצופה. פיפטה טיפת 30 μL של קרום מרתף עם HIOs לתוך באר של צלחת 24 באר. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות. הוסף 500 μL של מדיה מסוג WRNE+Y/Diff (50/50).
4. החליפו את המדיום למדיום בידול לאחר 24 שעות למשך 3 ימים נוספים, רעננו את המדיום אחת ליומיים. הכינו 3 בארות לכל דגימה לאיגום כדי להפחית את השונות הטכנית.

3. בידול HIO: פורמט מונושכבתי

1. מצפים את תרבית תאי הממברנה או בארות של צלחת 96 בארות עם 100 μL / באר של קולגן שליה אנושי IV (1mg / ml ב 100mM חומצה אצטית) מדולל קר H₂O (1: 30). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 1.5 שעות לפחות או מקסימום למשך הלילה. להכנסת תרבית תאי ממברנה, הוסיפו H₂O סטרילי בחלל הצלחת כדי ללחלח את הצלחת; עבור צלחת 96 בארות, להוסיף סטרילי H₂O בארות שאינן בשימוש.
2. אספו HIOs תלת-ממדיים שגודלו בתרבית ב-WRNE במשך 7 ימים על ידי הסרת המדיה ושחזור קרום המרתף והתאים על ידי הוספת 500 μL/well של 0.5 mM EDTA קר (0.5 M EDTA מדולל 1:1000 ב-PBS סטרילי). השתמש בפיפט P1000 כדי לצנרת אורגנואידים ותמיסה למעלה ולמטה פי 5 ולהעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה של 15 מ"ל. אין לארוז יותר מ-10 בארות אורגנואידים לכל צינור. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 x גרם ברוטור דלי מתנדנד ב 4 ° C.
   הערה: כדי להכין 3 בארות על צלחת של 96 בארות, השתמש בבאר אחת של HIO תלת מימדי. כדי להכין תוספת תרבית תאי ממברנה אחת, השתמש בבאר אחת של HIOs תלת ממדיים (צפיפות הזריעה של תאים בודדים היא בערך 1-2 x 10⁵ תאים / באר עבור צלחת 96 באר, 2.5-3 x 10⁵ תאים / באר עבור תוספת תרבית תאי ממברנה).
3. הסר 500 μL של מדיה, משאיר את הגלולה בתחתית הצינור. נתק את HIOs על ידי הוספת 500 μL של 0.05% טריפסין/0.5 mM EDTA ודגרה במשך 4-5 דקות ב 37 ° C. פיפטה נמרצת למעלה ולמטה עבור ~ 50x באמצעות P1000. הימנע יצירת בועות על ידי pipeting על הצד של הצינור.
4. נטרל את הטריפסין על ידי הוספת 1 מ"ל של CMGF המכיל 10% FBS. סנן גושים גדולים של תאים לא מעוכלים על ידי הרטבת מסננת תאים של 40 מיקרומטר עם 1 מ"ל של CMGF - המכיל 10% FBS והוספת התאים לחלק העליון של מסננת התא. השתמשו בכוח הכבידה כדי לאפשר לתאים לעבור דרך המסננת והשליכו את מסננת התאים המכילה גושי תאים.
5. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 400 x גרם ברוטור דלי מתנדנד בטמפרטורת החדר.
6. הוציאו את הנוזל מתרבית תאי הממברנה המצופה בקולגן או מהצלחת בעלת 96 הקידוחים. יש להשהות מחדש את גלולת HIO ב-100 μL/well של WRNE המכילה 10 μM Y-27632, ולאחר מכן פיפטה לתוך התא העליון של תרבית תאי הממברנה או לתוך צלחת 96 בארות. להחדרת תרבית תאי ממברנה, יש להוסיף 600 μL של WRNE המכיל 10 μM Y-27632 לתא התחתון של הבאר.
7. הסר את המדיום לאחר 24 שעות הן מהחלק העליון והן מהחלק התחתון של תרבית תאי הממברנה או מהצלחת 96 בארות והחלף במדיום התמיינות למשך 5 ימים. הכינו 3 בארות לכל דגימה לאיגום כדי להפחית את השונות הטכנית.

