Acesso à diferenciação precoce de células T CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

Resumo

O presente estudo apresenta protocolos para avaliar o compromisso de destino precoce de células T_FH específicas do vírus e manipular a expressão gênica nessas células.

Resumo

As células T auxiliares foliculares (T_FH) são percebidas como uma linhagem independente de células T CD4⁺ que auxilia as células B cognatas na produção de anticorpos de alta afinidade, estabelecendo assim imunidade humoral de longo prazo. Durante a infecção viral aguda, o compromisso de destino das células T_FH específicas do vírus é determinado na fase inicial da infecção, e as investigações das células T_FH diferenciadas precocemente são cruciais para entender a imunidade humoral dependente de células T e otimizar o design da vacina. No estudo, usando um modelo de camundongo de infecção pelo vírus da coriomeningite linfocítica aguda (LCMV) e o camundongo SMARTA (SM) transgênico TCR com células T CD4 ⁺ reconhecendo especificamente o epítopo da glicoproteína LCMV^{I-A b}GP_66-77, descrevemos procedimentos para acessar o compromisso de destino precoce de células T_FH específicas do vírus com base em colorações de citometria de fluxo. Além disso, ao explorar a transdução retroviral de células T SM CD4 ⁺ , métodos para manipular a expressão gênica em células T_FH específicas de vírus diferenciados precocemente também são fornecidos. Portanto, esses métodos ajudarão em estudos que exploram o(s) mecanismo(s) subjacente(s) ao comprometimento precoce de células T_FH específicas do vírus.

Introdução

Encontrando diferentes patógenos ou ameaças, as células T CD4 ⁺ virgens adaptam suas respostas imunes diferenciando-se em vários subconjuntos de células T auxiliares (T_H) com funções especializadas¹. No cenário de infecção viral aguda, uma grande parcela de células T CD4⁺ virgens se diferencia em células T auxiliares foliculares (T_FH) que fornecem ajuda às células B ^2,3. Diferente de outros subconjuntos de células T_H CD4 ⁺ (por exemplo, células T_H1, T_H2, T_H9 e T_H17), as células T_FH expressam um nível substancial de CXCR5, que é o receptor de quimiocina para a quimiocina CXCL13 de células B, permitindo que as células T_FH migrem para os folículos das células B. Nos folículos das células B, as células T_FH auxiliam as células B cognatas a iniciar e manter as reações do centro germinativo, permitindo assim a rápida produção de anticorpos de alta afinidade e memória humoral de longo prazo ^2,3.

Após a infecção viral aguda, o comprometimento precoce do destino das células T_FH específicas do vírus ocorre dentro de 72 h ^4,5 e é controlado pelo linfoma de células B repressor transcricional-6 (Bcl-6) ^{5 , 6 , 7 , 8 , que} atua como o "regulador mestre" que governa as decisões de destino das células T_FH. A deficiência de Bcl-6 embota severamente a diferenciação das células T_FH, enquanto a expressão ectópica de Bcl-6 promove substancialmente o compromisso do destino das células T_FH. Além do Bcl-6, várias moléculas estão envolvidas na instrução do comprometimento precoce do destino das células T_FH. Os fatores de transcrição TCF-1 e LEF-1 iniciam a diferenciação de células T_FH por meio da indução de Bcl-6 ^9,10,11. A inibição do Blimp1, tanto por Bcl-6 quanto por TCF-1, é necessária para o comprometimento precoce do destino das células T_FH ^11,12. STAT1 e STAT3 também são necessários para a diferenciação precoce de células T_FH ¹³. Além disso, as modificações epigenéticas pela histona metiltransferase EZH2^14,15 e m6A metiltransferase METTL3¹⁶ ajudam a estabilizar os programas transcricionais de células T_FH (especialmente Bcl6 e Tcf7) e, assim, preparar o compromisso inicial do destino das células T_FH. Embora avanços, incluindo as moléculas acima mencionadas e outras, resumidas em outro lugar³, tenham sido feitos na compreensão dos regulamentos transcricionais e epigenéticos do compromisso inicial do destino das células T_FH, moléculas anteriormente desconhecidas ainda precisam ser aprendidas.

