Utilisation d’organoïdes intestinaux humains pour comprendre l’épithélium de l’intestin grêle au niveau transcriptionnel d’une seule cellule

Résumé

Le protocole combine la technologie des organoïdes intestinaux humains avec l’analyse transcriptomique d’une seule cellule pour fournir des informations significatives sur la biologie intestinale jusqu’alors inexplorée.

Résumé

La transcriptomique sur cellule unique a révolutionné notre compréhension de la biologie cellulaire du corps humain. Des cultures d’organoïdes de l’intestin grêle humain à la pointe de la technologie fournissent des systèmes modèles ex vivo qui comblent le fossé entre les modèles animaux et les études cliniques. L’application de la transcriptomique sur cellule unique à des modèles d’organoïdes intestinaux humains (HIO) révèle la biologie cellulaire, la biochimie et la physiologie du tractus gastro-intestinal jusqu’alors inconnues. Les plateformes avancées de transcriptomique de cellules uniques utilisent le partitionnement microfluidique et le codage à barres pour générer des banques d’ADNc. Ces ADNc à code-barres peuvent être facilement séquencés par des plateformes de séquençage de nouvelle génération et utilisés par divers outils de visualisation pour générer des cartes. Ici, nous décrivons des méthodes de culture et de différenciation des HIO de l’intestin grêle humain dans différents formats et des procédures pour isoler des cellules viables à partir de ces formats qui conviennent à une utilisation dans des plateformes de profilage transcriptionnel unicellulaire. Ces protocoles et procédures facilitent l’utilisation des HIO de l’intestin grêle afin d’obtenir une meilleure compréhension de la réponse cellulaire de l’épithélium intestinal humain au niveau transcriptionnel dans le contexte d’une variété d’environnements différents.

Introduction

L’épithélium de l’intestin grêle comporte deux zones distinctes : la crypte qui abrite les cellules souches intestinales (CSI) et les villosités, qui sont composées de cellules différenciées des lignées sécrétoires et absorbantes. À cette complexité s’ajoute la spécificité régionale de l’épithélium qui offre des propriétés fonctionnelles uniques entre les régions de l’intestin grêle. Des travaux pionniers ont permis d’établir des conditions de culture dans lesquelles la crypte de l’intestin grêle humain et les zones villosités peuvent être générées ex vivo à partir de tissus chirurgicaux ou de biopsies tissulaires¹. Ces cultures comblent le fossé entre les études animales et les essais cliniques et révèlent la biologie cellulaire, la biochimie et la physiologie du tractus gastro-intestinal jusqu’alors inconnues. Les HIO se propagent sous forme de structures sphériques 3D à l’aide d’un milieu avec des facteurs de croissance qui favorisent la viabilité des cellules souches et des matrices de soutien extracellulaires. Ces conditions se traduisent par un modèle HIO semblable à une crypte qui se compose principalement de progéniteurs et de cellules souches. L’élimination des facteurs de croissance favorise la différenciation de l’ISC (modèle de type villosité) et la production de cellules épithéliales intestinales matures (caliciforme, entéroendocrine, touffe, entérocytes) dans des proportions appropriées, ainsi que la prolifération et la différenciation cellulaires, la polarisation, l’intégrité de la barrière, les caractéristiques spécifiques régionales et les réponses physiologiques^{appropriées2}. Les cultures HIO sont génétiquement stables et peuvent être propagées indéfiniment dans leur état de crypte. L’accès facile à la surface apicale de ces cultures est fourni par des conditions de culture qui permettent la croissance dans un format monocouche³. Les DOI permettent également d’inclure dans les analyses biologiques des considérations relatives à la variabilité individuelle de l’hôte, comme la génétique, l’âge, le sexe, l’origine ethnique et le statut pathologique. Les outils d’évaluation analytique et fonctionnelle sont identiques à ceux utilisés dans les approches centrées sur les lignées cellulaires transformées et comprennent une variété de techniques moléculaires telles que la cytométrie en flux, la microscopie, la transcriptomique, la protéomique et la métabolomique.