4. הכנת מתלים של תא בודד מ- HIOs תלת ממדיים ממוינים עבור תעתיק תא בודד

1. יש להניח מגיב עיכול תאים אנזימטי בטמפרטורה של 37°C באינקובטור CO₂ כדי להפשיר ולחמם 30 דקות לפני תחילת העיכול של HIO תלת-ממדי. בדוק את HIOs באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר ב 10x כדי להבטיח את בריאות התא.
2. הסר את המדיה מהבארות והוסף 500 μL של תמיסת שחזור תאים קרים לבארות. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשחרר את התאים מקרום המרתף באמצעות פיפטה P1000 וקצוות פיפטה סטנדרטיים. העבר את תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
   הערה: השימוש בבארות משוכפלות מבטיח מספרי תאים נאותים ומפחית את השונות בין באר לבאר. אין לשלב בארות לפני שלב 4.7 להלן.
3. לדגור על צינורות התאים על קרח במשך 10 דקות, pipeting למעלה ולמטה כל 5 דקות. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 400 x גרם ב 4 ° C.
4. הסר את הנוזל מן הצינור, בזהירות לא להפריע את כדור התא. להשהות מחדש את התאים ב 500 μL של מגיב עיכול תאים אנזימטי שחומם מראש. פיפטה למעלה ולמטה עם P1000 לפחות פי 10.
5. לדגור את HIOs במשך 30 דקות ב 37 ° C באינקובטור CO₂ . כל 10 דקות, פיפטה את כל נפח 10x באמצעות פיפטה P1000 כדי לעזור לנתק את התאים. הימנעו מהחדרת בועות אוויר לתרחיף התא.
6. גלולה את התאים במשך 3 דקות ב 400 x גרם ב 4 ° C. הסר את supernatant, להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של מדיה התמיינות ולאחסן על קרח.
   הערה: מנקודה זו ואילך, HIOs חייבים תמיד להישמר על קרח.
7. פיפטה את התאים למעלה ולמטה פי 50 במהירות באמצעות P1000 כדי להבטיח HIOs מנותקים לתאים בודדים. היזהר לא להציג בועות אוויר בשלב זה, כפי שהוא יגרום אובדן תאים.
8. סנן את כל עוצמת הקול דרך מסננת קצה של 70 מיקרומטר באמצעות קצה פיפטה P1000. השתמש בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל כדי לאסוף את הפולט.
   הערה: קצה המסנן לא ייסתם אם זמן העיכול מספיק. השתמש בעצות מסנן מרובות אם המסנן נסתם; אל תכפה את עוצמת הקול דרך המסנן.
9. חזור על שלב 4.8 עם מסננת קצה 40 מיקרומטר. אחסנו דוגמאות על קרח.
10. ספירת תאים בודדים קיימא על תא ספירת תאים באמצעות הרחקת כחול טריפאן על ידי הוספת 5 μL של 0.4% כחול טריפאן ל 5 μL של השעיית תאים. יש לדלל את הדגימה לפי הצורך ל-1000 תאים/μL. אם צפיפות התא נמוכה מ-1000 תאים/μL, תאי גלולה למשך 2 דקות ב-400 x גרם ב-4°C, הסירו את המדיה המקורית והשהו מחדש במדיית תרבית תאים. פרוטוקול זה מניב בדרך כלל 5 x 10^5-1 x 10⁶ תאים.
    הערה: הכנת תרחיף באיכות גבוהה (90% תאים בני קיימא ו-90% תאים בודדים) חיונית לנתונים באיכות גבוהה של תא בודד. עם זאת, הניסיון מצביע על כדאיות נמוכה של עד 75% שניתן לקבל במקרים בהם טיפול, כגון זיהום או יישום מולקולות קטנות, משפיע על הכדאיות.
11. הכן ספריות DNA עבור פלטפורמות פרופיל שעתוק של תא בודד בהתאם לפרוטוקולים של היצרן. עבד את הנתונים בהתאם לפרוטוקולי שיטות עבודה מומלצות לניתוח נתוני scRNAseq^13,14.