No modelo de camundongo de infecção pelo vírus da coriomeningite linfocítica aguda (LCMV), as células T CD4⁺ SMARTA (SM) congênitas transgênicas TCR transferidas adotivamente, que reconhecem especificamente o epítopo da glicoproteína LCMV^{I-A b}GP_66-77, sofrem diferenciação de células T_FH ou T_H1 durante a infecção viral. Este padrão de diferenciação de bifurcação T_FH /_{T H}1 suporta o avanço do modelo de infecção SM / LCMV aguda no estudo da biologia de células T_FH específicas do vírus. De fato, o modelo de infecção SM/LCMV agudo tem sido amplamente utilizado no campo de pesquisa de células T_FH e desempenhou um papel crucial nas descobertas marcantes na biologia celular T_FH. Isso inclui a identificação do Bcl-6 mencionado acima como o fator de transcrição definidor de linhagem de células T_FH ^5,6, bem como outros fatores transcricionais importantes (por exemplo, Blimp-1⁶, TCF-1 / LEF ^9,10,11, STAT1 / STAT3¹³, STAT5¹⁷, KLF2¹⁸ e Itch¹⁹) orientando a diferenciação de células T_FH, regulações pós-transcricionais ( por exemplo, METTL3¹⁶ e miR-17 ~ 92²⁰) da diferenciação de células T_FH, memória e plasticidade de células T_FH ^21,22 e estratégias racionais de vacinação direcionadas às células T_FH (por exemplo, selênio²³).

O presente estudo descreve métodos reprodutíveis para acessar o compromisso de destino precoce de células T_FH específicas do vírus, incluindo (1) estabelecer um modelo de camundongo quimera SM infectado com LCMV agudo adequado para acessar células T_FH diferenciadas precocemente, (2) realizar colorações de citometria de fluxo de moléculas relacionadas a células T_FH diferenciadas precocemente e (3) realizar manipulação de genes baseada em vetor retroviral em SM CD4 ⁺ Células T. Esses métodos serão úteis para estudos que investigam o compromisso de destino precoce de células T_FH específicas do vírus.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos seguindo procedimentos aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Terceira Universidade Médica Militar. As seguintes linhagens de camundongos foram utilizadas no presente estudo: camundongo C57BL/6J (B6) (ambos os sexos), com idade entre 6 e 8 semanas, pesando 25-30 g; camundongo transgênico CD45.1⁺SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgênico), ambos os sexos, com idade entre 6 e 8 semanas, pesando 25-30 g; e camundongo transgênico CXCR5-GFP CD45.1⁺SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgênico × CXCR5-GFP knock-in), ambos os sexos, com idade entre 6 e 8 semanas, pesando 25-30 g. As espécies transgênicas foram geradas após um relatório publicado anteriormente²⁴. Os detalhes dos reagentes, tampões e equipamentos usados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Colheita de células T CD45.1+ SM CD4⁺ para transferência adotiva