La transcriptomique unicellulaire révolutionne notre compréhension de la biologie et de la physiologie de l’intestin grêle en fournissant un aperçu des contributions individuelles de chaque type de cellule à un processus biologique. Des travaux pionniers utilisant cette technologie ont fourni un paysage des types de cellules présentes dans l’intestin humain natif ^4,5,6. Les plateformes de profilage transcriptionnel unicellulaire permettent d’explorer le paysage transcriptionnel des cellules individuelles, permettant à l’hétérogénéité cellulaire d’être à l’avant-garde de l’exploration scientifique. Dans certaines plateformes de profilage transcriptionnel unicellulaire, le partitionnement microfluidique et le codage à barres sont utilisés pour générer des banques d’ADNc à partir d’ARNm cellulaires polyadénylés obtenus à partir d’un maximum de 10 000 cellules par échantillon. Sur cette plate-forme, des gouttelettes contenant des cellules uniques, des oligonucléotides à code-barres, des réactifs de transcription inverse et de l’huile forment une vésicule réactionnelle qui fait que tous les ADNc d’une seule cellule ont le même code-barres. Les ADNc à code-barres peuvent ensuite être séquencés efficacement à l’aide du séquençage de nouvelle génération. Les données générées peuvent être traitées à l’aide de logiciels et d’outils de visualisation, qui convertissent les séquences de code-barres en cartes de visualisation et en profils transcriptionnels unicellulaires. Les populations cellulaires peuvent être identifiées à l’aide de bases de données publiques sur l’épithélium ^4,5,6 de l’intestin grêle humain. Bien que de nombreuses études aient utilisé cette plateforme pour interroger les organoïdes intestinaux murins au niveau de la cellule unique, l’analyse des réponses transcriptionnelles des HIO sur cellule unique a pris du retard par rapport à 7,8,9,10,11,12.

Nous présentons ici un guide étape par étape pour isoler des cellules viables à partir d’OHI de l’intestin grêle afin de les traiter sur des plateformes de profilage transcriptionnel unicellulaire (Figure 1). Nous fournissons des directives de culture et de différenciation ainsi que des composants de milieux qui ont été optimisés pour la différenciation épithéliale. Nous décrivons des méthodes de récupération cellulaire pour trois formats de culture différents : les cultures tridimensionnelles (3D) et monocouches, sur plastique ou sur des inserts de culture cellulaire à membrane. Nous fournissons des échantillons de données de regroupement obtenus à l’aide d’un logiciel open source pour dériver des gènes exprimés de manière différentielle dans chaque grappe.

Protocole

Les lignées organoïdes utilisées ici ont été obtenues à partir du GEMS Core du Texas Medical Center Digestive Disease Center. En bref, pour établir initialement des lignées d’organoïdes, des échantillons de tissus du donneur ont été lavés et digérés par voie enzymatique pour libérer les cryptes intestinales. Les cryptes ont été encastrées dans une membrane basale et cultivées dans un milieu. Le conseil d’examen institutionnel du Baylor College of Medicine a approuvé le protocole d’étude pour obtenir des échantillons de tissus à partir desquels des lignées organoïdes ont été établies, et le consentement éclairé a été obtenu de tous les donneurs pour établir des lignées organoïdes à partir des tissus donnés.

