Utilizzo di organoidi intestinali umani per comprendere l'epitelio dell'intestino tenue a livello trascrizionale di una singola cellula

Riepilogo

Il protocollo combina la tecnologia degli organoidi intestinali umani con l'analisi trascrittomica a singola cellula per fornire informazioni significative sulla biologia intestinale precedentemente inesplorata.

Abstract

La trascrittomica a singola cellula ha rivoluzionato la nostra comprensione della biologia cellulare del corpo umano. Le colture di organoidi intestinali tenue umani all'avanguardia forniscono sistemi modello ex vivo che colmano il divario tra i modelli animali e gli studi clinici. L'applicazione della trascrittomica a singola cellula a modelli di organoidi intestinali umani (HIO) sta rivelando la biologia, la biochimica e la fisiologia cellulare del tratto gastrointestinale precedentemente non riconosciute. Le piattaforme avanzate di trascrittomica a singola cellula utilizzano il partizionamento microfluidico e la codifica a barre per generare librerie di cDNA. Questi cDNA con codice a barre possono essere facilmente sequenziati da piattaforme di sequenziamento di nuova generazione e utilizzati da vari strumenti di visualizzazione per generare mappe. Qui, descriviamo i metodi per coltivare e differenziare gli HIO dell'intestino tenue umano in diversi formati e procedure per isolare le cellule vitali da questi formati che sono adatti per l'uso in piattaforme di profilazione trascrizionale a singola cellula. Questi protocolli e procedure facilitano l'uso di HIO intestinali tenue per ottenere una maggiore comprensione della risposta cellulare dell'epitelio intestinale umano a livello trascrizionale nel contesto di una varietà di ambienti diversi.

Introduzione

L'epitelio dell'intestino tenue ha due zone distinte: la cripta che ospita la cellula staminale intestinale (ISC) e il villo, che è composto da cellule differenziate delle linee secretorie e assorbenti. A questa complessità si aggiunge la specificità regionale dell'epitelio che fornisce proprietà funzionali uniche tra le regioni dell'intestino tenue. Il lavoro pionieristico ha stabilito le condizioni di coltura in cui sia la cripta intestinale tenue umana che le zone dei villi possono essere generate ex vivo da tessuti chirurgici o biopsie tissutali¹. Queste colture stanno colmando il divario tra gli studi sugli animali e gli studi cli....

Protocollo

Le linee di organoidi utilizzate qui sono state ottenute dal Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core. In breve, per stabilire inizialmente le linee di organoidi, i campioni di tessuto del donatore sono stati lavati e digeriti enzimaticamente per rilasciare le cripte intestinali. Le cripte sono state incorporate in una membrana basale e coltivate in un mezzo. L'Institutional Review Board del Baylor College of Medicine ha approvato il protocollo di studio per ottenere campioni di tessuto da cui sono state stabilite le linee di organoidi ed è stato ottenuto il consenso informato da tutti i donatori per stabilire linee di organoidi dal tessuto donato.

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Discussione

Utilizzando piattaforme di genomica a singola cellula, sistemi biologici complessi, come le colture HIO derivate da tessuti che modellano l'epitelio intestinale, possono essere scomposti per produrre contributi cellulari individuali alla risposta biologica complessiva ^4,5,6. È inoltre possibile identificare e interrogare l'eterogeneità cellulare e le popolazioni cellulari rare. L'input cellulare deve essere ottimizzato per mas.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145	10 nM
0.05% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.4% Trypan blue	Millipore-Sigma	T8154
0.5 M EDTA	Corning	46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-	Corning	21-040-CM
24 mm Transwell	Costar	3412
24 well Nunclon delta surface tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
40 µm cell strainer	Falcon	352340
40 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0040
70 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0070
96 well plate	Corning	3595
A-83-01	Tocris	2939	500 nM
Accutase	StemCell Technologies	7920
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	1X
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000128
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG	33 µg/mL
Corning Cell Recovery Solution	VWR	354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)	Invitrogen	14190-136	1X
GlutaMAX-I	Invitrogen	35050-061	2 mM
HEPES 1M	Invitrogen	15630-080	10 mM
L-WRN conditioned media	ATCC	CRL-3276
Matrigel, GFR, phenol free	Corning	356231
mouse recombinant EGF	Invitrogen	PMG8043	50 ng/mL
N2 supplement	Invitrogen	17502-048	1X
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G	500 µM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	10 mM
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067	10 µM
Transwell	Corning	3413
Y27632	Stem Cell Technologies	72308	10 µM