1. Eutanasiar (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) o número necessário de camundongos SM CD45.1⁺ TCR-transgênicos de 6 a 8 semanas de idade²⁴. Faça uma incisão de 1 polegada à esquerda da parede peritoneal dos camundongos eutanasiados com tesoura cirúrgica, disseque os baços do peritônio e rasgue o tecido conjuntivo atrás do baço^25,26.
2. Coloque cada baço em um filtro de células de 70 μm dentro de uma placa de Petri (60 mm × 15 mm) e triture o baço com 3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) usando um êmbolo de seringa de 1 mL.
   NOTA: Use o lado redondo do êmbolo da seringa para triturar o baço até que apenas o tecido conjuntivo permaneça.
3. Adicione 6 mL de RPMI + 2% de FBS (RPMI 2%) em cada prato para diluir 3 mL de tampão de lise de hemácias. Pipetar as suspensões celulares para um tubo cónico de 15 ml a partir da placa. Enxágue o prato com mais 3 mL de 2% RPMI e transfira para o mesmo tubo cônico.
4. Centrifugar as suspensões celulares a 800 × g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante por decantação. Ressuspenda as células com um tampão de isolamento e ajuste a densidade celular para ~ 1 × 10⁸ células por mL. Coloque o tubo no gelo.
5. Prepare um coquetel de anticorpos biotinilados 1x contra CD8a, CD19, NK1.1, F4/80, CD11c e Ter119 em tampão isolado para o enriquecimento de células T CD4⁺ .
   NOTA: Adicione anticorpos biotinilados ao tampão de isolamento na diluição indicada, conforme mencionado na Tabela de Materiais. Manter o volume do cocktail de anticorpos igual ao do tampão de isolamento indicado no passo 1.4.
6. Centrifugar as suspensões celulares a 800 × g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante por decantação.
7. Ressuspenda o pellet celular com o coquetel de anticorpos biotinilados 1x indicado no tubo cônico.
8. Coloque o tubo cônico no gelo em uma coqueteleira por 30 min a 45 rpm.
9. Durante a incubação com anticorpos biotinilados, prepare o volume necessário de esferas revestidas de estreptavidina de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: Os esplenócitos totais de um camundongo virgens precisam de 200 μL de esferas revestidas com estreptavidina.
10. Lave as células centrifugando a 800 x g com 8-10 ml de tampão de isolamento durante 5 min a 4 °C e elimine o sobrenadante. Repita esta etapa por mais duas vezes.
11. Ressuspenda o pellet celular com esferas revestidas de estreptavidina preparadas.
12. Coloque o tubo no gelo em uma coqueteleira por 40 min a 45 rpm.
13. Em seguida, coloque o tubo em um suporte magnético por 3-4 min até que todas as contas estejam montadas no lado magnético.
14. Recolha cuidadosamente o sobrenadante e transfira-o para um novo tubo cónico de 15 ml.
15. Centrifugar as suspensões celulares a 800 × g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante por decantação.
    NOTA: Existem outros kits comerciais disponíveis para enriquecimento de células T CD4⁺ , que podem ser usados como substitutos para o procedimento de enriquecimento de células T CD4⁺ descrito nas etapas 1.5-1.15.
16. Ressuspenda o pellet celular com 2-3 mL de 2% de RPMI. Aspirar 50 μL de suspensão celular para análise de citometria de fluxo da eficiência do enriquecimento de células T CD4⁺ (CD4 e Vα2) e viabilidade celular.
17. Centrifugar as suspensões celulares a 800 × g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante por decantação. Ressuspenda o pellet celular com RPMI e ajuste a densidade celular para 1 ×^{10 7} células CD4 ⁺ Vα2 ⁺ SM por mL. Coloque o tubo no gelo e avance para a transferência de células adotivas na próxima etapa.

2. Estabelecendo o modelo de camundongo quimera SM infectado por LCMV agudo para acessar células T FH SM diferenciadas precocemente

1. Aqueça os camundongos receptores C57BL / 6 de 6 a 8 semanas de idade com uma lâmpada infravermelha para dilatar a veia da cauda para injeção intravenosa.
2. Aspirar 100 μL de suspensão celular contendo 1 × 10⁶ células SM preparadas na etapa 1.17 com uma seringa de insulina.
   NOTA: O volume de injeção deve ser modificado por cada pesquisador e não deve exceder o volume máximo de injeção permitido pela legislação institucional e local.
3. Segure os ratos no lugar com um fixador de rato, endireite a cauda e limpe a cauda com etanol a 75% usando uma bola de algodão para tornar a veia da cauda visível.
4. Insira a agulha da seringa de insulina na veia da cauda e injete as suspensões celulares de forma suave e lenta. Em seguida, deixe os ratos receptores descansarem durante a noite.
5. No dia seguinte, diluir o estoque de vírus LCMV Armstrong com meio RPMI para atingir uma concentração final de 1 × 10⁷ unidades formadoras de placas/mL.
6. Injectar 100 μL de solução diluída de LCMV Armstrong (contendo 1 × 10⁶ unidades formadoras de placas) na veia da cauda dos ratinhos receptores.
   NOTA: Cada pesquisador deve ser cauteloso sobre se o título infeccioso recomendado é permitido pela legislação institucional e local.