1. Transfert des HIO 3D pour se différencier

1. Retirer et jeter le milieu des puits d’organoïdes cultivés en plaques de 24 puits (autour de la membrane basale solide) à l’aide d’une pipette P1000. Ajouter 300 μL de trypsine-EDTA à 0,05 % dans le puits et briser mécaniquement les organoïdes en pipetant avec une pipette P1000 de haut en bas 5x.
2. Incuber la plaque à 37 °C pendant 4 min. Ajouter 500 μL de milieu complet sans facteurs de croissance (CMGF-milieu) avec 10 % FBS dans chaque puits (tableau 1). Utilisez une pipette P1000 et une pipette CMGF medium et un mélange HIO, 10x d’avant en arrière dans le puits. Transférez tout le volume dans un tube de 15 ml. Combinez le passage de plusieurs puits dans le même tube de 15 ml. Ne combinez pas plus de 10 puits par tube.
3. Faites tourner les cellules à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse à rotor pivotant à 100 x g pendant 5 min. Retirez tout le fluide, en gardant la pastille au fond du tube. Gardez le tube sur de la glace.
4. Calculer la quantité de membrane basale nécessaire pour le nombre de granules HIO plaquées et remettre en suspension la pastille HIO dans 30 μL/puits de membrane basale à l’aide des pointes de pipette P200 froides. Pipetez le mélange de membrane basale HIO sous forme de gouttelette au centre d’une plaque de 24 puits à l’aide d’embouts de pipette P200 froids.
5. Transférez la plaque dans un incubateur à 37 °C. Laissez la membrane basale se solidifier pendant 5 à 10 minutes, puis ajoutez 500 μL de milieu complet à température ambiante contenant du WNT, de la R-spondine, de la caboche, de l’EGF et de l’inhibiteur de ROCK (WRNE+Y ; Tableau 1) à chaque puits et culture dans un incubateur à 37 °C. Rafraîchissez votre culture avec WRNE+Y tous les deux jours pendant 7 jours.
   REMARQUE : Un HIO sain aura une forme kystique avec un épithélium bourgeonnant brillant (figure 2). Les cellules au milieu du kyste ne peuvent pas être visualisées. Un HIO malsain aura l’air terne et aura un épithélium épais avec un milieu solide. La caractéristique la plus importante est l’aspect brillant.

2. Différenciation HIO : format 3D

1. Utiliser un puits de HIO 3D pour 3 puits de HIO différenciés 3D 1 semaine après la culture.
2. Retirez le milieu des puits. Dispersez la membrane basale et les HIO à l’aide d’une pipette P1000 et ajoutez 500 μL froids de CMGF- par puits et pipetez de haut en bas au moins 5 fois. Faites tourner les HIO à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse à rotor pivotant à 100 x g pendant 5 min. Retirez tout le fluide en gardant la pastille au fond du tube.
3. Ajouter 30 μL de membrane basale par puits de DOI plaqués. Pipeter la gouttelette de 30 μL de membrane basale avec des HIO dans un puits d’une plaque de 24 puits. Incuber à 37 °C pendant 10 min. Ajouter 500 μL de support WRNE+Y/Diff (50/50).
4. Passez le milieu au milieu de différenciation après 24 h pendant 3 jours supplémentaires, en rafraîchissant le milieu tous les deux jours. Préparez 3 puits par échantillon pour la piscine afin de réduire la variabilité technique.