5. הכנת תרחיפים חד-תאיים מ-HIOs ממוינים על גבי תרבית תאי ממברנה

1. יש להניח מגיב עיכול תאים אנזימטי בטמפרטורה של 37°C באינקובטור_CO2 כדי להפשיר ולחמם 30 דקות לפני תחילת העיכול של תרבית תאי HIO membrane. חלק את מגיב העיכול האנזימטי האנזימטי שחומם מראש ל -200 μL aliquots בצינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל, צינור אחד לכל תוספת תרבית תאים ממברנה. שמור את הצינורות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים לשימוש.
2. הכן PBS-EDTA על ידי הוספת 5 μL של 0.5 M EDTA ל- 5 מ"ל PBS. Aliquot 500 μL של PBS-EDTA לתוך צלחת 24 באר, 1 באר לכל תרבית תא ממברנה להוסיף.
3. שטפו את התאים עם PBS-EDTA: העבירו את תרבית תאי הממברנה מבארות המכילות מצע גידול לבארות המכילות PBS-EDTA. הסר את מדיית תרבית התאים מהצד האפי והחלף אותה ב- 100 μL של PBS-EDTA. היזהר לא להפריע לשכבת התא.
4. יש להשליך מיד את ה-PBS-EDTA שנוסף לצד האפי של תרבית תאי הממברנה. הסר את תרבית תאי הממברנה מהכנס מן הבאר, כתם אותו על ידי נגיעה עדינה בקצה מגבת נייר, ולאחר מכן להפוך אותו על הספסל. השתמש בלהב אזמל חד כדי להסיר את הקרום מהחדרה על ידי חיתוך סביב ההיקף הפנימי של הממברנה. יש לפעול במהירות למניעת התייבשות.
5. השתמש במלקחיים כדי להעביר את הממברנה לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל שחומם מראש מלא בריאגנט עיכול תאים אנזימטי וודא שהממברנה שקועה לחלוטין. חזור על הפעולה עבור כל התוספות הנוספות של תרבית תאי ממברנה.
   הערה: הגדלת נפח מגיב העיכול האנזימטי של התאים ל-500 מיקרוליטר עשויה לסייע בניתוק חד-שכבות צפופות.
6. נתק את התאים על ידי דגירה צינורות עם ממברנות ב 37 ° C באינקובטור CO₂ . מערבבים בעדינות את כל הנפח 5x עם פיפטה של 200 μL כל 10 דקות למשך 30 דקות בסך הכל. הימנעו מבועות ויניקה של הממברנה כדי לשמר את הכדאיות.
7. העבר aliquot קטן של תאים (1-2 μL) לשקופית זכוכית כל 10 דקות כדי להעריך דיסוציאציה על ידי הערכה איכותית של אחוז תאים בודדים. זה עשוי לקחת עד 50 דקות עם פיפטינג נוסף כדי להשיג 80%-90% תאים בודדים, בהתאם לסוג HIO. גרדו בעדינות את הממברנה עם קצה פיפטה במהלך שלבי הערבוב כדי לעודד דיסוציאציה, במיוחד עבור תאים קשים לניתוק, אולם גירוד עלול להשפיע על הכדאיות.
8. שלב 3 בארות משוכפלות לכל מצב בצינור מיקרוצנטריפוגה יחיד של 1.5 מ"ל (600 מיקרוליטר בסך הכל). הוסף 400 μL של מדיה תרבית תאים (diff) + 10 μM ROCKi (1 מ"ל נפח כולל). מערבבים בעדינות על ידי פיפט.
   הערה: השימוש בבארות משוכפלות מבטיח מספרי תאים נאותים ומפחית את השונות בין באר לבאר. יש לאגד בארות בשלב זה.
9. סננו את כל עוצמת הקול דרך מסננת קצה של 70 מיקרומטר באמצעות קצה פיפטה בנפח 1 מ"ל. אספו את הזרימה בצינור מיקרוצנטריפוגה טרי בנפח 1.5 מ"ל.
   הערה: קצה המסנן לא ייסתם אם זמן העיכול מספיק. השתמש בעצות מסנן מרובות אם המסנן נסתם; אין להעביר את עוצמת הקול בכוח.
10. חזור על שלב 5.9 עם מסננת קצה 40 מיקרומטר. אחסנו דוגמאות על קרח.
11. ספירת תאים בודדים קיימא על תא ספירת תאים באמצעות הרחקת כחול טריפאן על ידי הוספת 5 μL של 0.4% כחול טריפאן ל 5 μL של השעיית תאים. יש לדלל דגימה לפי הצורך ל-1000 תאים/μL. אם צפיפות התא נמוכה מ- 1000 תאים/ μL, סובב 2 דקות ב- 400 x g ב- 4 °C כדי לגלגל את התאים, להסיר את המדיה המקורית ולהשהות מחדש ב- WRNE+Y בצפיפות התא הרצויה. פרוטוקול זה מניב בדרך כלל 4 x 10⁵ - 6 x 10⁵ תאים.
    הערה: הכנת תרחיף באיכות גבוהה (90% תאים בני קיימא ו-90% תאים בודדים) חיונית לנתונים באיכות גבוהה של תא בודד. עם זאת, הניסיון מצביע על כדאיות נמוכה של עד 75% שניתן לקבל במקרים בהם טיפול, כגון זיהום או יישום מולקולות קטנות, משפיע על הכדאיות.
12. הכן ספריות DNA עבור פלטפורמות פרופיל השעתוק של תא בודד בהתאם לפרוטוקולים של היצרן. עבד את הנתונים בהתאם לפרוטוקולי שיטות עבודה מומלצות לניתוח נתוני scRNAseq^13,14.

