급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화에 접근

요약

현재 연구는 바이러스 특이적 T_FH 세포의 조기 운명 헌신을 평가하고 이러한 세포에서 유전자 발현을 조작하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

초록

Follicular Helper T (T_FH) cell은 동족 B 세포가 친화성이 높은 항체를 생성하여 장기적인 체액성 면역을 형성하는 데 도움을 주는 독립적인 CD4⁺ T 세포 계통으로 인식됩니다. 급성 바이러스 감염 시 바이러스 특이적 T_FH 세포의 운명 결정은 초기 감염 단계에서 결정되며, 조기 분화된 T_FH 세포에 대한 연구는 T 세포 의존성 체액성 면역을 이해하고 백신 설계를 최적화하는 데 중요합니다. 이 연구에서는 급성 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV) 감염 마우스 모델과 LCMV 당단백질 에피토프 I-A^bGP_66-77을 특이적으로 인식하는 CD4⁺ T 세포를 가진 TCR-transgenic SMARTA(SM) 마우스를 사용하여 유세포 염색을 기반으로 바이러스 특이적 T_FH 세포의 조기 운명 헌신에 접근하는 절차를 설명했습니다. 또한, SM CD4⁺ T 세포의 레트로바이러스 transduction을 이용하여 조기 분화된 바이러스 특이적 T_FH 세포에서 유전자 발현을 조작하는 방법도 제공합니다. 따라서 이러한 방법은 바이러스 특이적 T_FH 세포의 조기 투여의 기저에 있는 메커니즘을 탐색하는 연구에 도움이 될 것입니다.

서문

다양한 병원체나 위협에 직면했을 때, 미성숙 CD4⁺ T 세포는 특화된 기능을 가진 다양한 보조 T(T_H) 세포 subset으로 분화하여 면역 반응을 조정합니다¹. 급성 바이러스 감염 시나리오에서 naive CD4⁺ T 세포의 상당 부분은 B 세포 ^2,3에 도움을 제공하는 여포 도우미 T(T_FH) 세포로 분화합니다. 다른 CD4⁺ T_H 세포 subset(예를 들어, T_H1, T_H2, T_H9 및 T_H17 세포)와 구별되듯이, T_FH 세포는 상당한 수준의 CXCR5를 발현하는데, 이는 B 세포 귀환 chemokine CXCL13에 대한 chemokine 수용체로서, T_FH 세포가 B 세포 소낭선으로 이동할 수 있게 한다. B 세포 난포에서 T_FH 세포는 생식 중심 반응을 시작하고 유지하는 데 있어 B 세포를 동족 형성을 지원하여 빠른 고친화성 항체 생산과 장기 체액성 기억을 가능하게 합니다

프로토콜

모든 동물실험은 제3군사의과대학의 동물관리이용위원회(Institutional Animal Care and Use Committees)가 승인한 절차에 따라 실시하였다. 본 연구에서는 다음과 같은 마우스 균주가 사용되었다 : C57BL / 6J (B6) 마우스 (남녀 모두), 6-8 주령, 체중 25-30g; CD45.1⁺SM TCR 형질전환 마우스(B6 CD45.1 × SM TCR 형질전환), 남녀 모두, 생후 6-8주, 체중 25-30g; 및 CXCR5-GFP CD45.1 ⁺ SM TCR 형질 전환 마우스 (B6 CD45.1 × SM TCR 형질 전환 × CXCR5-GFP 녹인), 남녀 모두, 6-8 주, 무게 25-30g. 형질전환 종은 이전에 발표된 보고서²⁴에 따라 생성되었다. 연구에 사용된 시약, 완충액 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 입양 전달을 위한 CD45.1⁺ SM CD4⁺ T 세포 채취

1. (제도적으로 승인된 프로토콜에 따라) 6-8주 된 CD45.1⁺ T....

토론

T_FH 세포 분야의 연구는 B 세포를 돕는 T_FH 세포의 특화된 기능이 발견된 이후 주목을 받았습니다. 축적된 연구는 T_FH 세포 분화가 다단계 및 다인자 과정^(multistage and multifactorial process)이라는 것을 나타냈다(30), 여기서 T_FH 세포 운명 헌신은 초기 단계^{(early stage5})에서 결정된다. 따라서 조기 분화된 T_FH 세포의 기전을 더 잘 이?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Corning	25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA	Beyotime	P0099-500mL
70 μm cell strainer	Merck	CLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)	Biolegend	127812	1:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)	Biolegend	110724	1:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)	Biolegend	101910	1:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse	The Jackson Laboratory	002014
BeaverBeads Streptavidin	Beaver	22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)	Biolegend	123106	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)	Biolegend	117304	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)	Biolegend	115504	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)	Biolegend	108704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)	Biolegend	116204	1:200 dilution
bovine serum albumin, BSA	Sigma	A7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)	Biolegend	644816	1:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)	Biolegend	135220	1:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouse	The Jackson Laboratory	000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouse			In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% medium			DMEM medium containing 10% FBS
DMEM medium	Gibco	11885092
EDTA	Sigma	E9884
FACSFortesa	BD Biosciences
Fetal bovine serum, FBS	Sigma	F8318
FlowJo (version 10.4.0)	BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	Invitrogen	00-5523-00	The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated	Vector laboratories	BA-9400-1.5	1:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific
Isolation buffer			FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)	Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199	1:200 dilution
MigR1	addgene	#27490
NaN3	Sigma	S2002
Opti-MEM medium	Gibco	31985070
pCL-Eco	addgene	#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)	Biolegend	104508	1:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)	BD Biosciences	561522	1:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBS	Gibco	10010072
Polybrene	Solarbio	H8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)	BD Biosciences	551961	1:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)	Biolegend	100538	1:200 dilution
recombinant murine IL-2	Gibco	212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis Buffer	Beyotime	C3702-500mL
RPMI 1640 medium	Sigma	R8758
RPMI 2%			RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouse			SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining buffer			PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7	eBioscience	25-4317-82	1:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)	Cell signaling technology	6444S	1:400 dilution
TFH cell staining buffer			FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagent	Mirus Bio	MIRUMIR2700