3. Différenciation HIO : Format monocouche

1. Enduire les inserts ou les puits de culture cellulaire membranaire d’une plaque de 96 puits avec 100 μL/puits de collagène placentaire humain IV (1 mg/ml dans 100 mM d’acide acétique) dilué dans du_H2O froid (1:30). Incuber à 37 °C pendant au moins 1,5 h ou au maximum toute la nuit. Pour l’insert de culture cellulaire membranaire, ajouter du H₂O stérile dans l’espace de la plaque pour humidifier la plaque ; pour une plaque à 96 puits, ajouter du H₂O stérile dans les puits non utilisés.
2. Prélever les HIO 3D cultivés dans WRNE pendant 7 jours en retirant le milieu et en récupérant la membrane basale et les cellules en ajoutant 500 μL/puits d’EDTA froid 0,5 mM (0,5 M EDTA dilué 1:1000 dans du PBS stérile). Utilisez une pipette P1000 pour pipeter les organoïdes et la solution de haut en bas 5 fois et transférez-les dans un tube de microcentrifugation de 15 ml. Ne mettez pas en commun plus de 10 puits d’organoïdes par tube. Centrifugeuse pendant 5 min à 300 x g dans un rotor à godets oscillants à 4 °C.
   REMARQUE : Pour préparer 3 puits sur une plaque de 96 puits, utilisez 1 puits de HIO 3D. Pour préparer 1 insert de culture cellulaire sur membrane, utilisez 1 puits de HIO 3D (la densité d’ensemencement des cellules individuelles est d’environ 1-2 x 10⁵ cellules/puits pour une plaque de 96 puits, 2,5-3-3 x 10⁵ cellules/puits pour l’insert de culture cellulaire sur membrane).
3. Retirez 500 μL de média en laissant la pastille au fond du tube. Dissocier les OIH en ajoutant 500 μL de trypsine à 0,05 % et 0,5 mM d’EDTA et en laissant incuber pendant 4 à 5 minutes à 37 °C. Pipetez vigoureusement de haut en bas pour ~50x à l’aide d’un P1000. Évitez de faire des bulles en pipetant contre le côté du tube.
4. Inactivez la trypsine en ajoutant 1 mL de CMGF- contenant 10 % de FBS. Filtrez les gros amas de cellules non digérées en mouillant une crépine cellulaire de 40 μm avec 1 mL de CMGF- contenant 10 % de FBS et en ajoutant les cellules au sommet de la crépine cellulaire. Utilisez la gravité pour permettre aux cellules de passer à travers la passoire et jetez la crépine contenant des amas de cellules.
5. Recueillir les cellules par centrifugation pendant 5 min à 400 x g dans un rotor à godets oscillants à température ambiante.
6. Retirez le liquide de l’insert de culture cellulaire à membrane recouvert de collagène ou de la plaque à 96 puits. Remettre la pastille HIO en suspension dans 100 μL/puits de WRNE contenant 10 μM d’Y-27632, puis pipeter dans le compartiment supérieur de l’insert de culture cellulaire à membrane ou dans la plaque à 96 puits. Pour l’insert de culture cellulaire à membrane, ajoutez 600 μL de WRNE contenant 10 μM d’Y-27632 dans le compartiment inférieur du puits.
7. Après 24 h, retirer le milieu des parties supérieure et inférieure de l’insert de culture cellulaire membranaire ou de la plaque à 96 puits et le remplacer par un milieu de différenciation pendant 5 jours. Préparez 3 puits par échantillon pour la piscine afin de réduire la variabilité technique.

