Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تعرض الدراسة الحالية بروتوكولات لتقييم الالتزام المبكر بالمصير لخلايا TFH الخاصة بالفيروس والتلاعب بالتعبير الجيني في هذه الخلايا.

Abstract

ينظر إلى الخلايا التائية المساعدة المسامية (TFH) على أنها سلالة خلايا CD4 + T مستقلة تساعد الخلايا البائية المشابهة في إنتاج أجسام مضادة عالية التقارب ، وبالتالي إنشاء مناعة خلطية طويلة المدى. أثناء العدوى الفيروسية الحادة ، يتم تحديد التزام مصير الخلاياالتائية FH الخاصة بالفيروس في مرحلة العدوى المبكرة ، والتحقيقاتفي الخلايا التائية FH المتمايزة المبكرة أمر بالغ الأهمية في فهم المناعة الخلطية المعتمدة على الخلايا التائية وتحسين تصميم اللقاح. في الدراسة ، باستخدام نموذج فأر لعدوى فيروس التهاب المشيمة اللمفاوي الحاد (LCMV) وفأر SMARTA (SM) المعدل وراثيا TCR مع خلايا CD4 + T التي تتعرف على وجه التحديد على خاتمة البروتين السكري LCMV I-AbGP66-77 ، وصفنا إجراءات للوصول إلى التزام المصير المبكر لخلاياT FH الخاصة بالفيروس بناء على تلطيخ قياس التدفق الخلوي. علاوة على ذلك ، من خلال استغلال نقل الفيروسات القهقرية لخلايا SM CD4 + T ، يتم أيضا توفير طرق لمعالجة التعبير الجينيفي خلايا T FH الخاصة بالفيروس المتمايزة مبكرا. ومن ثم ، ستساعد هذه الطرق في الدراسات التي تستكشف الآلية (الآليات) الكامنة وراء الالتزام المبكر لخلاياT FH الخاصة بالفيروس.

Introduction

في مواجهة مسببات الأمراض أو التهديدات المختلفة ، تصمم الخلايا التائية CD4 + T الساذجة استجاباتها المناعية من خلال التمايز إلى مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا التائية المساعدة (TH) ذات وظائف متخصصة1. في سيناريو العدوى الفيروسية الحادة ، يتمايز جزء كبير من الخلايا التائية CD4 + الساذجة إلى خلايا T (T FH) المساعدة المسامية التي توفر المساعدة للخلايا البائية 2,3. تختلف الخلايا TFH عن المجموعات الفرعية الأخرى لخلايا CD4 + T H (على سبيل المثال ، خلايا TH1 و TH2 و TH9 و TH17) ، وتعبر عن مستوى كبير من CXCR5 ، وهو مستقبل الكيموكين للكيموكين CXCL13 للخلايا البائية الموجهة ، مما يمكن الخلايا التائيةFH من الهجرة إلى بصيلات الخلايا البائية. في بصيلات الخلايا البائية ، تساعد الخلايا التائيةFH الخلايا البائية المشابهة في بدء تفاعلات المركز الجرثومي والحفاظ عليها ، مما يتيح الإنتاج السريع للأجسام المضادة عالية التقارب والذاكرة الخلطية طويلة المدى 2,3.

عند الإصابة الفيروسية الحادة ، يحدث الالتزام المبكر بالمصير لخلاياT FH الخاصة بالفيروس في غضون 72 ساعة 4,5 ويتم التحكم فيه بواسطة سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية المثبطة للنسخ -6 (Bcl-6) 5،6،7،8 ، والتي تعمل بمثابة "المنظم الرئيسي" الذي يحكم قرارات مصير الخلاياالتائية FH. يؤدي نقص Bcl-6 إلى إضعاف تمايز الخلايا التائيةFH بشدة ، بينما يعزز تعبير Bcl-6 خارج الرحم بشكل كبير الالتزام بمصير الخلايا التائيةFH. بالإضافة إلى Bcl-6 ، تشارك جزيئات متعددة في توجيه الالتزام المبكر بمصير الخلاياالتائية FH. تبدأ عوامل النسخ TCF-1 و LEF-1 تمايز الخلايا التائيةFH عن طريق تحريض Bcl-69،10،11. إن تثبيط Blimp1 ، بواسطة كل من Bcl-6 و TCF-1 ، مطلوب للالتزام المبكر بمصير الخلاياالتائية FH 11,12. STAT1 و STAT3 مطلوبان أيضا لتمايز الخلايا التائيةFH المبكرة 13. إلى جانب ذلك ، تساعد التعديلات اللاجينية بواسطة هيستون ميثيل ترانسفيراز EZH214،15و m6A methyltransferase METTL316 على استقرار برامج نسخ الخلايا التائيةFH (خاصة Bcl6 و Tcf7) وبالتالي الالتزام المبكر بمصير الخلاياالتائية FH. في حين تم إحراز تقدم ، بما في ذلك الجزيئات المذكورة أعلاه وغيرها ، والتي تم تلخيصها في مكان آخر3 ، في فهم اللوائح النسخية واللاجينية للالتزام المبكر بمصير الخلاياالتائية FH ، لا يزال يتعين تعلم الجزيئات غير المعروفة سابقا.

