Uso de organoides intestinales humanos para comprender el epitelio del intestino delgado a nivel transcripcional de una sola célula

Resumen

El protocolo combina la tecnología de organoides intestinales humanos con el análisis transcriptómico de células individuales para proporcionar información significativa sobre la biología intestinal previamente inexplorada.

Resumen

La transcriptómica de células individuales ha revolucionado nuestra comprensión de la biología celular del cuerpo humano. Los cultivos de organoides del intestino delgado humano de última generación proporcionan sistemas modelo ex vivo que cierran la brecha entre los modelos animales y los estudios clínicos. La aplicación de la transcriptómica de células individuales a modelos de organoides intestinales humanos (HIO) está revelando la biología celular, la bioquímica y la fisiología del tracto gastrointestinal no reconocidas anteriormente. Las plataformas avanzadas de transcriptómica de células individuales utilizan particiones microfluídicas y códigos de barras para generar bibliotecas de ADNc. Estos ADNc con códigos de barras pueden ser fácilmente secuenciados por plataformas de secuenciación de próxima generación y utilizados por varias herramientas de visualización para generar mapas. Aquí, describimos métodos para cultivar y diferenciar HIOs de intestino delgado humano en diferentes formatos y procedimientos para aislar células viables de estos formatos que son adecuados para su uso en plataformas de perfiles transcripcionales de una sola célula. Estos protocolos y procedimientos facilitan el uso de HIOs del intestino delgado para obtener una mayor comprensión de la respuesta celular del epitelio intestinal humano a nivel transcripcional en el contexto de una variedad de entornos diferentes.

Introducción

El epitelio del intestino delgado tiene dos zonas distintas: la cripta que alberga la célula madre intestinal (ISC) y las vellosidades, que está compuesta por células diferenciadas de los linajes secretor y absorbente. A esta complejidad se suma la especificidad regional del epitelio que proporciona propiedades funcionales únicas entre las regiones del intestino delgado. Un trabajo pionero estableció las condiciones de cultivo en las que tanto la cripta del intestino delgado humano como las zonas de vellosidades pueden generarse ex vivo a partir de tejidos quirúrgicos o biopsias de tejido¹. Estos cultivos están cerrando la brecha entre....

Protocolo

Las líneas de organoides utilizadas aquí se obtuvieron del Centro de Enfermedades Digestivas GEMS Core del Centro Médico de Texas. Brevemente, para establecer inicialmente líneas de organoides, las muestras de tejido del donante se lavaron y se digierieron enzimáticamente para liberar las criptas intestinales. Las criptas se incrustaron en una membrana basal y se cultivaron en un medio. La Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de Baylor aprobó el protocolo del estudio para obtener muestras de tejido a partir de las cuales se establecieron líneas de organoides, y se obtuvo el consentimiento informado de todos los donantes para establecer líneas de ....

Discusión

Mediante el uso de plataformas genómicas unicelulares, los sistemas biológicos complejos, como los cultivos de HIO derivados de tejidos que modelan el epitelio intestinal, se pueden descomponer para producir contribuciones celulares individuales a la respuesta biológica general ^4,5,6. La heterogeneidad celular y las poblaciones de células raras también pueden ser identificadas e interrogadas. La entrada celular debe optimiz.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145	10 nM
0.05% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.4% Trypan blue	Millipore-Sigma	T8154
0.5 M EDTA	Corning	46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-	Corning	21-040-CM
24 mm Transwell	Costar	3412
24 well Nunclon delta surface tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
40 µm cell strainer	Falcon	352340
40 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0040
70 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0070
96 well plate	Corning	3595
A-83-01	Tocris	2939	500 nM
Accutase	StemCell Technologies	7920
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	1X
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000128
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG	33 µg/mL
Corning Cell Recovery Solution	VWR	354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)	Invitrogen	14190-136	1X
GlutaMAX-I	Invitrogen	35050-061	2 mM
HEPES 1M	Invitrogen	15630-080	10 mM
L-WRN conditioned media	ATCC	CRL-3276
Matrigel, GFR, phenol free	Corning	356231
mouse recombinant EGF	Invitrogen	PMG8043	50 ng/mL
N2 supplement	Invitrogen	17502-048	1X
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G	500 µM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	10 mM
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067	10 µM
Transwell	Corning	3413
Y27632	Stem Cell Technologies	72308	10 µM