4. Préparation de suspensions unicellulaires à partir de HIO 3D différenciés pour la transcriptomique sur cellule unique

1. Placer le réactif de digestion cellulaire enzymatique à 37 °C dans un incubateur de CO₂ pour le décongeler et le réchauffer 30 minutes avant le début de la digestion 3D HIO. Vérifiez les HIO à l’aide d’un microscope à champ clair à 10x pour vous assurer de la santé des cellules.
2. Retirez le milieu des puits et ajoutez 500 μL de solution de récupération de cellules froides dans les puits. Pipetez de haut en bas plusieurs fois pour libérer les cellules de la membrane basale à l’aide d’une pipette P1000 et d’embouts de pipette standard. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
   REMARQUE : L’utilisation de puits répliqués permet d’assurer un nombre adéquat de cellules et de réduire les variations d’un puits à l’autre. Ne combinez pas les puits avant l’étape 4.7 ci-dessous.
3. Incuber les tubes de cellules sur de la glace pendant 10 min, en pipetant de haut en bas toutes les 5 min. Recueillir les cellules par centrifugation pendant 3 min à 400 x g à 4 °C.
4. Retirez le liquide du tube en prenant soin de ne pas déranger la pastille de cellule. Remettre les cellules en suspension dans 500 μL de réactif de digestion cellulaire enzymatique préchauffé. Pipette de haut en bas avec un P1000 au moins 10x.
5. Incuber les HIO pendant 30 min à 37 °C dans un incubateur de CO₂ . Toutes les 10 min, pipeter 10 fois l’ensemble du volume à l’aide d’une pipette P1000 pour aider à dissocier les cellules. Évitez d’introduire des bulles d’air dans la suspension cellulaire.
6. Granulez les cellules pendant 3 min à 400 x g à 4 °C. Retirer le surnageant, remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de différenciation et les stocker sur de la glace.
   REMARQUE : À partir de ce moment, les DOI doivent toujours être gardés sur la glace.
7. Pipetez les cellules de haut en bas 50 fois rapidement à l’aide d’un P1000 pour vous assurer que les HIO sont dissociés en cellules uniques. Veillez à ne pas introduire de bulles d’air à cette étape, car cela entraînerait une perte de cellules.
8. Filtrez tout le volume à travers une crépine de 70 μm à l’aide d’une pointe de pipette P1000. À l’aide d’un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, recueillir l’éluat.
   REMARQUE : L’embout du filtre ne se bouchera pas si le temps de digestion est suffisant. Utilisez plusieurs filtres si le filtre est bouché ; Ne forcez pas le volume à travers le filtre.
9. Répétez l’étape 4.8 avec une passoire à pointe de 40 μm. Conservez les échantillons sur de la glace.
10. Compter les cellules individuelles viables sur une chambre de comptage cellulaire en utilisant l’exclusion du bleu de trypan en ajoutant 5 μL de bleu de trypan à 0,4 % à 5 μL de suspension cellulaire. Diluer l’échantillon au besoin à 1000 cellules/μL. Si la densité cellulaire est inférieure à 1000 cellules/μL, granulez les cellules pendant 2 min à 400 x g à 4 °C, retirez le milieu d’origine et remettez-les en suspension dans le milieu de culture cellulaire. Ce protocole produit généralement 5 x 10^5-1 x 10⁶ cellules.
    REMARQUE : La préparation d’une suspension de haute qualité (90 % de cellules viables et 90 % de cellules uniques) est essentielle pour des données de haute qualité sur une seule cellule. Cependant, l’expérience montre qu’une viabilité aussi faible que 75 % peut être acceptée dans les cas où un traitement, comme une infection ou l’application de petites molécules, a un impact sur la viabilité.
11. Préparer des banques d’ADN pour les plateformes de profilage transcriptionnel de cellules uniques selon les protocoles du fabricant. Traiter les données selon les protocoles de meilleures pratiques pour l’analyse des données scRNAseq^13,14.