في نموذج الفأر لعدوى فيروس التهاب المشيمية اللمفاوي الحاد (LCMV) ، تنتقل بالتبني خلايا SMARTA (SM) CD4 + T المتجانسة TCR المعدلة وراثيا ، والتي تتعرف على وجه التحديد على خاتمة البروتين السكري LCMV I-AbGP66-77 ، إما تمايز الخلايا TFH أو TH1 أثناء العدوى الفيروسية. يدعم نمط تمايز التشعب TFH / TH1 تقدم نموذج عدوى SM / LCMV الحاد في دراسة بيولوجيا خلايا TFH الخاصة بالفيروس. في الواقع ، تم استخدام نموذج عدوى SM / LCMV الحاد على نطاق واسع في مجال أبحاث الخلايا التائيةFH ولعب دورا حاسما في الاكتشافات البارزة في بيولوجيا الخلايا TFH. يتضمن ذلك تحديد Bcl-6 المذكور أعلاه كعامل نسخ محدد للنسب لخلايا TFH 5,6 ، بالإضافة إلى عوامل النسخ المهمة الأخرى (على سبيل المثال ، Blimp-16 و TCF-1 / LEF9،10،11 و STAT1 / STAT313 و STAT517 و KLF218 و Itch19) توجيه تمايز الخلايا TFH ، لوائح ما بعد النسخ ( على سبيل المثال ، METTL316 و miR-17 ~ 9220) من تمايز الخلايا التائيةFH ، ذاكرة الخلايا التائيةFH واللدونة21،22 ، واستراتيجيات التطعيم العقلانية التي تستهدف خلاياT FH (على سبيل المثال ، السيلينيوم23).

تصف الدراسة الحالية طرقا قابلة للتكرار للوصول إلى التزام المصير المبكر لخلايا TFH الخاصة بالفيروس ، بما في ذلك (1) إنشاء نموذج فأر SM chimera مصاب ب LCMV بشكل حاد مناسب للوصول إلى خلايا TFH المتمايزة مبكرا ، (2) إجراء تلطيخ قياس التدفق الخلوي للجزيئات المتعلقة بخلايا TFH المتمايزة مبكرا ، و (3) إجراء معالجة الجينات القائمة على ناقلات الفيروسات القهقرية في SM CD4 + الخلايا التائية. ستكون هذه الطرق مفيدة للدراسات التي تبحث في الالتزام المبكر بالمصير لخلاياT FH الخاصة بالفيروس.

Protocol

أجريت جميع التجارب على باتباع الإجراءات المعتمدة من قبل لجان رعاية واستخدام المؤسسية في الجامعة الطبية العسكرية الثالثة. تم استخدام سلالات الفئران التالية في الدراسة الحالية: الفأر C57BL / 6J (B6) (كلا الجنسين) ، الذين تتراوح أعمارهم بين 6 إلى 8 أسابيع ، ويزن 25-30 جم. CD45.1 + SM TCR الماوس المعدل وراثيا (B6 CD45.1 × SM TCR المعدلة وراثيا) ، كلا الجنسين ، الذين تتراوح أعمارهم بين 6 إلى 8 أسابيع ، ويزن 25-30 جم ؛ و CXCR5-GFP CD45.1 + SM TCR الماوس المعدل وراثيا (B6 CD45.1 × SM TCR المعدلة وراثيا × CXCR5-GFP) ، كلا الجنسين ، الذين تتراوح أعمارهم بين 6 إلى 8 أسابيع ، ويزن 25-30 جم. تم إنشاء الأنواع المعدلة وراثيا بعد تقرير نشر سابقا24. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمخازن المؤقتة والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. حصاد خلايا CD45.1 + SM CD4 + T للنقل بالتبني

