JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המחקר הנוכחי מציג פרוטוקולים להערכת המחויבות לגורל מוקדם של תאיT FH ספציפיים לווירוס ומניפולציה של ביטוי גנים בתאים אלה.

Abstract

תאי T מסייעים זקיקים (TFH) נתפסים כשושלת תאי CD4+ T עצמאית המסייעת לתאי B קוגניטיביים לייצר נוגדנים בעלי זיקה גבוהה, ובכך לבסס חסינות הומורלית ארוכת טווח. במהלך זיהום ויראלי חריף, מחויבות הגורל של תאי TFH ספציפיים לווירוס נקבעת בשלב ההדבקה המוקדם, וחקירות של תאי TFH ממוינים מוקדם הן חיוניות להבנת חסינות הומורלית תלוית תאי T ואופטימיזציה של תכנון החיסון. במחקר, תוך שימוש במודל עכברי של זיהום בנגיף הלימפוציטיס החריף (LCMV) ועכבר TCR-transgenic SMARTA (SM) עם תאי CD4+ T המזהים באופן ספציפי אפיטופ גליקופרוטאין LCMV I-AbGP66-77, תיארנו נהלים לגישה למחויבות הגורל המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לווירוס בהתבסס על כתמי ציטומטריית זרימה. יתר על כן, על ידי ניצול התמרה רטרו-ויראלית של תאי T מסוג SM CD4+ , ניתנות גם שיטות למניפולציה של ביטוי גנים בתאי TFH ספציפיים לווירוס ממוינים מוקדם. לפיכך, שיטות אלה יסייעו במחקרים הבוחנים את המנגנונים העומדים בבסיס המחויבות המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לנגיף.

Introduction

במפגש עם פתוגנים או איומים שונים, תאי T נאיביים CD4+ מתאימים את התגובה החיסונית שלהם על ידי התמיינות לתת-קבוצות שונות של תאי T מסייעים (TH) עם פונקציות מיוחדות1. בתרחיש של זיהום ויראלי חריף, חלק גדול מתאי T נאיביים CD4+ מתמיינים לתאי T מסייעים פוליקולריים (TFH) המספקים עזרה לתאי B 2,3. בניגוד לתת-קבוצות אחרות של תאי CD4+ TH (למשל, תאי TH1, TH2, TH9 ותאי TH17), תאיT FH מבטאים רמה משמעותית של CXCR5, שהוא קולטן הכימוקין של תאי B המבייתים כימוקין CXCL13, מה שמאפשר לתאיT FH לנדוד לזקיקים של תאי B. בזקיקי תאי B, תאיT FH מסייעים לתאי B קוגניטיביים ליזום ולשמר תגובות של מרכז הנבט, ובכך מאפשרים ייצור מהיר של נוגדנים בעלי זיקה גבוהה וזיכרון הומורלי ארוך טווח 2,3.

עם זיהום ויראלי חריף, מחויבות הגורל המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לווירוס מתרחשת בתוך 72 שעות 4,5 ונשלטת על ידי לימפומה של תאי B מדכאי שעתוק -6 (Bcl-6)5,6,7,8, הפועלת כ"רגולטור הראשי" השולט בהחלטות גורל תאי TFH. מחסור ב-Bcl-6 מקהה באופן חמור את התמיינות תאי TFH, בעוד שביטוי חוץ רחמי של Bcl-6 מקדם באופן משמעותי מחויבות לגורל תאי TFH. בנוסף ל-Bcl-6, מולקולות רבות מעורבות בהנחיית מחויבות מוקדמת לגורל תאי TFH. גורמי שעתוק TCF-1 ו- LEF-1 יוזמים התמיינות תאי TFH באמצעות השראת Bcl-6 9,10,11. עיכוב Blimp1, הן על ידי Bcl-6 והן על ידי TCF-1, נדרש עבור התחייבות מוקדמת לגורל תאי TFH 11,12. STAT1 ו-STAT3 נדרשים גם עבור התמיינות מוקדמת של תאי TFH 13. חוץ מזה, שינויים אפיגנטיים על ידי היסטון methyltransferase EZH214,15 ו m6A methyltransferase METTL316 מסייעים לייצב תוכניות שעתוק תאי TFH (במיוחד Bcl6 ו Tcf7) ובכך ראשוני מוקדם TFH גורל הגורל. בעוד שהתקדמות, כולל המולקולות הנ"ל ואחרות, המסוכמות במקום אחר3, נעשו בהבנת תקנות השעתוק והאפיגנטיקה של מחויבות מוקדמת לגורל תאי TFH, מולקולות שלא היו ידועות קודם לכן נותרו ללמידה.