3. Colorações de citometria de fluxo de células T T_FH SM diferenciadas precocemente

1. Sacrifique os camundongos (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente) da etapa 2.6 no dia 3 após a infecção e processe os linfócitos dos baços conforme descrito na etapa 1. Ajuste a densidade celular para aproximadamente 2 × 10⁷ células por mL.
2. Carregue 50 μL de suspensões celulares (~ 1 × 10⁶ células) em uma placa de fundo redondo de 96 poços e complete com 150 μL de tampão de coloração por poço. Mantenha o prato no gelo.
3. Prepare o coquetel de anticorpos anti-camundongo CXCR5 purificado de rato (ou seja, anticorpo primário CXCR5) em uma diluição de 1:50 em 50 μL de tampão de coloração de células T_FH para cada amostra em um tubo. Vortex completo do tubo e centrifugue-o a 15.000 × g por 3 min a 4 ° C para agregar as partículas. Mantenha o tubo no gelo.
4. Centrifugar a placa de 96 poços a 800 × g durante 1 min a 4 °C, rejeitar o sobrenadante por decantação, submeter brevemente o vórtice da placa e adicionar 200 μL de tampão de coloração por alvéolo.
5. Repita a etapa 3.4 e ressuspenda as células com 50 μL do anticorpo primário CXCR5 por poço. Misture bem pipetando para cima e para baixo e incube no gelo por 1 h.
6. Prepare o coquetel de anticorpos anti-rato de cabra biotinilada (ou seja, anticorpo secundário CXCR5) em uma diluição de 1:200 em 50 μL de tampão de coloração de células T_FH para cada amostra em um novo tubo. Vortex o tubo e centrifugue-o a 15.000 × g por 3 min a 4 ° C para agregar as partículas. Mantenha o tubo no gelo.
7. Centrifugar a placa a 800 × g durante 1 min a 4 °C, rejeitar o sobrenadante por decantação, submeter brevemente o vórtice da placa e adicionar 200 μL de tampão de coloração por alvéolo.
8. Repita a etapa 3.7 duas vezes e mantenha o prato no gelo.
9. Adicione 50 μL de anticorpo secundário CXCR5 por alvéolo à placa. Misture bem pipetando para cima e para baixo e incube no gelo por 30 min.
10. Prepare estreptavidina conjugada com fluorescência (ou seja, anticorpo terciário CXCR5) em uma diluição de 1:200 em 50 μL de tampão de coloração de células T_FH para cada amostra. Enquanto isso, adicione outros anticorpos contra marcadores de superfície (por exemplo, CD45.1, CD4, PD-1, CD25 e outras moléculas interessadas) e a coloração de células mortas junto com o anticorpo terciário CXCR5.
11. Vortex o tubo e centrifugue-o a 15.000 × g por 3 min a 4 ° C para agregar as partículas. Mantenha o tubo no gelo.
12. Centrifugar a placa a 800 × g durante 1 min a 4 °C, rejeitar o sobrenadante por decantação, submeter brevemente o vórtice da placa e adicionar 200 μL de tampão de coloração por alvéolo.
13. Repita a etapa 3.12 duas vezes e mantenha o prato no gelo.
14. Adicione 50 μL de coquetel de anticorpos terciários CXCR5 por alvéolo à placa. Misture bem pipetando para cima e para baixo e incube no gelo por 30 minutos no escuro.
15. Prepare 200 μL de tampão de fixação/permeabilização para cada poço de acordo com as instruções do fabricante.
16. Centrifugar a placa a 800 × g durante 1 min a 4 °C, rejeitar o sobrenadante por decantação, submeter brevemente o vórtice da placa e adicionar 200 μL de tampão de coloração por alvéolo.
17. Repita a etapa 3.16 duas vezes e mantenha o prato no gelo no escuro.
18. Adicione 200 μL de tampão de fixação/permeabilização em cada poço. Misture bem pipetando para cima e para baixo e incubando em temperatura ambiente por 30 min (no escuro).
    NOTA: Prepare o tampão de permeabilização (1x) de acordo com as instruções do fabricante.
19. Prepare o coquetel de anticorpos contra fatores transcricionais, incluindo Bcl-6, TCF-1, T-bet e outras moléculas interessadas, em 50 μL de tampão de permeabilização (1x) para cada poço em um novo tubo.
20. Vortex o tubo e centrifugue a 15.000 x g por 3 min a 4 ° C para agregar as partículas.
21. Centrifugar a placa a 800 × g durante 1 min a 4 °C, rejeitar o sobrenadante por decantação, vórtice breve da placa e adicionar 50 μl de cocktail de anticorpos do factor de transcrição por alvéolo. Misture bem e incube no gelo por 30 min no escuro.
22. Centrifugar a placa a 800 × g durante 1 min a 4 °C, rejeitar o sobrenadante, submeter brevemente o vórtice da placa por decantação e adicionar 200 μL de tampão de permeabilização (1x) por alvéolo.
23. Repita a etapa 3.22.
24. Adicione 200 μL de tampão de coloração em cada poço, centrifugue a placa a 800 × g por 1 min a 4 ° C, descarte o sobrenadante por decantação e subalterne brevemente a placa em vórtice.
25. Ressuspenda o pellet celular em cada poço com 200 μL de tampão de coloração e transfira as células para tubos de citometria de fluxo para análise imediata do citômetro de fluxo.
    NOTA: Alternativamente, as amostras podem ser detectadas dentro de 3 dias nas condições de adicionar 200 μl de PFA a 2% em cada tubo e serem armazenadas a 4 ° C no escuro.

