ヒト腸オルガノイドを使用して、単一細胞転写レベルでの小腸上皮の理解

要約

このプロトコルは、ヒト腸オルガノイド技術とシングルセルトランスクリプトーム解析を組み合わせて、これまで未踏の腸内生物学に関する重要な洞察を提供します。

要約

シングルセルトランスクリプトミクスは、人体の細胞生物学の理解に革命をもたらしました。最先端のヒト小腸オルガノイド培養は、動物モデルと臨床研究の間のギャップを埋める ex vivo モデルシステムを提供します。シングルセルトランスクリプトミクスをヒト腸オルガノイド(HIO)モデルに応用することで、これまで認識されていなかった消化管の細胞生物学、生化学、生理学が明らかになりました。高度なシングルセルトランスクリプトミクスプラットフォームは、マイクロ流体分割とバーコードを使用してcDNAライブラリを生成します。これらのバーコード付きcDNAは、次世代のシーケンシングプラットフォームで簡単にシーケンシングでき、さまざまな視覚化ツールでマップを生成するために使用できます。ここでは、ヒト小腸HIOをさまざまな形式で培養および鑑別する方法と、シングルセル転写プロファイリングプラットフォームでの使用に適したこれらのフォーマットから生細胞を単離する手順について説明します。これらのプロトコルおよび手順は、小腸HIOの使用を促進し、さまざまな異なる環境の文脈における転写レベルでのヒト腸上皮の細胞応答の理解を深めることができます。

概要

小腸上皮には、腸幹細胞(ISC)を収容する陰窩と、分泌系統と吸収系統の分化細胞で構成される絨毛の2つの異なるゾーンがあります。この複雑さに加えて、上皮の局所特異性があり、小腸の領域間に独自の機能特性を提供します。先駆的な研究により、ヒトの小腸陰窩と絨毛ゾーンの両方を手術組織または組織生検から 生体外で 生成できる培養条件が確立されました¹。これらの培養物は、動物実験と臨床試験の間のギャップを埋め、これまで認識されていなかった消化管の細胞生物学、生化学、生理学を明らかにしています。HIOは、幹細胞の生存率を促進する成長因子と細胞外支持マトリックスを備えた培地を使用して、3D球状構造として増殖します。これらの条件により、主に前駆細胞と幹細胞で構成される陰窩のようなHIOモデルが得られます。成長因子の除去は、ISCの分化(絨毛様モデル)と成熟腸上皮細胞(杯、腸内分泌、房、腸細胞)の適切な比率での産生を促進し、細胞の増殖と分化、分極、バリア完全性、局所特異的特徴、および適切な生理学的応答とともに促進します².HIO培養物は遺伝的に安定しており、陰窩のような状態で無期限に増殖することができます。これらの培養物の頂端表面への容易なアクセスは、単層フォーマット³での増殖を可能にする培養条件によって提供されます。HIOはまた、遺伝学、年齢、性別、民族性、疾患状態などの宿主の個体差の考慮を....

プロトコル

ここで使用したオルガノイド系統は、Texas Medical Center、Digestive Disease Center、GEMS Coreから入手しました。簡単に言うと、オルガノイドラインを最初に確立するために、ドナー組織サンプルを洗浄し、酵素的に消化して腸内陰窩を放出しました。陰窩は基底膜に埋め込まれ、培地で培養されました。ベイラー医科大学の治験審査委員会は、オルガノイドラインが確立される組織サンプルを取得するための研究プロトコルを承認し、提供された組織からオルガノイドラインを確立するためにすべてのドナーからインフォームドコンセントが得られました。

1. 差別化のための拡大に向けた3D HIOの継代

1. 24ウェルプレート(固体基底膜周辺)で成長させたオルガノイドのウェルから培地をP1000ピペットで取り出して廃棄します。0.05% Trypsin-EDTAを300 μLをウェルに加え、P1000ピペットで5回上下にピペッティングしてオルガノイドを機械的に分解します。
2. プレートを37°Cで4分間インキュベートします。成長因子を含まない500 μLの完全培地(CMGF-培地)と10% FBSを各ウェルに加えます(表1)。P1000ピペットとCMGF培地とHIO混合物をウェル内で10回前後に使用します。全容量を15mLチューブに移します。複数のウェルからの通過を同じ15....

ディスカッション

シングルセルゲノミクスプラットフォームを使用すると、腸上皮をモデル化する組織由来のHIO培養物などの複雑な生物学的システムを分解して、全体的な生物学的応答に対する個々の細胞の寄与を得ることができます^4,5,6。細胞の不均一性や希少な細胞集団も同定し、調査することができます。シングルセルトランスクリ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145	10 nM
0.05% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.4% Trypan blue	Millipore-Sigma	T8154
0.5 M EDTA	Corning	46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-	Corning	21-040-CM
24 mm Transwell	Costar	3412
24 well Nunclon delta surface tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
40 µm cell strainer	Falcon	352340
40 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0040
70 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0070
96 well plate	Corning	3595
A-83-01	Tocris	2939	500 nM
Accutase	StemCell Technologies	7920
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	1X
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000128
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG	33 µg/mL
Corning Cell Recovery Solution	VWR	354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)	Invitrogen	14190-136	1X
GlutaMAX-I	Invitrogen	35050-061	2 mM
HEPES 1M	Invitrogen	15630-080	10 mM
L-WRN conditioned media	ATCC	CRL-3276
Matrigel, GFR, phenol free	Corning	356231
mouse recombinant EGF	Invitrogen	PMG8043	50 ng/mL
N2 supplement	Invitrogen	17502-048	1X
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G	500 µM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	10 mM
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067	10 µM
Transwell	Corning	3413
Y27632	Stem Cell Technologies	72308	10 µM