  1. القتل الرحيم (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) العدد المطلوب من الفئران SM المعدلة وراثيا CD45.1 + TCR24 التي يبلغ عمرها من 6 إلى 8 أسابيع. قم بعمل شق 1 بوصة على يسار الجدار البريتوني للفئران الرحيمة بواسطة مقص جراحي ، وتشريح الطحال من الصفاق ، وتمزيق النسيج الضام خلف الطحال25,26.
  2. ضع كل طحال في مصفاة خلايا 70 ميكرومتر داخل طبق بتري (60 مم × 15 مم) وطحن الطحال ب 3 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) باستخدام مكبس حقنة سعة 1 مل.
    ملاحظة: استخدم الجانب المستدير من مكبس المحقنة لطحن الطحال حتى يبقى النسيج الضام فقط.
  3. أضف 6 مل من RPMI + 2٪ FBS (RPMI 2٪) في كل طبق لتخفيف 3 مل من محلول تحلل كرات الدم الحمراء. ماصة تعلق الخلية في أنبوب مخروطي 15 مل من الطبق. شطف الطبق مع 3 مل إضافية من 2 ٪ RPMI ونقل إلى نفس الأنبوب المخروطي.
  4. قم بطرد مركزي لتعليق الخلية عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية عن طريق الصب. أعد تعليق الخلايا بمخزن مؤقت للعزل واضبط كثافة الخلية على ~ 1 × 108 خلايا لكل مل. ضع الأنبوب على الثلج.
  5. قم بإعداد كوكتيل 1x من الأجسام المضادة البيوتينيلية ضد CD8a و CD19 و NK1.1 و F4 / 80 و CD11c و Ter119 في مخزن مؤقت معزول لإثراء خلايا CD4 + T.
    ملاحظة: أضف الأجسام المضادة البيوتينيلية إلى المخزن المؤقت للعزل عند التخفيف المشار إليه كما هو مذكور في جدول المواد. حافظ على حجم كوكتيل الأجسام المضادة كما هو الحال في المخزن المؤقت للعزل في الخطوة 1.4.
  6. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية والتخلص من المادة الطافية عن طريق الصب.
  7. إعادة تعليق بيليه الخلية مع كوكتيل الأجسام المضادة بيوتينيل المشار إليه 1x في الأنبوب المخروطي.
  8. ضع الأنبوب المخروطي على الثلج في شاكر لمدة 30 دقيقة عند 45 دورة في الدقيقة.
  9. أثناء الحضانة بالأجسام المضادة للبيوتينيل ، قم بإعداد الحجم المطلوب من الخرز المطلي بالستربتافيدين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: تحتاج الخلايا الطحالية الكلية من فأر ساذج واحد إلى 200 ميكرولتر من الخرز المغلف بالستربتافيدين .
  10. اغسل الخلايا بالطرد المركزي عند 800 × جم مع 8-10 مل من المخزن المؤقت للعزل لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
  11. إعادة تعليق بيليه الخلية مع الخرز المغلفة بالستربتافيدين المحضر.
  12. ضع الأنبوب على الثلج في شاكر لمدة 40 دقيقة عند 45 دورة في الدقيقة.
  13. ثم ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي لمدة 3-4 دقائق حتى يتم تجميع جميع الخرز على الجانب المغناطيسي.
  14. اجمع المادة الطافية بعناية وانقلها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل.
  15. قم بطرد مركزي لتعليق الخلية عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية عن طريق الصب.
    ملاحظة: هناك مجموعات تجارية أخرى متاحة لتخصيب الخلايا التائية CD4+ ، والتي يمكن استخدامها كبدائل لإجراء إثراء الخلايا التائية CD4 + الموصوف في الخطوات 1.5-1.15.
  16. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 2-3 مل من 2٪ RPMI. نضح 50 ميكرولتر من تعليق الخلية لتحليل قياس التدفق الخلوي لكفاءة إثراء الخلايا التائية CD4 + (CD4 و Vα2) وصلاحية الخلية.
  17. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية والتخلص من المادة الطافية عن طريق الصب. أعد تعليق حبيبات الخلية باستخدام RPMI واضبط كثافة الخلية على 1 × 107 خلايا CD4 + Vα2 + SM لكل مل. ضع الأنبوب على الثلج وانتقل إلى نقل الخلايا بالتبني في الخطوة التالية.

