Utilisation d’organoïdes intestinaux humains pour comprendre l’épithélium de l’intestin grêle au niveau transcriptionnel d’une seule cellule

Résumé

Le protocole combine la technologie des organoïdes intestinaux humains avec l’analyse transcriptomique d’une seule cellule pour fournir des informations significatives sur la biologie intestinale jusqu’alors inexplorée.

Résumé

La transcriptomique sur cellule unique a révolutionné notre compréhension de la biologie cellulaire du corps humain. Des cultures d’organoïdes de l’intestin grêle humain à la pointe de la technologie fournissent des systèmes modèles ex vivo qui comblent le fossé entre les modèles animaux et les études cliniques. L’application de la transcriptomique sur cellule unique à des modèles d’organoïdes intestinaux humains (HIO) révèle la biologie cellulaire, la biochimie et la physiologie du tractus gastro-intestinal jusqu’alors inconnues. Les plateformes avancées de transcriptomique de cellules uniques utilisent le partitionnement microfluidique et le codage à barres pour générer des banques d’ADNc. Ces ADNc à code-barres peuvent être facilement séquencés par des plateformes de séquençage de nouvelle génération et utilisés par divers outils de visualisation pour générer des cartes. Ici, nous décrivons des méthodes de culture et de différenciation des HIO de l’intestin grêle humain dans différents formats et des procédures pour isoler des cellules viables à partir de ces formats qui conviennent à une utilisation dans des plateformes de profilage transcriptionnel unicellulaire. Ces protocoles et procédures facilitent l’utilisation des HIO de l’intestin grêle afin d’obtenir une meilleure compréhension de la réponse cellulaire de l’épithélium intestinal humain au niveau transcriptionnel dans le contexte d’une variété d’environnements différents.

Introduction

L’épithélium de l’intestin grêle comporte deux zones distinctes : la crypte qui abrite les cellules souches intestinales (CSI) et les villosités, qui sont composées de cellules différenciées des lignées sécrétoires et absorbantes. À cette complexité s’ajoute la spécificité régionale de l’épithélium qui offre des propriétés fonctionnelles uniques entre les régions de l’intestin grêle. Des travaux pionniers ont permis d’établir des conditions de culture dans lesquelles la crypte de l’intestin grêle humain et les zones villosités peuvent être générées ex vivo à partir de tissus chirurgicaux ou de biopsies tissulaires¹. Ces cultures comble....

Protocole

Les lignées organoïdes utilisées ici ont été obtenues à partir du GEMS Core du Texas Medical Center Digestive Disease Center. En bref, pour établir initialement des lignées d’organoïdes, des échantillons de tissus du donneur ont été lavés et digérés par voie enzymatique pour libérer les cryptes intestinales. Les cryptes ont été encastrées dans une membrane basale et cultivées dans un milieu. Le conseil d’examen institutionnel du Baylor College of Medicine a approuvé le protocole d’étude pour obtenir des échantillons de tissus à partir desquels des lignées organoïdes ont été établies, et le consentement éclairé a été obtenu de tous les donneurs pour établir des lignées....

Discussion

À l’aide de plateformes de génomique unicellulaire, des systèmes biologiques complexes, tels que les cultures HIO dérivées de tissus qui modélisent l’épithélium intestinal, peuvent être décomposés pour produire des contributions cellulaires individuelles à la réponse biologique globale ^4,5,6. L’hétérogénéité cellulaire et les populations cellulaires rares peuvent également être identifiées et interrog?.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145	10 nM
0.05% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.4% Trypan blue	Millipore-Sigma	T8154
0.5 M EDTA	Corning	46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-	Corning	21-040-CM
24 mm Transwell	Costar	3412
24 well Nunclon delta surface tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
40 µm cell strainer	Falcon	352340
40 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0040
70 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0070
96 well plate	Corning	3595
A-83-01	Tocris	2939	500 nM
Accutase	StemCell Technologies	7920
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	1X
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000128
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG	33 µg/mL
Corning Cell Recovery Solution	VWR	354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)	Invitrogen	14190-136	1X
GlutaMAX-I	Invitrogen	35050-061	2 mM
HEPES 1M	Invitrogen	15630-080	10 mM
L-WRN conditioned media	ATCC	CRL-3276
Matrigel, GFR, phenol free	Corning	356231
mouse recombinant EGF	Invitrogen	PMG8043	50 ng/mL
N2 supplement	Invitrogen	17502-048	1X
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G	500 µM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	10 mM
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067	10 µM
Transwell	Corning	3413
Y27632	Stem Cell Technologies	72308	10 µM