במודל העכבר של זיהום חריף של וירוס choriomeningitis לימפוציטית חריפה (LCMV), מועבר באופן מאומץ TCR-transgenic SMARTA (SM) CD4+ תאי T, אשר מזהים באופן ספציפי את אפיטופ הגליקופרוטאין LCMV I-AbGP66-77, עוברים התמיינות תאי TFH או TH1 במהלך זיהום ויראלי. דפוס התמיינות התפצלות TFH/TH1 תומך בקידום מודל זיהום SM/LCMV חריף בחקר הביולוגיה של תאי TFH ספציפיים לנגיף. ואכן, מודל זיהום SM/LCMV חריף נמצא בשימוש נרחב בתחום המחקר של תאי TFH ומילא תפקיד מכריע בתגליות אבני דרך בביולוגיה של תאי TFH. זה כולל את זיהוי Bcl-6 הנ"ל כגורם השעתוק המגדיר את השושלת של תאי TFH 5,6, כמו גם גורמי שעתוק חשובים אחרים (למשל, Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 ו- Itch19) המנחים התמיינות תאי TFH, תקנות לאחר שעתוק ( לדוגמה, METTL316 ו- miR-17~9220) של התמיינות תאי TFH, זיכרון תאי TFH ופלסטיות 21,22, ואסטרטגיות חיסון רציונליות המכוונות לתאי TFH (למשל, סלניום23).

המחקר הנוכחי מתאר שיטות ניתנות לשחזור לגישה למחויבות לגורל מוקדם של תאי TFH ספציפיים לנגיף, כולל (1) הקמת מודל עכבר כימרה SM נגוע LCMV חריף המתאים לגישה לתאי TFH ממוינים מוקדמים, (2) ביצוע צביעות ציטומטריה של זרימה של מולקולות הקשורות לתאי TFH ממוינים מוקדם, ו-(3) ביצוע מניפולציה גנטית רטרו-ויראלית מבוססת וקטור ב- SM CD4+ תאי T. שיטות אלה יהיו שימושיות למחקרים החוקרים את המחויבות לגורל מוקדם של תאי TFH ספציפיים לנגיף.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לנהלים שאושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית הצבאית השלישית. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בזני העכברים הבאים: עכבר C57BL/6J (B6) (שני המינים), בגילאי 6 עד 8 שבועות, במשקל 25-30 גרם; CD45.1+SM TCR עכבר מהונדס (B6 CD45.1 × SM TCR מהונדס), שני המינים, בגילאי 6 עד 8 שבועות, במשקל 25-30 גרם; ועכבר מהונדס CXCR5-GFP CD45.1+SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgenic × CXCR5-GFP knock-in), שני המינים, בגילאי 6 עד 8 שבועות, במשקל 25-30 גרם. המינים הטרנסגניים נוצרו בעקבות דו"חשפורסם בעבר 24. פרטי הריאגנטים, המאגרים והציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. קצירת תאי T CD45.1+ SM CD4+ + להעברה מאומצת