5. Préparation de suspensions unicellulaires à partir de HIO différenciés sur insert de culture cellulaire membranaire

1. Placer le réactif de digestion cellulaire enzymatique à 37 °C dans un incubateur de CO₂ pour le décongeler et le réchauffer 30 min avant le début de la digestion par insert de culture cellulaire membranaire HIO. Divisez le réactif de digestion cellulaire enzymatique préchauffé en aliquotes de 200 μL dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL, 1 tube par insert de culture cellulaire à membrane. Conservez les tubes dans l’incubateur à 37 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi.
2. Préparez le PBS-EDTA en ajoutant 5 μL de 0,5 M EDTA à 5 mL de PBS. Aliquote 500 μL de PBS-EDTA dans une plaque de 24 puits, 1 puits par insert de culture cellulaire membranaire.
3. Laver les cellules avec du PBS-EDTA : transférer les inserts de culture cellulaire membranaire des puits contenant des milieux de croissance vers les puits contenant du PBS-EDTA. Retirez le milieu de culture cellulaire du côté apical et remplacez-le par 100 μL de PBS-EDTA. Veillez à ne pas perturber la couche cellulaire.
4. Jetez immédiatement le PBS-EDTA ajouté sur la face apicale des inserts de culture cellulaire membranaire. Retirez l’insert de culture cellulaire à membrane du puits, épongez-le en touchant doucement le bord d’une serviette en papier, puis retournez-le sur la paillasse. À l’aide d’une lame de scalpel tranchante, vous pouvez retirer la membrane de l’insert en coupant autour de la circonférence intérieure de la membrane. Travaillez rapidement pour éviter le dessèchement.
5. À l’aide d’une pince, transférez la membrane dans le tube de microcentrifugation préchauffé de 1,5 mL rempli d’un réactif de digestion cellulaire enzymatique et assurez-vous que la membrane est complètement immergée. Répétez l’opération pour tous les inserts de culture cellulaire à membrane supplémentaires.
   REMARQUE : L’augmentation du volume du réactif de digestion cellulaire enzymatique à 500 μL peut aider à dissocier les monocouches denses.
6. Dissocier les cellules en incubant des tubes avec des membranes à 37 °C dans un incubateur de CO₂ . Mélanger en pipetant doucement tout le volume 5x avec une pipette de 200 μL toutes les 10 min pour un total de 30 min. Eviter les bulles et l’aspiration de la membrane pour préserver la viabilité.
7. Transférez une petite aliquote de cellules (1-2 μL) dans une lame de verre toutes les 10 minutes pour évaluer la dissociation en évaluant qualitativement le pourcentage de cellules individuelles. Cela peut prendre jusqu’à 50 minutes avec un pipetage supplémentaire pour obtenir 80 % à 90 % de cellules uniques, selon le type de HIO. Grattez doucement la membrane avec la pointe d’une pipette pendant les étapes de mélange pour favoriser la dissociation, en particulier pour les cellules difficiles à dissocier, mais le grattage peut avoir un impact sur la viabilité.
8. Combinez 3 puits répétés par condition dans un seul tube de microcentrifugation de 1,5 mL (600 μL au total). Ajouter 400 μL de milieu de culture cellulaire (diff) + 10 μM ROCKi (volume total de 1 mL). Mélanger délicatement par pipetage.
   REMARQUE : L’utilisation de puits répliqués permet d’assurer un nombre adéquat de cellules et de réduire les variations d’un puits à l’autre. Les puits doivent être regroupés à cette étape.
9. Filtrez tout le volume à travers une passoire de 70 μm à l’aide d’une pointe de pipette de 1 ml. Recueillir le débit dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 ml.
   REMARQUE : L’embout du filtre ne se bouchera pas si le temps de digestion est suffisant. Utilisez plusieurs filtres si le filtre est bouché ; Ne forcez pas le volume.
10. Répétez l’étape 5.9 avec une passoire à pointe de 40 μm. Conservez les échantillons sur de la glace.
11. Compter les cellules individuelles viables sur une chambre de comptage cellulaire en utilisant l’exclusion du bleu de trypan en ajoutant 5 μL de bleu de trypan à 0,4 % à 5 μL de suspension cellulaire. Diluer l’échantillon au besoin à 1000 cellules/μL. Si la densité cellulaire est inférieure à 1000 cellules/μL, essorez 2 min à 400 x g à 4 °C pour granuler les cellules, retirer le milieu d’origine et remettre en suspension dans WRNE+Y à la densité cellulaire souhaitée. Ce protocole produit généralement 4 x 10⁵ - 6 x 10⁵ cellules.
    REMARQUE : La préparation d’une suspension de haute qualité (90 % de cellules viables et 90 % de cellules uniques) est essentielle pour obtenir des données de haute qualité sur une seule cellule. Cependant, l’expérience montre qu’une viabilité aussi faible que 75 % peut être acceptée dans les cas où un traitement, comme une infection ou l’application de petites molécules, a un impact sur la viabilité.
12. Préparer des banques d’ADN pour les plateformes de profilage transcriptionnel de cellules uniques selon les protocoles du fabricant. Traiter les données selon les protocoles de meilleures pratiques pour l’analyse des données scRNAseq^13,14.