2. إنشاء نموذج فأر SM الوهمي المصاب ب LCMV للوصول إلى خلايا SM T FH المتمايزة مبكرا

  1. قم بتدفئة الفئران المتلقية C57BL / 6 التي تتراوح أعمارها بين 6 و 8 أسابيع باستخدام مصباح الأشعة تحت الحمراء لتوسيع وريد الذيل للحقن في الوريد.
  2. نضح 100 ميكرولتر من معلق الخلية يحتوي على 1 × 106 خلايا SM أعدت في الخطوة 1.17 مع حقنة الأنسولين.
    ملاحظة: يجب تعديل حجم الحقن من قبل كل باحث ويجب ألا يتجاوز الحد الأقصى لحجم الحقن المسموح به بموجب القانون المؤسسي والمحلي.
  3. ثبت الفئران في مكانها باستخدام مثبت الماوس ، وقم بتصويب الذيل ، وامسح الذيل بنسبة 75٪ من الإيثانول باستخدام كرة قطنية لجعل وريد الذيل مرئيا.
  4. أدخل إبرة حقنة الأنسولين في الوريد الخلفي وحقن معلقات الخلية بسلاسة وببطء. ثم دع الفئران المتلقية ترتاح طوال الليل.
  5. في اليوم التالي ، قم بتخفيف مخزون فيروس LCMV Armstrong باستخدام وسط RPMI لتحقيق تركيز نهائي قدره 1 × 107 وحدات تشكيل البلاك / مل.
  6. حقن 100 ميكرولتر من محلول LCMV Armstrong المخفف (يحتوي على 1 × 106 وحدات تشكيل البلاك) في الوريد الذيل للفئران المتلقية.
    ملاحظة: يجب على كل باحث توخي الحذر بشأن ما إذا كان العيار المعدي الموصى به مسموحا به بموجب القانون المؤسسي والمحلي.

3. تلطيخ التدفق الخلوي لخلايا SM TFH المتمايزة في وقت مبكر

  1. التضحية بالفئران (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) من الخطوة 2.6 في اليوم الثالث بعد الإصابة ، ومعالجة الخلايا الليمفاوية من الطحال كما هو موضح في الخطوة 1. اضبط كثافة الخلية على حوالي 2 × 107 خلايا لكل مل.
  2. قم بتحميل 50 ميكرولتر من معلقات الخلايا (~ 1 × 106 خلايا) إلى لوحة مستديرة القاع ذات 96 بئرا وقم بتعبئتها ب 150 ميكرولتر من محلول التلوين لكل بئر. الحفاظ على لوحة على الجليد.
  3. قم بإعداد كوكتيل الأجسام المضادة CXCR5 المضاد للفأر المنقى للفأر (أي الجسم المضاد الأساسي CXCR5) بتخفيف 1:50 في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتلطيخ الخلايا TFH لكل عينة في أنبوب. قم بدوامة الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي تماما عند 15000 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية لتجميع الجزيئات. الحفاظ على الأنبوب على الجليد.
  4. أجهزة الطرد المركزي لوحة 96 بئر في 800 × غرام لمدة 1 دقيقة في 4 °C ، وتجاهل طاف عن طريق الصب ، دوامة لفترة وجيزة لوحة ، وإضافة 200 ميكرولتر من العازلة تلطيخ لكل بئر.
  5. كرر الخطوة 3.4 وأعد تعليق الخلايا ب 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي CXCR5 لكل بئر. تخلط جيدا عن طريق ماصة صعودا وهبوطا واحتضان على الجليد لمدة 1 ساعة.
  6. قم بإعداد كوكتيل الأجسام المضادة للفئران للماعز الحيوي (أي الجسم المضاد الثانوي CXCR5) بتخفيف 1: 200 في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتلطيخ الخلايا TFH لكل عينة في أنبوب جديد. دوامة الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي عند 15000 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية لتجميع الجسيمات. الحفاظ على الأنبوب على الجليد.
  7. قم بطرد اللوحة عند 800 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، ودوامة اللوحة لفترة وجيزة ، وأضف 200 ميكرولتر من محلول التلوين لكل بئر.
  8. كرر الخطوة 3.7 مرتين واحتفظ بالطبق على الجليد.
  9. أضف 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي CXCR5 لكل بئر إلى اللوحة. تخلط جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل وتحتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة.