  1. המתת חסד (בעקבות פרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות) את המספר הנדרש של עכברי CD45.1+ TCR-Transgenic SM בני 6 עד 8 שבועות24. בצע חתך של 1 אינץ 'בצד שמאל של דופן הצפק של העכברים המורדמים על ידי מספריים כירורגיים, לנתח את הטחול מן הצפק, ולקרוע את רקמת החיבור מאחורי הטחול25,26.
  2. הכניסו כל טחול למסננת תאים של 70 מיקרומטר בתוך צלחת פטרי (60 מ"מ × 15 מ"מ) וטחנו את הטחול עם 3 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים (RBC) באמצעות בוכנה מזרק 1 מ"ל.
    הערה: השתמש בצד העגול של בוכנה מזרק כדי לטחון את הטחול עד רק רקמת חיבור נשאר.
  3. הוסף 6 מ"ל של RPMI + 2% FBS (RPMI 2%) לכל צלחת כדי לדלל 3 מ"ל של חיץ ליזיס RBC. פיפטה התא מתלה לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל מן המנה. שוטפים את הכלי בתוספת 3 מ"ל של 2% סל"ד ומעבירים לאותו צינור חרוט.
  4. צנטריפוגה את מתלי התא ב 800 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant על ידי decantation. השהה מחדש את התאים עם מאגר בידוד והתאם את צפיפות התא ל~ 1 × 108 תאים למ"ל. מניחים את הצינור על קרח.
  5. הכינו קוקטייל נוגדנים 1x biotinylated נגד CD8a, CD19, NK1.1, F4/80, CD11c ו- Ter119 במאגר בידוד להעשרת תאי CD4+ T.
    הערה: הוסף נוגדנים ביוטינילציה למאגר הבידוד בדילול המצוין כמצוין בטבלת החומרים. שמור על נפח קוקטייל הנוגדנים זהה לזה של מאגר הבידוד בשלב 1.4.
  6. צנטריפוגה את מתלי התא ב 800 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant על ידי decantation.
  7. גלולת תא השעיה עם קוקטייל נוגדנים 1x biotinylated מצוין בצינור חרוט.
  8. הניחו את הצינור החרוטי על קרח בשייקר למשך 30 דקות ב-45 סל"ד.
  9. במהלך הדגירה עם נוגדנים biotinylated, להכין את הנפח הנדרש של חרוזים מצופים streptavidin, על פי הוראות היצרן.
    הערה: סך כל הטחול מעכבר נאיבי אחד זקוק ל-200 מיקרוליטר של חרוזים מצופים סטרפטווידין.
  10. לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם עם 8-10 מ"ל של חיץ בידוד במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
  11. גלולת תא להשהות עם חרוזים מצופים סטרפטווידין מוכן.
  12. הניחו את הצינור על קרח בשייקר למשך 40 דקות ב-45 סל"ד.
  13. לאחר מכן, הניחו את הצינור על מעמד מגנטי למשך 3-4 דקות עד שכל החרוזים מורכבים בצד המגנטי.
  14. בזהירות לאסוף את supernatant ולהעביר אותו לתוך צינור חרוטי חדש 15 מ"ל.
  15. צנטריפוגה את מתלי התא ב 800 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant על ידי decantation.
    הערה: קיימות ערכות מסחריות אחרות להעשרת תאי CD4+ T, אשר יכולות לשמש כתחליפים להליך העשרת תאי CD4+ T המתואר בשלבים 1.5-1.15.
  16. להשעות מחדש את גלולת התא עם 2-3 מ"ל של 2% סל"ד. שאפו 50 μL של תרחיף תאים לצורך ניתוח ציטומטריית זרימה של יעילות העשרת תאי CD4+ T (CD4 ו-Vα2) וכדאיות התא.
  17. צנטריפוגה את מתלי התא ב 800 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant על ידי decantation. השהה מחדש את גלולת התא עם RPMI והתאם את צפיפות התא ל- 1 × 107 תאי CD4 + Vα2+ SM למ"ל. הניחו את הצינור על קרח והתקדמו להעברת תאים מאומצת בשלב הבא.

2. ביסוס מודל עכבר SM כימרה נגוע LCMV חריף לגישה לתאי SM TFH ממוינים מוקדמים

  1. חממו את העכברים מושתלי C57BL/6 בני 6 עד 8 שבועות עם מנורת אינפרא אדום כדי להרחיב את וריד הזנב להזרקה תוך ורידית.
  2. שאפו 100 μL של תרחיף תאים המכיל 1 × 106 תאי SM שהוכנו בשלב 1.17 עם מזרק אינסולין.
    הערה: נפח ההזרקה צריך להשתנות על ידי כל חוקר ולא יעלה על נפח ההזרקה המרבי המותר על פי החוק המוסדי והמקומי.
  3. החזיקו את העכברים במקומם בעזרת קיבוע עכבר, יישרו את הזנב ונגבו את הזנב עם 75% אתנול באמצעות כדור צמר גפן כדי להפוך את וריד הזנב לגלוי.
  4. הכנס את מחט מזרק האינסולין לווריד הזנב והזריק את מתלי התאים בצורה חלקה ואיטית. לאחר מכן, הניחו לעכברים המקבלים לנוח למשך הלילה.
  5. למחרת, לדלל את מלאי וירוס ארמסטרונג LCMV עם מדיום RPMI כדי להשיג ריכוז סופי של 1 × 107 יחידות יוצרות פלאק / מ"ל.
  6. הזריקו 100 μL של תמיסת LCMV Armstrong מדוללת (המכילה 1 × 106 יחידות יוצרות פלאק) לווריד הזנב של העכברים המקבלים.
    הערה: כל חוקר צריך להיות זהיר לגבי האם הטיטר הזיהומי המומלץ מותר על פי החוק המוסדי והמקומי.