4. Produção de retrovírus

1. Cultive as células 293T (com menos de dez passagens) com meio DMEM 10% em uma placa de cultura de 10 cm por uma duração de 2-3 passagens.
2. Quando as células atingirem 90% de confluência, descarte o meio antigo e lave suavemente as células com PBS duas vezes, seguido de breve tripsinização das células 293T usando 1 mL de tripsina-EDTA a 0,25% em temperatura ambiente por 1 min.
3. Pare o processo de digestão ressuspendendo as células em 2 mL de meio DMEM a 10% pré-aquecido, transferindo-as para um tubo cônico de 15 mL e centrifugando a 200 × g por 5 min a 4 ° C.
4. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular pipetando para cima e para baixo os meios de cultura com 2 mL de meio DMEM a 10% pré-aquecido.
5. Quantifique o número de células e a placa 5 × 10⁵ células em 2,5 mL de meio DMEM a 10% por poço em uma placa de 6 poços.
   NOTA: Gire o prato suavemente para permitir que as células 293T se espalhem uniformemente por todo o prato.
6. Quando a confluência de células 293T exceder 80%, prepare os reagentes de transfecção conforme descrito nas etapas 4.7 a 4.9.
7. Para cada poço de uma placa de 6 poços, adicione 250 μL de meio Opti-MEM pré-aquecido em um tubo estéril de 1,5 mL. Em seguida, adicione 3 μg de DNA de plasmídeo (contendo 2 μg de vetor retroviral e 1 μg de pCL-Eco) ao meio Opti-MEM, seguido de pipetagem suave para cima e para baixo para garantir uma mistura completa.
   NOTA: Os vetores retrovirais empregados como exemplos neste estudo são o vetor MigR1 e o vetor MigR1 modificado com região Bcl6 CDS a montante do IRES-GFP (MigR1-Bcl6).
8. Em seguida, adicione 7,5 μL de reagente de transfecção pré-aquecido (obtido comercialmente) à mistura e pipete suavemente para cima e para baixo para garantir uma mistura completa.
9. Incube a mistura em temperatura ambiente por 20 min.
10. Dispense a mistura gota a gota em regiões distintas do poço cultivado em células 293T, seguido de balançar suavemente o recipiente de cultura em um movimento para frente e para trás e de um lado para o outro para garantir uma distribuição uniforme da mistura.
11. Incubar as células 293T durante 72 h numa incubadora a 37 °C contendo 5% de CO₂.
12. Detecte a marca do vetor retroviral como o proxy para a eficácia da transfecção nas células 293T transfectadas usando um microscópio de fluorescência ou citometria de fluxo.
    NOTA: Por exemplo, confirmamos o sinal de fluorescência GFP em uma proporção significativa de células 293T transfectadas por vetor MigR1, sugerindo transfecção de alta qualidade.
13. Colete o meio de cultura celular e centrifugue a 2.500 × g por 10 min a 4 °C para eliminar os detritos celulares. O sobrenadante resultante deve ser cuidadosamente recolhido e armazenado para conservação a longo prazo a -80 °C ou temporariamente mantido a 4 °C.