  10. تحضير الستربتافيدين الفلوري المترافق (أي الجسم المضاد الثلاثي CXCR5) بتخفيف 1: 200 في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتلطيخ الخلايا التائيةFH لكل عينة. وفي الوقت نفسه ، أضف أجساما مضادة أخرى ضد علامات السطح (على سبيل المثال ، CD45.1 و CD4 و PD-1 و CD25 والجزيئات الأخرى المهتمة) وبقعة الخلايا الميتة جنبا إلى جنب مع الجسم المضاد الثلاثي CXCR5.
  11. دوامة الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي عند 15000 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية لتجميع الجسيمات. الحفاظ على الأنبوب على الجليد.
  12. قم بطرد اللوحة عند 800 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، ودوامة اللوحة لفترة وجيزة ، وأضف 200 ميكرولتر من محلول التلوين لكل بئر.
  13. كرر الخطوة 3.12 مرتين واحتفظ بالطبق على الجليد.
  14. أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة الثلاثية CXCR5 لكل بئر إلى الطبق. تخلط جيدا عن طريق سحب الماصة لأعلى ولأسفل واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  15. قم بإعداد 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت / النفاذية لكل بئر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  16. قم بطرد اللوحة عند 800 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، ودوامة اللوحة لفترة وجيزة ، وأضف 200 ميكرولتر من محلول التلوين لكل بئر.
  17. كرر الخطوة 3.16 مرتين واحتفظ بالطبق على الجليد في الظلام.
  18. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت / النفاذية في كل بئر. تخلط جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل والحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة (في الظلام).
    ملاحظة: قم بإعداد المخزن المؤقت للنفاذية (1x) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  19. قم بإعداد كوكتيل الأجسام المضادة ضد عوامل النسخ ، بما في ذلك Bcl-6 و TCF-1 و T-bet والجزيئات الأخرى المهتمة ، في 50 ميكرولتر من محلول النفاذية (1x) لكل بئر في أنبوب جديد.
  20. دوامة الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي عند 15000 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية لتجميع الجسيمات.
  21. قم بطرد اللوحة عند 800 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، ودوامة اللوحة لفترة وجيزة ، وأضف 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة لعامل النسخ لكل بئر. تخلط جيدا وتحتضن على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  22. قم بطرد اللوحة عند 800 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، وقم بدامة اللوحة لفترة وجيزة عن طريق الصب ، وأضف 200 ميكرولتر من محلول النفاذية (1x) لكل بئر.
  23. كرر الخطوة 3.22.
  24. أضف 200 ميكرولتر من محلول التلوين إلى كل بئر ، وطرد مركزي للوحة عند 800 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، ودوامة اللوحة لفترة وجيزة.
  25. أعد تعليق حبيبات الخلية في كل بئر باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ ونقل الخلايا إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي لتحليل مقياس التدفق الخلوي الفوري.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن اكتشاف العينات في غضون 3 أيام في ظروف إضافة 200 ميكرولتر من 2٪ PFA في كل أنبوب وتخزينها عند 4 درجات مئوية في الظلام.