3. כתמי ציטומטריה של זרימה של תאי SM TFH ממוינים מוקדמים

  1. להקריב את העכברים (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות) משלב 2.6 ביום השלישי לאחר ההדבקה, ולעבד לימפוציטים מטחול כמתואר בשלב 1. התאם את צפיפות התא לכ- 2 × 107 תאים למ"ל.
  2. טען 50 μL של מתלי תאים (~ 1 × 10,6 תאים) לצלחת עגולה תחתית של 96 בארות וממלא עם 150 μL של חיץ צביעה לכל באר. שומרים את הצלחת על קרח.
  3. הכינו את קוקטייל הנוגדנים CXCR5 נגד עכברים מטוהרים (כלומר, נוגדן ראשוני CXCR5) בדילול של 1:50 ב-50 מיקרוליטר של חיץ צביעת תאי TFH עבור כל דגימה בצינור. מערבלים היטב את הצינור וצנטריפוגות אותו ב 15,000 × גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C כדי לצבור את החלקיקים. שמור את הצינור על קרח.
  4. צנטריפוגה את הצלחת 96 בארות ב 800 × גרם במשך 1 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי decantation, מערבל לזמן קצר את הצלחת, ולהוסיף 200 μL של חיץ צביעה לכל באר.
  5. חזור על שלב 3.4 והשהה מחדש את התאים עם 50 של μL הנוגדן העיקרי CXCR5 לכל באר. מערבבים היטב על ידי פיטינג למעלה ולמטה ודגרים על קרח במשך שעה אחת.
  6. הכינו את קוקטייל הנוגדנים נגד חולדות מסוג ביוטינילציה (כלומר, נוגדן משני CXCR5) בדילול של 1:200 ב-50 מיקרוליטר של חיץ צביעת תאי TFH עבור כל דגימה בצינור חדש. מערבלים את הצינור וצנטריפוגות אותו ב 15,000 × גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C כדי לצבור את החלקיקים. שמור את הצינור על קרח.
  7. צנטריפוגות את הצלחת ב 800 × גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי decantation, מערבל לזמן קצר את הצלחת, ולהוסיף 200 μL של חיץ צביעה לכל באר.
  8. חזור על שלב 3.7 פעמיים ושמור את הצלחת על קרח.
  9. הוסף 50 μL של נוגדן משני CXCR5 לכל באר לצלחת. מערבבים היטב על ידי פיטום למעלה ולמטה ודגרים על קרח במשך 30 דקות.
  10. הכינו סטרפטאבידין מצומד פלואורסצנטי (כלומר, נוגדן שלישוני CXCR5) בדילול של 1:200 ב-50 מיקרוליטר של חיץ צביעת תאי TFH עבור כל דגימה. בינתיים, הוסף נוגדנים אחרים כנגד סמנים פני השטח (למשל, CD45.1, CD4, PD-1, CD25 ומולקולות מעוניינות) ואת כתם התא המת יחד עם נוגדן שלישוני CXCR5.
  11. מערבלים את הצינור וצנטריפוגות אותו ב 15,000 × גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C כדי לצבור את החלקיקים. שמור את הצינור על קרח.
  12. צנטריפוגות את הצלחת ב 800 × גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי decantation, מערבל לזמן קצר את הצלחת, ולהוסיף 200 μL של חיץ צביעה לכל באר.
  13. חזור על שלב 3.12 פעמיים ושמור את הצלחת על קרח.
  14. מוסיפים 50 μL של קוקטייל נוגדנים שלישוני CXCR5 לכל באר לצלחת. מערבבים היטב על ידי פיטום למעלה ולמטה ודגרים על קרח במשך 30 דקות בחושך.
  15. הכינו 200 μL של חיץ קיבוע/חלחול לכל באר בהתאם להוראות היצרן.
  16. צנטריפוגות את הצלחת ב 800 × גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי decantation, מערבל לזמן קצר את הצלחת, ולהוסיף 200 μL של חיץ צביעה לכל באר.
  17. חזור על שלב 3.16 פעמיים ושמור את הצלחת על קרח בחושך.
  18. הוסף 200 μL של חיץ קיבוע/חלחול לכל באר. מערבבים היטב על ידי פיטום למעלה ולמטה ודגירת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות (בחושך).
    הערה: הכן את מאגר החדירות (1x) בהתאם להוראות היצרן.
  19. הכינו את קוקטייל הנוגדנים כנגד גורמי שעתוק, כולל Bcl-6, TCF-1, T-bet ומולקולות מעוניינות, ב-50 מיקרוליטר של חיץ חדירה (1x) לכל באר בצינור חדש.
  20. מערבלים את הצינור והצנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C כדי לצבור את החלקיקים.
  21. צנטריפוגות את הצלחת ב 800 × גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי decantation, מערבל לזמן קצר את הצלחת, ולהוסיף 50 μL של קוקטייל נוגדנים גורם שעתוק לכל באר. מערבבים היטב ודגורים על קרח במשך 30 דקות בחושך.
  22. צנטריפוגות את הצלחת ב 800 × גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C, להשליך את supernatant, מערבלים לזמן קצר את הצלחת על ידי decantation, ולהוסיף 200 μL של חיץ permeabilization (1x) לכל באר.
  23. חזור על שלב 3.22.
  24. מוסיפים 200 μL של חיץ צביעה לכל באר, צנטריפוגות את הצלחת ב 800 × גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי decantation, ולסובב לזמן קצר את הצלחת.
  25. השהה מחדש את גלולת התא בכל באר עם 200 מיקרוליטר של חיץ צביעה והעבר את התאים לצינורות ציטומטריית זרימה לניתוח ציטומטר זרימה מיידי.
    הערה: לחלופין, ניתן לזהות את הדגימות תוך 3 ימים בתנאים של הוספת 200 μl של 2% PFA לכל צינור ולהיות מאוחסן ב 4 ° C בחושך.