6. הכנת מתלים חד-תאיים מ-HIOs המתמיינים כחד-שכבות של 96 בארות

1. יש להניח מגיב עיכול תאים אנזימטי בטמפרטורה של 37°C באינקובטור_CO2 כדי להפשיר ולחמם 30 דקות לפני תחילת העיכול החד-שכבתי של HIO.
2. הכן PBS-EDTA על ידי הוספת 5 μL של 0.5 M EDTA ל- 5 מ"ל PBS. השליכו את מדיית תרבית התאים מהצלחת בעלת 96 הקידוחים והחליפו אותה ב-100 μL של PBS-EDTA. היזהר לא להפריע לשכבת התא.
3. נתק את התאים: השליך את PBS-EDTA והוסף 100 μL של מגיב עיכול תאים אנזימטי חם לכל באר. מניחים את הצלחת בטמפרטורה של 37°C באינקובטור של 5% CO₂ ומערבבים בעדינות את כל הנפח פי 5 עם קצה פיפטה של 200 μL כל 10 דקות למשך 20-30 דקות. הימנעו מבועות כדי לשמור על כדאיות.
   הערה: הגדלת נפח מגיב העיכול האנזימטי של תאים ל-500 מיקרוליטר עשויה לסייע בניתוק חד-שכבות צפופות.
4. העבר aliquot קטן של תאים (1-2 μL) לשקופית זכוכית כל 10 דקות כדי להעריך דיסוציאציה. ייתכן שיחלפו עד 50 דקות כדי להשיג 80%-90% תאים בודדים, בהתאם לסוג HIO. גרדו בעדינות את הצלחת עם קצה פיפטה במהלך שלבי הערבוב כדי לעודד דיסוציאציה, במיוחד עבור תאים קשים לנתק; עם זאת, גירוד עשוי להשפיע על הכדאיות.
5. שלב 3 בארות משוכפלות לכל מצב בצינור מיקרוצנטריפוגה יחיד של 1.5 מ"ל (300 מיקרוליטר בסך הכל). הוסף 700 μL של מדיה תרבית תאים (diff) + 10 uM ROCKi (1 מ"ל נפח כולל). מערבבים בעדינות על ידי פיפט.
   הערה: השימוש בבארות שגדלו בהעתקה מבטיח מספרי תאים נאותים ומפחית את השונות בין באר לבאר.
6. סננו את כל עוצמת הקול דרך מסננת קצה של 70 מיקרומטר באמצעות קצה פיפטה בנפח 1 מ"ל. אספו את הזרימה בצינור מיקרוצנטריפוגה טרי בנפח 1.5 מ"ל.
   הערה: קצה המסנן לא ייסתם אם זמן העיכול של מגיב עיכול תאים אנזימטי מספיק. השתמש בעצות מסנן מרובות אם המסנן נסתם; אין להעביר את עוצמת הקול בכוח.
7. חזור על שלב 6.6 עם מסננת קצה של 40 מיקרומטר. אחסנו דוגמאות על קרח.
8. ספירת תאים בודדים קיימא על תא ספירת תאים באמצעות הרחקת כחול טריפאן על ידי הוספת 5 μL של 0.4% כחול טריפאן ל 5 μL של השעיית תאים. לדלל לפי הצורך עד 1000 תאים/μL. אם צפיפות התא נמוכה מ- 1000 תאים/μL, יש לסובב 2 דקות ב- 400 x g 4 °C כדי להניף את התאים, להסיר את המדיה המקורית ולהשהות מחדש במדיה של תרבית תאים + ROCKi בצפיפות התא הרצויה. פרוטוקול זה מניב בדרך כלל 2 x 10⁵ - 6 x 10⁵ תאים.
   הערה: הכנת תרחיף באיכות גבוהה (90% תאים בני קיימא ו-90% תאים בודדים) חיונית לנתונים באיכות גבוהה של תא בודד. עם זאת, הניסיון מצביע על כדאיות נמוכה של עד 75% שניתן לקבל במקרים בהם טיפול, כגון זיהום או יישום מולקולות קטנות, משפיע על הכדאיות.
9. הכן ספריות DNA בהתאם לפרוטוקולים של יצרן פלטפורמת השעתוק התא הבודד. עבד את הנתונים בהתאם לפרוטוקולי שיטות עבודה מומלצות לניתוח נתוני scRNAseq^13,14.