6. Préparation de suspensions unicellulaires à partir de HIO différenciés en monocouches à 96 puits

1. Placer le réactif de digestion cellulaire enzymatique à 37 °C dans un incubateur de CO₂ pour le décongeler et le réchauffer 30 minutes avant le début de la digestion HIO monocouche.
2. Préparez le PBS-EDTA en ajoutant 5 μL de 0,5 M EDTA à 5 mL de PBS. Jetez le milieu de culture cellulaire de la plaque à 96 puits et remplacez-le par 100 μL de PBS-EDTA. Veillez à ne pas perturber la couche cellulaire.
3. Dissociez les cellules : Jetez le PBS-EDTA et ajoutez 100 μL de réactif de digestion cellulaire enzymatique chaud dans chaque puits. Placez la plaque à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ et mélangez en pipetant doucement tout le volume 5 fois avec une pointe de pipette de 200 μL toutes les 10 minutes pendant 20 à 30 minutes. Évitez les bulles pour préserver la viabilité.
   REMARQUE : L’augmentation du volume de réactif de digestion cellulaire enzymatique à 500 μL peut aider à dissocier les monocouches denses.
4. Transférez une petite aliquote de cellules (1-2 μL) dans une lame de verre toutes les 10 minutes pour évaluer la dissociation. Il peut s’écouler jusqu’à 50 minutes avant d’obtenir 80 % à 90 % de cellules individuelles, selon le type de DOI. Racler doucement la plaque à l’aide d’une pointe de pipette pendant les étapes de mélange pour favoriser la dissociation, en particulier pour les cellules difficiles à dissocier ; Cependant, le grattage peut avoir un impact sur la viabilité.
5. Combinez 3 puits répétés par condition dans un seul tube de microcentrifugation de 1,5 mL (300 μL au total). Ajouter 700 μL de milieu de culture cellulaire (diff) + 10 uM ROCKi (volume total de 1 mL). Mélanger délicatement par pipetage.
   REMARQUE : L’utilisation de puits cultivés répétés garantit un nombre adéquat de cellules et réduit les variations d’un puits à l’autre.
6. Filtrez tout le volume à travers une passoire de 70 μm à l’aide d’une pointe de pipette de 1 ml. Recueillir le débit dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 ml.
   REMARQUE : L’embout du filtre ne se bouchera pas si le temps de digestion du réactif de digestion cellulaire enzymatique est suffisant. Utilisez plusieurs filtres si le filtre est bouché ; Ne forcez pas le volume.
7. Répétez l’étape 6.6 avec une crépine à pointe de 40 μm. Conservez les échantillons sur de la glace.
8. Compter les cellules individuelles viables sur une chambre de comptage cellulaire en utilisant l’exclusion du bleu de trypan en ajoutant 5 μL de bleu de trypan à 0,4 % à 5 μL de suspension cellulaire. Diluer au besoin à 1000 cellules/μL. Si la densité cellulaire est inférieure à 1000 cellules/μL, essorer 2 min à 400 x g 4 °C pour granuler les cellules, retirer le milieu d’origine et remettre en suspension dans le milieu de culture cellulaire + ROCKi à la densité cellulaire souhaitée. Ce protocole produit généralement 2 x 10⁵ - 6 x 10⁵ cellules.
   REMARQUE : La préparation d’une suspension de haute qualité (90 % de cellules viables et 90 % de cellules uniques) est essentielle pour obtenir des données de haute qualité sur une seule cellule. Cependant, l’expérience montre qu’une viabilité aussi faible que 75 % peut être acceptée dans les cas où un traitement, comme une infection ou l’application de petites molécules, a un impact sur la viabilité.
9. Préparez des banques d’ADN selon les protocoles du fabricant de la plate-forme de profilage transcriptionnel de cellule unique. Traiter les données selon les protocoles de meilleures pratiques pour l’analyse des données scRNAseq^13,14.

Résultats

Des suspensions unicellulaires ont été regroupées à partir de 2 à 3 puits d’insert de culture cellulaire membranaire, de monocouche et de HIO 3D pour assurer un rendement cellulaire suffisant et réduire les variations d’un puits à l’autre. Des banques de cellules uniques ont été préparées à l’aide de réactifs spécifiques à la plateforme de profilage transcriptionnel de cellule unique. et séquencé avec des lectures d’extrémité appariées sur une plate-forme de séquençage de nouvelle généra...

Discussion

À l’aide de plateformes de génomique unicellulaire, des systèmes biologiques complexes, tels que les cultures HIO dérivées de tissus qui modélisent l’épithélium intestinal, peuvent être décomposés pour produire des contributions cellulaires individuelles à la réponse biologique globale ^4,5,6. L’hétérogénéité cellulaire et les populations cellulaires rares peuvent également être identifiées et interrog?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145	10 nM
0.05% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.4% Trypan blue	Millipore-Sigma	T8154
0.5 M EDTA	Corning	46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-	Corning	21-040-CM
24 mm Transwell	Costar	3412
24 well Nunclon delta surface tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
40 µm cell strainer	Falcon	352340
40 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0040
70 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0070
96 well plate	Corning	3595
A-83-01	Tocris	2939	500 nM
Accutase	StemCell Technologies	7920
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	1X
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000128
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG	33 µg/mL
Corning Cell Recovery Solution	VWR	354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)	Invitrogen	14190-136	1X
GlutaMAX-I	Invitrogen	35050-061	2 mM
HEPES 1M	Invitrogen	15630-080	10 mM
L-WRN conditioned media	ATCC	CRL-3276
Matrigel, GFR, phenol free	Corning	356231
mouse recombinant EGF	Invitrogen	PMG8043	50 ng/mL
N2 supplement	Invitrogen	17502-048	1X
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G	500 µM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	10 mM
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067	10 µM
Transwell	Corning	3413
Y27632	Stem Cell Technologies	72308	10 µM