4. ייצור רטרו-וירוס

  1. טפחו את תאי 293T (עם פחות מעשרה מעברים) עם DMEM 10% בינוני בכלי תרבית של 10 ס"מ למשך 2-3 מעברים.
  2. כאשר התאים הגיעו למפגש של 90%, השליכו את המדיום הישן ושטפו בעדינות את התאים עם PBS פעמיים, ולאחר מכן טריפסיניזציה קצרה של תאי 293T באמצעות 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.
  3. עצור את תהליך העיכול על ידי השעיית תאים ב 2 מ"ל של מדיום 10% DMEM שחומם מראש, העברתם לצינור חרוטי 15 מ"ל, וצנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  4. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורית התא על ידי פיפטציה מעלה ומטה של תרבית מדיה עם 2 מ"ל של 10% DMEM שחומם מראש.
  5. לכמת את מספר התאים ואת הצלחת 5 × 105 תאים ב 2.5 מ"ל 10% DMEM בינוני לכל באר בצלחת 6 באר.
    הערה: מערבלים את הכלי בעדינות כדי לאפשר לתאי 293T להתפזר באופן שווה ברחבי הצלחת.
  6. כאשר מפגש התאים 293T עולה על 80%, הכינו את ריאגנטי הטרנספקציה כמתואר בשלבים 4.7 עד 4.9.
  7. עבור כל באר של צלחת 6 בארות, להוסיף 250 μL של מדיום Opti-MEM שחומם מראש לתוך צינור סטרילי 1.5 מ"ל. לאחר מכן, הוסף 3 מיקרוגרם של DNA פלסמיד (המכיל 2 מיקרוגרם של וקטור רטרו-ויראלי ו-1 מיקרוגרם של pCL-Eco) למדיום Opti-MEM, ולאחר מכן פיפטינג עדין למעלה ולמטה כדי להבטיח ערבוב מלא.
    הערה: הווקטורים הרטרו-ויראליים המשמשים כדוגמאות במחקר זה הם MigR1 ווקטור MigR1 שונה עם אזור Bcl6 CDS במעלה הזרם של IRES-GFP (MigR1-Bcl6).
  8. לאחר מכן, הוסף 7.5 μL של מגיב טרנספקציה שחומם מראש (מתקבל מסחרית) לתערובת ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי להבטיח ערבוב יסודי.
  9. דוגרים על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  10. יש לפזר את התערובת לאזורים נפרדים של 293T תאים שגודלו בתרבית היטב, ולאחר מכן לנדנד בעדינות את כלי התרבית בתנועה קדימה ואחורה ומצד לצד כדי להבטיח פיזור אחיד של התערובת.
  11. לדגור על תאי 293T במשך 72 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס המכיל 5% CO2.
  12. זהה את התג של הווקטור הרטרו-ויראלי כפרוקסי ליעילות טרנספקציה בתאי 293T הנגועים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או ציטומטריית זרימה.
    הערה: לדוגמה, אישרנו את האות הפלואורסצנטי GFP בחלק משמעותי של תאי 293T נגועים בווקטור MigR1, דבר המצביע על טרנספקציה באיכות גבוהה.
  13. אספו תרבית תאים בינונית וצנטריפוגה בטמפרטורה של 2,500 × למשך 10 דקות ב-4°C כדי לסלק פסולת תאית. יש לאסוף בזהירות את הסופרנאטנט המתקבל ולאחסן אותו לשימור לטווח ארוך ב -80 ° C או להישמר באופן זמני ב -4 ° C.