תוצאות

מתלים חד-תאיים אוחדו מ-2-3 בארות של תרבית תאים ממברנה, חד-שכבתית ותלת-ממדית HIOs כדי להבטיח תפוקת תאים מספקת ולהפחית את השונות בין תאים לבאר. ספריות תאים בודדים הוכנו באמצעות ריאגנטים ספציפיים לפלטפורמת פרופיל התא הבודד. ורצף עם קריאות קצה מזווג בפלטפורמת ריצוף של הדור הבא, 30,000 קריאות לתא. הקר?...

Discussion

באמצעות פלטפורמות גנומיקה של תא בודד, ניתן לפרק מערכות ביולוגיות מורכבות, כגון תרביות HIO שמקורן ברקמה המדמה את אפיתל המעי, כדי להניב תרומות תאיות בודדות לתגובה ביולוגית כוללת ^4,5,6. ניתן לזהות ולחקור גם הטרוגניות תאית ואוכלוסיות תאים נדירו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145	10 nM
0.05% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.4% Trypan blue	Millipore-Sigma	T8154
0.5 M EDTA	Corning	46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-	Corning	21-040-CM
24 mm Transwell	Costar	3412
24 well Nunclon delta surface tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
40 µm cell strainer	Falcon	352340
40 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0040
70 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0070
96 well plate	Corning	3595
A-83-01	Tocris	2939	500 nM
Accutase	StemCell Technologies	7920
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	1X
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000128
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG	33 µg/mL
Corning Cell Recovery Solution	VWR	354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)	Invitrogen	14190-136	1X
GlutaMAX-I	Invitrogen	35050-061	2 mM
HEPES 1M	Invitrogen	15630-080	10 mM
L-WRN conditioned media	ATCC	CRL-3276
Matrigel, GFR, phenol free	Corning	356231
mouse recombinant EGF	Invitrogen	PMG8043	50 ng/mL
N2 supplement	Invitrogen	17502-048	1X
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G	500 µM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	10 mM
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067	10 µM
Transwell	Corning	3413
Y27632	Stem Cell Technologies	72308	10 µM