5. Ativação in vivo, transdução de retrovírus e transferência adotiva de células T SM CD4⁺

1. Injete um camundongo CD45.1⁺ SM (6 a 8 semanas de idade) por via intravenosa com 200 μg de LCMV GP_61-77 peptídeo^11,14 em um volume de 100 μL de meio RPMI.
   NOTA: O volume de injeção deve ser modificado por cada pesquisador e não exceder o volume máximo de injeção permitido pela instituição e pela legislação local.
2. Eutanasiar o camundongo SM 16-18 h após a injeção do peptídeo (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Adquira os esplenócitos seguindo os procedimentos mencionados acima na etapa 1.
   NOTA: Alternativamente, o método de estimulação in vitro anti-CD3 / anti-CD28^27,28 pode ser usado para ativar células T SM CD4 ⁺ no lugar da estimulação peptídica in vivo descrita nas etapas 5.1 e 5.2.
3. Suspenda os esplenócitos com 2% de RPMI e ajuste a densidade celular para aproximadamente 1 × 10⁸ células por mL em um tubo cônico de 15 mL. Mantenha o tubo no gelo.
4. Dispense 50 μL de suspensão celular em uma placa de fundo redondo de 96 poços e complemente com 150 μL de tampão de coloração por poço.
5. Centrifugue a placa de 96 poços a 800 × g por 1 min a 4 ° C para granular as células, remova cuidadosamente o sobrenadante por decantação, subtraia brevemente a placa e adicione 200 μL de tampão de coloração por poço.
6. Repita a etapa 5.5 e ressuspenda as células com 50 μL de coquetel de anticorpos de superfície, incluindo CD4, CD25 e CD69, para detectar o status de ativação das células T SM CD4 ⁺ . Misture bem pipetando para cima e para baixo e incube no gelo por 30 minutos no escuro.
7. Complete cada poço com tampão de coloração a 200 μl, seguido de centrifugação da placa a 800 × g por 1 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante por decantação e vortex breve da placa.
8. Repita a etapa 5.7 duas vezes.
9. Ressuspenda as células em 200 μL de tampão de coloração e transfira-as para um tubo de citometria de fluxo.
10. Analise as células coradas com anticorpos conjugados com fluorescência com uma citometria de fluxo para avaliar o estado de ativação das células T SM CD4⁺ .
    NOTA: As células T SM CD4⁺ ativadas exibiram expressões abundantes de CD25 e CD69 em comparação com as células virgens, permitindo assim procedimentos de transdução subsequentes.
11. Adicione 1 × 10⁶ células T CD4 ⁺ SM (da etapa 5.3) por poço em uma placa de 24 poços. Centrifugar as células a 800 × g durante 3 min a 4 °C e, em seguida, remover cuidadosamente o meio por decantação.
12. Adicione 1 ml de meio retroviral conforme descrito no passo 4.13 e 8 μg de polibreno a cada alvéolo.
13. Transduzir as células a 800 × g durante 2 h a 37 °C.
14. Descarte cuidadosamente o meio retroviral pipetando e adicione 1 mL de RPMI a 10% pré-aquecido suplementado com 10 ng/mL de IL-2 murina recombinante a cada poço.
15. Incubar as células durante 48 h numa incubadora a 37 °C contendo 5% de CO₂.
16. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL e gire as células a 800 × g por 6 min a 4 ° C.
17. Remover o sobrenadante por decantação e ressuspender as células com um volume adequado de 2% RPMI para perfazer uma densidade celular de 1 × 10⁸ células por ml num tubo cónico de 15 ml. Mantenha o tubo no gelo.
18. Dispense 50 μL de suspensão celular em uma placa de fundo redondo de 96 poços e complemente com 150 μL de tampão de coloração por poço.
19. Centrifugue a placa de 96 poços a 800 × g por 1 min a 4 ° C para granular as células, remova cuidadosamente o sobrenadante por decantação, subtraia brevemente a placa e adicione 200 μL de tampão de coloração por poço.
20. Repita a etapa 5.19 e ressuspenda as células com 50 μL de coquetel de anticorpos de superfície, incluindo CD4, Vα2 e anticorpo associado a marcação vetorial. Misture bem pipetando para cima e para baixo e incube no gelo por 30 minutos no escuro.
21. Complete cada poço com tampão de coloração até 200 μL, seguido de centrifugação da placa a 800 × g por 1 min. Descarte o sobrenadante por decantação e vortex breve da placa.
22. Repita a etapa 5.21 duas vezes.
23. Ressuspenda as células em 200 μL de tampão de coloração e transfira-as para um tubo de citometria de fluxo.
24. Analise as células coradas com anticorpos conjugados com fluorescência com citometria de fluxo para avaliar a eficiência da transdução em células T SM CD4⁺ .
    NOTA: As células T SM CD4 ⁺ eficientemente transduzidas exibiram alta expressão da marca de retrovírus, como GFP, no estudo.
25. Centrifugar as suspensões celulares do passo 5.17 a 800 × g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante por decantação. Ressuspenda o pellet celular com RPMI e ajuste a densidade celular para 1 ×^{10 7} células CD4 ⁺ Vα2 ⁺ SM / mL.
26. Transfira adotivamente um número total de 1 ×^{10 6 células} T CD45.1⁺ SM ^CD4+ para cada camundongo receptor C57BL/6 (6 a 8 semanas de idade) por uma injeção intravenosa de 100 μL de suspensão celular na etapa 5.25.
27. No dia seguinte, infecte camundongos receptores C57BL / 6 com 1 × 10⁶ unidades formadoras de placas LCMV Armstrong por meio de injeção intravenosa.