5. הפעלת In vivo , התמרה רטרו-וירוס והעברה מאמצת של תאי SM CD4+ T

  1. הזריקו עכבר CD45.1+ SM אחד (בגיל 6 עד 8 שבועות) תוך ורידי עם 200 מיקרוגרם של LCMV GP61-77 פפטיד11,14 בנפח של 100 μL של מדיום RPMI.
    הערה: נפח ההזרקה צריך להשתנות על ידי כל חוקר ולא יעלה על נפח ההזרקה המרבי המותר על פי המוסד והחוק המקומי.
  2. יש להרדים את עכבר ה-SM לאחר 16-18 שעות לאחר הזרקת פפטיד (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות). לרכוש את הטחול בעקבות ההליכים הנ"ל בשלב 1.
    הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בשיטת גירוי27,28 נגד CD3/anti-CD28 במבחנה כדי להפעיל תאי SM CD4+ T במקום גירוי פפטידי in vivo המתואר בשלבים 5.1 ו-5.2.
  3. להשעות את splenocytes עם 2% RPMI ולהתאים את צפיפות התא כ 1 × 108 תאים לכל מ"ל בצינור חרוטי 15 מ"ל. שמור את הצינור על קרח.
  4. יש לפזר 50 μL של תרחיף תאים לתוך צלחת עגולה בעלת תחתית של 96 בארות ולהשלים עם 150 μL של חיץ צביעה לכל באר.
  5. צנטריפוגות את הצלחת 96 בארות ב 800 × גרם במשך 1 דקות ב 4 ° C כדי pellet את התאים, בזהירות להסיר את supernatant על ידי decantation, מערבל לזמן קצר את הצלחת, ולהוסיף 200 μL של חיץ מכתים לכל באר.
  6. חזור על שלב 5.5 והשהה מחדש את התאים עם 50 μL של קוקטייל נוגדנים משטח, כולל CD4, CD25 ו- CD69, כדי לזהות את מצב ההפעלה של תאי SM CD4+ T. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ודגרים על קרח במשך 30 דקות בחושך.
  7. מלא כל באר עם חיץ צביעה ל 200 μL, ואחריו צנטריפוגה של הצלחת ב 800 × גרם במשך 1 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקונציה וערברו לזמן קצר את הצלחת.
  8. חזור על שלב 5.7 פעמיים.
  9. להשהות מחדש את התאים ב 200 μL של חיץ צביעה ולהעביר אותם לתוך ציטומטריה זרימה ציטומטריה.
  10. נתח את התאים המוכתמים בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים עם ציטומטריית זרימה כדי להעריך את מצב ההפעלה של תאי SM CD4+ T.
    הערה: תאי SM CD4+ T מופעלים הציגו ביטויי CD25 ו- CD69 בשפע בהשוואה לתאים נאיביים, ובכך אפשרו הליכי התמרה עוקבים.
  11. הוסף 1 × 106 תאי SM CD4+ T (משלב 5.3) לכל באר לתוך צלחת 24 באר. סובב תאים כלפי מטה ב 800 × גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן בזהירות להסיר את המדיום על ידי decantation.
  12. הוסף 1 מ"ל של מדיום רטרווירוס כמתואר בשלב 4.13 ו 8 מיקרוגרם של פוליברן לכל באר.
  13. ספין-התממר את התאים ב 800 × גרם במשך 2 שעות ב 37 ° C.
  14. יש להשליך בזהירות את מדיום הרטרו-וירוס על ידי פיפטינג ולהוסיף 1 מ"ל של 10% סל"ד שחומם מראש בתוספת 10 ננוגרם/מ"ל מורין רקומביננטי IL-2 לכל באר.
  15. לדגור על התאים במשך 48 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס המכיל 5% CO2.