4. إنتاج الفيروسات القهقرية

  1. قم بزراعة الخلايا التائية 293 (مع أقل من عشرة ممرات) مع DMEM 10٪ وسط في طبق استزراع 10 سم لمدة 2-3 ممرات.
  2. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 90٪ ، تخلص من الوسط القديم واغسل الخلايا برفق باستخدام PBS مرتين ، متبوعا بالتريبسين القصير لخلايا 293T باستخدام 1 مل من 0.25٪ Trypsin-EDTA في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
  3. أوقف عملية الهضم عن طريق تعليق الخلايا في 2 مل من وسط DMEM المسخن مسبقا بنسبة 10٪ ، ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، والطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق سحب وسائط الاستزراع لأعلى ولأسفل باستخدام 2 مل من وسط DMEM المسخن مسبقا بنسبة 10٪.
  5. حدد عدد الخلايا واللوحة 5 × 105 خلايا في 2.5 مل 10٪ وسط DMEM لكل بئر في لوحة 6 آبار.
    ملاحظة: قم بتدوير الطبق برفق للسماح للخلايا 293T بالانتشار بالتساوي في جميع أنحاء الطبق.
  6. عندما يتجاوز التقاء الخلايا التائية 293 80٪ ، قم بإعداد كواشف النقل كما هو موضح في الخطوات من 4.7 إلى 4.9.
  7. لكل بئر من صفيحة 6 آبار ، أضف 250 ميكرولتر من وسط Opti-MEM المسخن مسبقا في أنبوب معقم سعة 1.5 مل. بعد ذلك ، أضف 3 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد (يحتوي على 2 ميكروغرام من ناقل الفيروسات القهقرية و 1 ميكروغرام من pCL-Eco) إلى وسط Opti-MEM ، متبوعا بسحب لطيف لأعلى ولأسفل لضمان الخلط الكامل.
    ملاحظة: النواقل الفيروسية القهقرية المستخدمة كأمثلة في هذه الدراسة هي MigR1 وناقل MigR1 المعدل مع منطقة Bcl6 CDS في المنبع من IRES-GFP (MigR1-Bcl6).
  8. بعد ذلك ، أضف 7.5 ميكرولتر من كاشف النقل المسخن مسبقا (الذي تم الحصول عليه تجاريا) إلى الخليط وماصة بلطف لأعلى ولأسفل لضمان الخلط الشامل.
  9. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  10. قم بتوزيع الخليط بالتنقيط في مناطق مميزة من بئر 293T المستزرع بالخلايا ، متبوعا بهز وعاء المزرعة برفق في حركة ذهابا وإيابا ومن جانب إلى جانب لضمان التوزيع المتساوي للخليط.
  11. احتضان الخلايا التائية 293 لمدة 72 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ CO2.
  12. الكشف عن علامة ناقل الفيروسات القهقرية كوكيل لفعالية النقل في الخلايا التائية 293 المنقولة باستخدام مجهر مضان أو قياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: على سبيل المثال ، أكدنا إشارة مضان GFP في نسبة كبيرة من خلايا 293T المنقولة بناقل MigR1 ، مما يشير إلى نقل عالي الجودة.
  13. جمع وسط زراعة الخلايا وأجهزة الطرد المركزي على حرارة 2500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للتخلص من الحطام الخلوي. يجب جمع المادة الطافية الناتجة بعناية وتخزينها إما للحفظ على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية أو الاحتفاظ بها مؤقتا عند 4 درجات مئوية.

