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Acesso à diferenciação precoce de células T CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo
* Estes autores contribuíram igualmente
Neste Artigo
Resumo
O presente estudo apresenta protocolos para avaliar o compromisso de destino precoce de células TFH específicas do vírus e manipular a expressão gênica nessas células.
Resumo
As células T auxiliares foliculares (TFH) são percebidas como uma linhagem independente de células T CD4+ que auxilia as células B cognatas na produção de anticorpos de alta afinidade, estabelecendo assim imunidade humoral de longo prazo. Durante a infecção viral aguda, o compromisso de destino das células TFH específicas do vírus é determinado na fase inicial da infecção, e as investigações das células TFH diferenciadas precocemente são cruciais para entender a imunidade humoral dependente de células T e otimizar o design da vacina. No estudo, usando um modelo de camundongo de infecção pelo vírus da coriomeningite linfocítica aguda (LCMV) e o camundongo SMARTA (SM) transgênico TCR com células T CD4 + reconhecendo especificamente o epítopo da glicoproteína LCMVI-A bGP66-77, descrevemos procedimentos para acessar o compromisso de destino precoce de células TFH específicas do vírus com base em colorações de citometria de fluxo. Além disso, ao explorar a transdução retroviral de células T SM CD4 + , métodos para manipular a expressão gênica em células TFH específicas de vírus diferenciados precocemente também são fornecidos. Portanto, esses métodos ajudarão em estudos que exploram o(s) mecanismo(s) subjacente(s) ao comprometimento precoce de células TFH específicas do vírus.
Introdução
Encontrando diferentes patógenos ou ameaças, as células T CD4 + virgens adaptam suas respostas imunes diferenciando-se em vários subconjuntos de células T auxiliares (TH) com funções especializadas1. No cenário de infecção viral aguda, uma grande parcela de células T CD4+ virgens se diferencia em células T auxiliares foliculares (TFH) que fornecem ajuda às células B 2,3. Diferente de outros subconjuntos de células TH CD4 + (por exemplo, células TH1, TH2, TH9 e TH17), as células ....
Protocolo
Todos os experimentos com animais foram conduzidos seguindo procedimentos aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Terceira Universidade Médica Militar. As seguintes linhagens de camundongos foram utilizadas no presente estudo: camundongo C57BL/6J (B6) (ambos os sexos), com idade entre 6 e 8 semanas, pesando 25-30 g; camundongo transgênico CD45.1+SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgênico), ambos os sexos, com idade entre 6 e 8 semanas, pesando 25-30 g; e camundongo transgênico CXCR5-GFP CD45.1+SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgênico × CXCR5-GFP knock-in), ambos os sexos, com idade entre 6 e 8 semanas, pesando 25-30 g. As....
Resultados Representativos
Características das células TFH específicas do vírus de diferenciação precoce durante a infecção aguda por LCMV
Para investigar o compromisso de destino inicial de células TFH específicas do vírus, células T SM CD4 + congênitas virgens que reconhecem especificamente o epítopo LCMV GP IA, A,B GP66-77, foram transferidas adotivamente para receptores CD45.2 + C57BL / 6. No dia seguinte, esses receptores foram infectados por v.......
Discussão
A pesquisa no campo das células TFH tem sido destacada desde a descoberta da função especializada das células TFH em ajudar as células B. Estudos acumulados indicaram que a diferenciação de células TFH é um processo multiestágio e multifatorial30, em que o compromisso do destino das células TFH é determinado no estágio inicial5. Portanto, uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes às células TFH d.......
Divulgações
Os autores declaram não haver interesses conflitantes.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado por doações da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 32300785 a X.C.), do Programa Nacional de Pós-Doutorado da China para Talentos Inovadores (nº. BX20230449 a X.C.), e o Projeto Nacional de Ciência e Tecnologia (nº 2021YFC2300602 a L.Y.).
....Materiais
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA | Beyotime | P0099-500mL | |
| 70 μm cell strainer | Merck | CLS431751 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1) | Biolegend | 127812 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20) | Biolegend | 110724 | 1:200 dilution |
| APC anti-mouse CD25 (clone PC61) | Biolegend | 101910 | 1:200 dilution |
| B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BeaverBeads Streptavidin | Beaver | 22321-10 | |
| Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8) | Biolegend | 123106 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418) | Biolegend | 117304 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136) | Biolegend | 108704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119) | Biolegend | 116204 | 1:200 dilution |
| bovine serum albumin, BSA | Sigma | A7906 | |
| Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10) | Biolegend | 644816 | 1:100 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12) | Biolegend | 135220 | 1:200 dilution |
| C57BL/6J (B6) mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CXCR5-GFP knock-in reporter mouse | In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5. | ||
| DMEM 10% medium | DMEM medium containing 10% FBS | ||
| DMEM medium | Gibco | 11885092 | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| FACSFortesa | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum, FBS | Sigma | F8318 | |
| FlowJo (version 10.4.0) | BD Biosciences | ||
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer. |
| Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated | Vector laboratories | BA-9400-1.5 | 1:200 dilution |
| Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | ||
| Isolation buffer | FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA | ||
| LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV) | Chinese Peptide Company | ||
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | 1:200 dilution |
| MigR1 | addgene | #27490 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Opti-MEM medium | Gibco | 31985070 | |
| pCL-Eco | addgene | #12371 | |
| PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3) | Biolegend | 104508 | 1:200 dilution |
| PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91) | BD Biosciences | 561522 | 1:50 dilution |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010072 | |
| Polybrene | Solarbio | H8761 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8) | BD Biosciences | 551961 | 1:50 dilution |
| Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5) | Biolegend | 100538 | 1:200 dilution |
| recombinant murine IL-2 | Gibco | 212-12-1MG | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Beyotime | C3702-500mL | |
| RPMI 1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI 2% | RPMI 1640 medium containing 2% FBS | ||
| SMARTA (SM) TCR transgenic mouse | SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450). | ||
| Staining buffer | PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3 | ||
| Streptavidin PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4317-82 | 1:200 dilution |
| TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) | Cell signaling technology | 6444S | 1:400 dilution |
| TFH cell staining buffer | FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum | ||
| TransIT-293 reagent | Mirus Bio | MIRUMIR2700 |
Referências
- O'shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of di....
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