  16. העבירו את תרחיף התאים לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל וסובבו את התאים בטמפרטורה של 800 × למשך 6 דקות ב-4°C.
  17. הסר את supernatant על ידי decantation ו resuspend את התאים עם נפח מתאים של 2% RPMI כדי להפוך צפיפות תאים של 1 × 108 תאים לכל מ"ל בצינור חרוטי 15 מ"ל. שמור את הצינור על קרח.
  18. יש לפזר 50 μL של תרחיף תאים לתוך צלחת עגולה בעלת תחתית של 96 בארות ולהשלים עם 150 μL של חיץ צביעה לכל באר.
  19. צנטריפוגות את הצלחת 96 בארות ב 800 × גרם במשך 1 דקות ב 4 ° C כדי pellet את התאים, בזהירות להסיר את supernatant על ידי decantation, מערבל לזמן קצר את הצלחת, ולהוסיף 200 μL של חיץ מכתים לכל באר.
  20. חזור על שלב 5.19 והשהה מחדש את התאים עם 50 μL של קוקטייל נוגדנים משטח, כולל CD4, Vα2 ונוגדן הקשור לתג וקטורי. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ודגרים על קרח במשך 30 דקות בחושך.
  21. ממלאים כל באר בחיץ צביעה ל -200 μL, ולאחר מכן צנטריפוגה של הצלחת ב 800 × גרם למשך דקה אחת. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקונציה וערברו לזמן קצר את הצלחת.
  22. חזור על שלב 5.21 פעמיים.
  23. להשהות מחדש את התאים ב 200 μL של חיץ צביעה ולהעביר אותם לתוך ציטומטריה זרימה ציטומטריה.
  24. נתח את התאים המוכתמים בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים עם ציטומטריית זרימה כדי להעריך את יעילות ההעברה בתאי SM CD4+ T.
    הערה: תאי SM CD4+ T שהותמרו ביעילות הציגו ביטוי גבוה של התג של רטרו-וירוס, כגון GFP, במחקר.
  25. צנטריפוגה את מתלי התא משלב 5.17 ב 800 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant על ידי decantation. השהה מחדש את גלולת התא עם RPMI והתאם את צפיפות התא ל- 1 × 107 CD4 + Vα2+ תאי SM / מ"ל.
  26. העברה מאומצת של 1 × 106 תאי CD45.1+ SM CD4+ T לכל עכבר מקבל C57BL/6 (בגיל 6 עד 8 שבועות) על ידי הזרקה תוך ורידית של 100 μL של תרחיף תאים בשלב 5.25.
  27. למחרת, הדביקו עכברים מושתלי C57BL/6 ב-1 × 106 יחידות יוצרות פלאק LCMV ארמסטרונג באמצעות הזרקה תוך ורידית.

6. ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי SM TFH המומרים רטרו-וירוס בשלב מוקדם של זיהום LCMV חריף

  1. רכשו את הטחול מעכברי C57BL/6 משלב 5.25 ביום השלישי לאחר ההדבקה.
  2. בצע צביעת ציטומטריה של זרימה של סמני פני שטח, כולל CD4, CD45.1, CXCR5, CD25 ומולקולות מעוניינות, בטחול כמתואר בשלב 3.
  3. לזיהוי גורמי שעתוק בתאי SM CD4+ T המומרים ברטרו-וירוס המתויג על ידי חלבונים פלואורסצנטיים, יש להוסיף 200 μL של 2% PFA לכל באר ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות בחושך.
  4. ביצוע קיבוע/חלחול, צביעת ציטומטריית זרימה של גורמי השעתוק המעוניינים, וביצוע ניתוח ציטומטריית זרימה כמתואר בשלב 3.