5. التنشيط في الجسم الحي ، ونقل الفيروسات القهقرية والنقل بالتبني لخلايا SM CD4 + T

  1. حقن ماوس CD45.1+ SM واحد (من 6 إلى 8 أسابيع) عن طريق الوريد مع 200 ميكروغرام من الببتيد LCMV GP61-77 11,14 في حجم 100 ميكرولتر من وسط RPMI.
    ملاحظة: يجب تعديل حجم الحقن من قبل كل باحث وألا يتجاوز الحد الأقصى لحجم الحقن المسموح به من قبل المؤسسة والقانون المحلي.
  2. القتل الرحيم للفأر SM في 16-18 ساعة بعد حقن الببتيد (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). الحصول على الخلايا الطحالية باتباع الإجراءات المذكورة أعلاه في الخطوة 1.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام طريقة التحفيز المضادة ل CD3 / المضادة ل CD28 في المختبر 27،28 لتنشيط خلايا SM CD4 + T بدلا من تحفيز الببتيد في الجسم الحي الموصوف في الخطوتين 5.1 و 5.2.
  3. تعليق الخلايا الطحالية مع 2٪ RPMI وضبط كثافة الخلية إلى ما يقرب من 1 × 108 خلايا لكل مل في أنبوب مخروطي 15 مل. الحفاظ على الأنبوب على الجليد.
  4. قم بتوزيع 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في صفيحة مستديرة القاع ذات 96 بئرا وتكملها ب 150 ميكرولتر من محلول التلوين لكل بئر.
  5. أجهزة الطرد المركزي لوحة 96 بئر في 800 × غرام لمدة 1 دقيقة في 4 °C لحبيبات الخلايا, إزالة بعناية طاف عن طريق صب, دوامة لفترة وجيزة لوحة, وإضافة 200 ميكرولتر من العازلة تلطيخ لكل بئر.
  6. كرر الخطوة 5.5 وأعد تعليق الخلايا ب 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة السطحية ، بما في ذلك CD4 و CD25 و CD69 ، لاكتشاف حالة تنشيط خلايا SM CD4 + T. اخلطيها جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل واحتضانها على الثلج لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  7. قم بتعبئة كل بئر بمخزن تلطيخ إلى 200 ميكرولتر ، متبوعا بالطرد المركزي للوحة عند 800 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ودوامة اللوحة لفترة وجيزة.
  8. كرر الخطوة 5.7 مرتين.
  9. إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت تلطيخ ونقلها إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي.
  10. قم بتحليل الخلايا الملطخة بالأجسام المضادة المترافقة مع قياس التدفق الخلوي لتقييم حالة تنشيط خلايا SM CD4 + T.
    ملاحظة: أظهرت خلايا SM CD4 + T المنشطة تعبيرات CD25 و CD69 وفيرة مقارنة بالخلايا الساذجة ، مما يتيح إجراءات النقل اللاحقة.
  11. أضف 1 × 106 خلايا SM CD4 + T (من الخطوة 5.3) لكل بئر في لوحة 24 بئرا. قم بتدوير الخلايا على حرارة 800 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم قم بإزالة الوسط بعناية عن طريق الصب.
  12. أضف 1 مل من وسط الفيروس القهقري كما هو موضح في الخطوة 4.13 و 8 ميكروغرام من البوليبرين إلى كل بئر.
  13. قم بتدوير الخلايا عند 800 × جم لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  14. تخلص بعناية من وسط الفيروس القهقري عن طريق سحب الماصة وأضف 1 مل من 10٪ RPMI المسخن مسبقا المكمل ب 10 نانوغرام / مل من الفئران المؤتلفة IL-2 إلى كل بئر.
  15. احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ CO2.
  16. انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وقم بتدوير الخلايا لأسفل عند 800 × جم لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  17. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الصب وأعد تعليق الخلايا بحجم مناسب قدره 2٪ RPMI لعمل كثافة خلية تبلغ 1 × 108 خلايا لكل مل في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. الحفاظ على الأنبوب على الجليد.
  18. قم بتوزيع 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في صفيحة مستديرة القاع ذات 96 بئرا وتكملها ب 150 ميكرولتر من محلول التلوين لكل بئر.
  19. أجهزة الطرد المركزي لوحة 96 بئر في 800 × غرام لمدة 1 دقيقة في 4 °C لحبيبات الخلايا, إزالة بعناية طاف عن طريق صب, دوامة لفترة وجيزة لوحة, وإضافة 200 ميكرولتر من العازلة تلطيخ لكل بئر.
  20. كرر الخطوة 5.19 وأعد تعليق الخلايا ب 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة السطحية ، بما في ذلك CD4 و Vα2 والجسم المضاد المرتبط بعلامة المتجه. اخلطيها جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل واحتضانها على الثلج لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  21. قم بتعبئة كل بئر بمخزن تلطيخ إلى 200 ميكرولتر ، متبوعا بالطرد المركزي للوحة عند 800 × جم لمدة 1 دقيقة. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ودوامة اللوحة لفترة وجيزة.
  22. كرر الخطوة 5.21 مرتين.
  23. إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت تلطيخ ونقلها إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي.
  24. تحليل الخلايا الملطخة بالأجسام المضادة المترافقة مع قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة النقل في خلايا SM CD4 + T.
    ملاحظة: أظهرت خلايا SM CD4 + T التي تم تحويلها بكفاءة تعبيرا عاليا عن علامة الفيروس القهقري ، مثل GFP ، في الدراسة.
  25. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية من الخطوة 5.17 عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية عن طريق الصب. أعد تعليق حبيبات الخلية باستخدام RPMI واضبط كثافة الخلية على 1 × 107 خلايا CD4 + Vα2 + SM / مل.
  26. نقل إجمالي عدد الخلايا التائية 1 × 106 CD45.1+ SM CD4+ T إلى كل ماوس مستلم C57BL / 6 (من عمر 6 إلى 8 أسابيع) عن طريق الحقن في الوريد بمقدار 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في الخطوة 5.25.
  27. في اليوم التالي ، تصيب الفئران المتلقية C57BL / 6 ب 1 × 106 وحدات تشكيل البلاك LCMV Armstrong عن طريق الحقن في الوريد.

6. تحليل التدفق الخلوي لخلايا SM TFH المستحثة بالفيروس القهقري في مرحلة الإصابة الحادة المبكرة ب LCMV

  1. الحصول على الخلايا الطحالية من الفئران C57BL / 6 من الخطوة 5.25 في اليوم 3 بعد العدوى.
  2. قم بإجراء تلطيخ قياس التدفق الخلوي للعلامات السطحية ، بما في ذلك CD4 و CD45.1 و CXCR5 و CD25 والجزيئات الأخرى المهتمة ، في الخلايا الطحالية كما هو موضح في الخطوة 3.
  3. للكشف عن عوامل النسخ في خلايا SM CD4 + T المنقولة بالفيروس القهقري الموسوم ببروتينات الفلورسنت ، أضف 200 ميكرولتر من 2٪ PFA إلى كل بئر واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام.
  4. إجراء التثبيت / النفاذية ، وتلطيخ قياس التدفق الخلوي لعوامل النسخ المهتمة ، وإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي كما هو موضح في الخطوة 3.