6. Análise por citometria de fluxo de células SM_{T FH} transduzidas por retrovírus no estágio inicial da infecção aguda por LCMV

1. Adquira os esplenócitos de camundongos C57BL/6 da etapa 5.25 no dia 3 após a infecção.
2. Realize a coloração por citometria de fluxo de marcadores de superfície, incluindo CD4, CD45.1, CXCR5, CD25 e outras moléculas interessadas, em esplenócitos, conforme descrito na etapa 3.
3. Para a detecção de fatores transcricionais em células T SM CD4⁺ transduzidas com retrovírus marcados por proteínas fluorescentes, adicione 200 μL de PFA a 2% a cada poço e incube em temperatura ambiente por 20 min no escuro.
4. Realize a fixação/permeabilização, a coloração por citometria de fluxo dos fatores transcricionais interessados e realize a análise de citometria de fluxo conforme descrito na etapa 3.

Resultados

Características das células T_FH específicas do vírus de diferenciação precoce durante a infecção aguda por LCMV
Para investigar o compromisso de destino inicial de células T_FH específicas do vírus, células T SM CD4 ⁺ congênitas virgens que reconhecem especificamente o epítopo LCMV GP IA^{, A,}B GP_66-77, foram transferidas adotivamente para receptores CD45.2 ⁺ C57BL / 6. No dia seguinte, esses receptores foram infectados por v...

Discussão

A pesquisa no campo das células T_FH tem sido destacada desde a descoberta da função especializada das células T_FH em ajudar as células B. Estudos acumulados indicaram que a diferenciação de células T_FH é um processo multiestágio e multifatorial³⁰, em que o compromisso do destino das células T_FH é determinado no estágio inicial⁵. Portanto, uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes às células T_FH d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Corning	25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA	Beyotime	P0099-500mL
70 μm cell strainer	Merck	CLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)	Biolegend	127812	1:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)	Biolegend	110724	1:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)	Biolegend	101910	1:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse	The Jackson Laboratory	002014
BeaverBeads Streptavidin	Beaver	22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)	Biolegend	123106	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)	Biolegend	117304	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)	Biolegend	115504	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)	Biolegend	108704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)	Biolegend	116204	1:200 dilution
bovine serum albumin, BSA	Sigma	A7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)	Biolegend	644816	1:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)	Biolegend	135220	1:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouse	The Jackson Laboratory	000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouse			In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% medium			DMEM medium containing 10% FBS
DMEM medium	Gibco	11885092
EDTA	Sigma	E9884
FACSFortesa	BD Biosciences
Fetal bovine serum, FBS	Sigma	F8318
FlowJo (version 10.4.0)	BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	Invitrogen	00-5523-00	The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated	Vector laboratories	BA-9400-1.5	1:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific
Isolation buffer			FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)	Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199	1:200 dilution
MigR1	addgene	#27490
NaN3	Sigma	S2002
Opti-MEM medium	Gibco	31985070
pCL-Eco	addgene	#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)	Biolegend	104508	1:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)	BD Biosciences	561522	1:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBS	Gibco	10010072
Polybrene	Solarbio	H8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)	BD Biosciences	551961	1:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)	Biolegend	100538	1:200 dilution
recombinant murine IL-2	Gibco	212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis Buffer	Beyotime	C3702-500mL
RPMI 1640 medium	Sigma	R8758
RPMI 2%			RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouse			SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining buffer			PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7	eBioscience	25-4317-82	1:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)	Cell signaling technology	6444S	1:400 dilution
TFH cell staining buffer			FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagent	Mirus Bio	MIRUMIR2700