תוצאות

מאפיינים של תאי TFH ספציפיים לווירוס ממוינים מוקדם במהלך זיהום LCMV חריף
כדי לחקור את מחויבות הגורל המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לנגיף, תאי SM CD4+ T קונגניים נאיביים המזהים באופן ספציפי אפיטופ LCMV GP I-AbGP66-77 הועברו באימוץ למושתלי CD45.2+ C57BL/6. למחרת, המושתלי?...

Discussion

המחקר בתחום תאי TFH הודגש מאז גילוי הפונקציה המיוחדת של תאיT FH בסיוע לתאי B. מחקרים מצטברים הצביעו על כך שהתמיינות תאי TFH היא תהליך רב-שלבי ורב-גורמי30, שבו המחויבות לגורל תאי TFH נקבעת בשלב המוקדם5. לכן, הבנה טובה יותר של המנגנונים העומדים בבסיס ?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '32300785 ל- X.C.), התוכנית הלאומית לפוסט-דוקטורט בסין לכישרונות חדשניים (No. BX20230449 ל-X.C.), והפרויקט הלאומי למדע וטכנולוגיה (מס' 2021YFC2300602 ל-L.Y).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTACorning25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFABeyotimeP0099-500mL
70 μm cell strainerMerckCLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)Biolegend1278121:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)Biolegend1107241:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)Biolegend1019101:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouseThe Jackson Laboratory002014
BeaverBeads StreptavidinBeaver22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)Biolegend1231061:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)Biolegend1173041:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)Biolegend1155041:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)Biolegend1007041:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)Biolegend1087041:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)Biolegend1162041:200 dilution
bovine serum albumin, BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)Biolegend6448161:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)Biolegend1352201:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouseThe Jackson Laboratory000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouseIn house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% mediumDMEM medium containing 10% FBS
DMEM mediumGibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
Fetal bovine serum, FBSSigmaF8318
FlowJo (version 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SetInvitrogen00-5523-00The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), BiotinylatedVector laboratoriesBA-9400-1.51:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging SystemThermoFisher Scientific
Isolation bufferFACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitationLife TechnologiesL101991:200 dilution
MigR1addgene#27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM mediumGibco31985070
pCL-Ecoaddgene#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)Biolegend1045081:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)BD Biosciences5615221:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)BD Biosciences5519611:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)Biolegend1005381:200 dilution
recombinant murine IL-2Gibco212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis BufferBeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 mediumSigmaR8758
RPMI 2%RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouseSM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining bufferPBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7eBioscience25-4317-821:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) Cell signaling technology6444S1:400 dilution
TFH cell staining bufferFACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagentMirus BioMIRUMIR2700

References

  1. O'shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
  2. Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
  3. Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. Follicular helper t cells. Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).
  4. Choi, Y. S., et al. ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6. Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).
  5. Choi, Y. S., et al. Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory. J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).
  6. Johnston, R. J., et al. Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
  7. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
  8. Yu, D., et al. The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
  9. Choi, Y. S., et al. LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6. Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).
  10. Wu, T., et al. TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection. Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).
  11. Xu, L., et al. The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection. Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).
  12. Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile. Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).
  13. Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation. J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).
  14. Chen, X., et al. The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection. Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).
  15. Li, F., et al. Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF. Nat Commun. 9 (1), 5452 (2018).
  16. Yao, Y., et al. METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation. Nat Commun. 12 (1), 1333 (2021).
  17. Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation. J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).
  18. Lee, J. Y., et al. The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation. Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).
  19. Xiao, N., et al. The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells. Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).
  20. Baumjohann, D., et al. The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression. Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).
  21. Wang, Y., et al. The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis. Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).
  22. Hale, J. S., et al. Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection. Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).
  23. Yao, Y., et al. Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis. Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).
  24. Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection. Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).
  25. Grosjean, C., et al. Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays. STAR Protoc. 2 (4), 100961 (2021).
  26. Dowling, P., et al. Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen. STAR Protoc. 1 (3), 100196 (2020).
  27. Choi, Y. S., Crotty, S. Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells. Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).
  28. Wu, D., et al. A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells. J Immunol Methods. 488, 112931 (2021).
  29. He, R., et al. Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection. Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).
  30. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).
  31. Breitfeld, D., et al. Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production. J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).
  32. Xu, L., et al. The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells. Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).
  33. Chen, X., et al. The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells. Nat Commun. 13 (1), 2762 (2022).
  34. Chen, J. S., et al. Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human. J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

T TFHTFHLCMVSMARTATCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved