الوصول إلى التمايز المبكر للخلية التائية المساعدة المسامية CD4 + الخاصة بالفيروس في الفئران المصابة بفيروس LCMV الحاد

Summary

تعرض الدراسة الحالية بروتوكولات لتقييم الالتزام المبكر بالمصير لخلايا T_FH الخاصة بالفيروس والتلاعب بالتعبير الجيني في هذه الخلايا.

Abstract

ينظر إلى الخلايا التائية المساعدة المسامية (T_FH) على أنها سلالة خلايا CD4 ⁺ T مستقلة تساعد الخلايا البائية المشابهة في إنتاج أجسام مضادة عالية التقارب ، وبالتالي إنشاء مناعة خلطية طويلة المدى. أثناء العدوى الفيروسية الحادة ، يتم تحديد التزام مصير الخلايا_{التائية FH} الخاصة بالفيروس في مرحلة العدوى المبكرة ، والتحقيقات_{في الخلايا} التائية FH المتمايزة المبكرة أمر بالغ الأهمية في فهم المناعة الخلطية المعتمدة على الخلايا التائية وتحسين تصميم اللقاح. في الدراسة ، باستخدام نموذج فأر لعدوى فيروس التهاب المشيمة اللمفاوي الحاد (LCMV) وفأر SMARTA (SM) المعدل وراثيا TCR مع خلايا CD4 ⁺ T التي تتعرف على وجه التحديد على خاتمة البروتين السكري LCMV I-A^bGP_66-77 ، وصفنا إجراءات للوصول إلى التزام المصير المبكر لخلايا_{T FH} الخاصة بالفيروس بناء على تلطيخ قياس التدفق الخلوي. علاوة على ذلك ، من خلال استغلال نقل الفيروسات القهقرية لخلايا SM CD4 ⁺ T ، يتم أيضا توفير طرق لمعالجة التعبير الجيني_{في خلايا T} FH الخاصة بالفيروس المتمايزة مبكرا. ومن ثم ، ستساعد هذه الطرق في الدراسات التي تستكشف الآلية (الآليات) الكامنة وراء الالتزام المبكر لخلايا_{T FH} الخاصة بالفيروس.

Introduction

في مواجهة مسببات الأمراض أو التهديدات المختلفة ، تصمم الخلايا التائية CD4 ⁺ T الساذجة استجاباتها المناعية من خلال التمايز إلى مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا التائية المساعدة (T_H) ذات وظائف متخصصة¹. في سيناريو العدوى الفيروسية الحادة ، يتمايز جزء كبير من الخلايا التائية CD4 ⁺ الساذجة إلى خلايا T (_{T FH}) المساعدة المسامية التي توفر المساعدة للخلايا البائية ^2,3. تختلف الخلايا T_FH عن المجموعات الفرعية الأخرى لخلايا CD4 ⁺ _{T H} (على سبيل المثال ، خلايا T_H1 و T_H2 و T_H9 و T_H17....

Protocol

أجريت جميع التجارب على باتباع الإجراءات المعتمدة من قبل لجان رعاية واستخدام المؤسسية في الجامعة الطبية العسكرية الثالثة. تم استخدام سلالات الفئران التالية في الدراسة الحالية: الفأر C57BL / 6J (B6) (كلا الجنسين) ، الذين تتراوح أعمارهم بين 6 إلى 8 أسابيع ، ويزن 25-30 جم. CD45.1 ⁺ SM TCR الماوس المعدل وراثيا (B6 CD45.1 × SM TCR المعدلة وراثيا) ، كلا الجنسين ، الذين تتراوح أعمارهم بين 6 إلى 8 أسابيع ، ويزن 25-30 جم ؛ و CXCR5-GFP CD45.1 ⁺ SM TCR الماوس المعدل وراثيا (B6 CD45.1 × SM TCR المعدلة وراثيا × CXCR5-GFP) ، كلا الجنسين ، الذين تتراوح أعمارهم بين 6 إلى 8 أسابيع ، ويزن 25-30 جم. تم إنشاء الأنواع المعدلة وراثيا بعد تقرير نشر سابقا

النتائج

خصائص خلايا T_FH الخاصة بالفيروس المتمايزة مبكرا أثناء عدوى LCMV الحادة
للتحقق من التزام المصير المبكر لخلايا T_FH الخاصة بالفيروس ، تم نقل خلايا SM CD4 ⁺ T الساذجة التي تتعرف على وجه التحديد على خاتمة LCMV GP I-A^bGP_66-77 بالتبني إلى مستلمي CD45.2 ⁺ C57BL / 6. في اليوم ا.......

Discussion

تم تسليط الضوء على البحث في مجال الخلايا_{التائية FH} منذ اكتشاف الوظيفة المتخصصة للخلايا_{التائية FH} في مساعدة الخلايا البائية. أشارت الدراسات المتراكمة إلى أن تمايز الخلايا التائية_FH هو عملية متعددة المراحل ومتعددة العوامل³⁰ ، حيث يتم تحديد التزام مصير الخلايا ا.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Corning	25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA	Beyotime	P0099-500mL
70 μm cell strainer	Merck	CLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)	Biolegend	127812	1:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)	Biolegend	110724	1:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)	Biolegend	101910	1:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse	The Jackson Laboratory	002014
BeaverBeads Streptavidin	Beaver	22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)	Biolegend	123106	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)	Biolegend	117304	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)	Biolegend	115504	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)	Biolegend	108704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)	Biolegend	116204	1:200 dilution
bovine serum albumin, BSA	Sigma	A7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)	Biolegend	644816	1:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)	Biolegend	135220	1:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouse	The Jackson Laboratory	000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouse			In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% medium			DMEM medium containing 10% FBS
DMEM medium	Gibco	11885092
EDTA	Sigma	E9884
FACSFortesa	BD Biosciences
Fetal bovine serum, FBS	Sigma	F8318
FlowJo (version 10.4.0)	BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	Invitrogen	00-5523-00	The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated	Vector laboratories	BA-9400-1.5	1:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific
Isolation buffer			FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)	Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199	1:200 dilution
MigR1	addgene	#27490
NaN3	Sigma	S2002
Opti-MEM medium	Gibco	31985070
pCL-Eco	addgene	#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)	Biolegend	104508	1:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)	BD Biosciences	561522	1:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBS	Gibco	10010072
Polybrene	Solarbio	H8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)	BD Biosciences	551961	1:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)	Biolegend	100538	1:200 dilution
recombinant murine IL-2	Gibco	212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis Buffer	Beyotime	C3702-500mL
RPMI 1640 medium	Sigma	R8758
RPMI 2%			RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouse			SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining buffer			PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7	eBioscience	25-4317-82	1:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)	Cell signaling technology	6444S	1:400 dilution
TFH cell staining buffer			FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagent	Mirus Bio	MIRUMIR2700