النتائج

خصائص خلايا TFH الخاصة بالفيروس المتمايزة مبكرا أثناء عدوى LCMV الحادة
للتحقق من التزام المصير المبكر لخلايا TFH الخاصة بالفيروس ، تم نقل خلايا SM CD4 + T الساذجة التي تتعرف على وجه التحديد على خاتمة LCMV GP I-AbGP66-77 بالتبني إلى مستلمي CD45.2 + C57BL / 6. في اليوم ا...

Discussion

تم تسليط الضوء على البحث في مجال الخلاياالتائية FH منذ اكتشاف الوظيفة المتخصصة للخلاياالتائية FH في مساعدة الخلايا البائية. أشارت الدراسات المتراكمة إلى أن تمايز الخلايا التائيةFH هو عملية متعددة المراحل ومتعددة العوامل30 ، حيث يتم تحديد التزام مصير الخلايا ا...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 32300785 إلى X.C.) ، وبرنامج ما بعد الدكتوراه الوطني الصيني للمواهب المبتكرة (No. BX20230449 إلى X.C.) ، والمشروع الوطني الرئيسي للعلوم والتكنولوجيا (رقم 2021YFC2300602 إلى L.Y.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTACorning25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFABeyotimeP0099-500mL
70 μm cell strainerMerckCLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)Biolegend1278121:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)Biolegend1107241:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)Biolegend1019101:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouseThe Jackson Laboratory002014
BeaverBeads StreptavidinBeaver22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)Biolegend1231061:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)Biolegend1173041:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)Biolegend1155041:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)Biolegend1007041:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)Biolegend1087041:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)Biolegend1162041:200 dilution
bovine serum albumin, BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)Biolegend6448161:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)Biolegend1352201:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouseThe Jackson Laboratory000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouseIn house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% mediumDMEM medium containing 10% FBS
DMEM mediumGibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
Fetal bovine serum, FBSSigmaF8318
FlowJo (version 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SetInvitrogen00-5523-00The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), BiotinylatedVector laboratoriesBA-9400-1.51:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging SystemThermoFisher Scientific
Isolation bufferFACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitationLife TechnologiesL101991:200 dilution
MigR1addgene#27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM mediumGibco31985070
pCL-Ecoaddgene#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)Biolegend1045081:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)BD Biosciences5615221:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)BD Biosciences5519611:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)Biolegend1005381:200 dilution
recombinant murine IL-2Gibco212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis BufferBeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 mediumSigmaR8758
RPMI 2%RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouseSM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining bufferPBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7eBioscience25-4317-821:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) Cell signaling technology6444S1:400 dilution
TFH cell staining bufferFACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagentMirus BioMIRUMIR2700

References

  1. O'shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
  2. Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
  3. Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. Follicular helper t cells. Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).
  4. Choi, Y. S., et al. ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6. Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).
  5. Choi, Y. S., et al. Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory. J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).
  6. Johnston, R. J., et al. Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
  7. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
  8. Yu, D., et al. The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
  9. Choi, Y. S., et al. LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6. Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).
  10. Wu, T., et al. TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection. Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).
  11. Xu, L., et al. The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection. Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).
  12. Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile. Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).
  13. Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation. J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).
  14. Chen, X., et al. The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection. Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).
  15. Li, F., et al. Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF. Nat Commun. 9 (1), 5452 (2018).
  16. Yao, Y., et al. METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation. Nat Commun. 12 (1), 1333 (2021).
  17. Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation. J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).
  18. Lee, J. Y., et al. The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation. Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).
  19. Xiao, N., et al. The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells. Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).
  20. Baumjohann, D., et al. The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression. Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).
  21. Wang, Y., et al. The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis. Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).
  22. Hale, J. S., et al. Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection. Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).
  23. Yao, Y., et al. Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis. Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).
  24. Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection. Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).
  25. Grosjean, C., et al. Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays. STAR Protoc. 2 (4), 100961 (2021).
  26. Dowling, P., et al. Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen. STAR Protoc. 1 (3), 100196 (2020).
  27. Choi, Y. S., Crotty, S. Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells. Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).
  28. Wu, D., et al. A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells. J Immunol Methods. 488, 112931 (2021).
  29. He, R., et al. Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection. Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).
  30. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).
  31. Breitfeld, D., et al. Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production. J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).
  32. Xu, L., et al. The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells. Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).
  33. Chen, X., et al. The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells. Nat Commun. 13 (1), 2762 (2022).
  34. Chen, J. S., et al. Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human. J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

TFH TFH LCMV SMARTA TCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved