Zugang zur frühen Differenzierung der virusspezifischen follikulären Helferzelle CD4+ T-Zellen in akuten LCMV-infizierten Mäusen

Zusammenfassung

Die aktuelle Studie zeigt Protokolle zur Bewertung der frühen Schicksalsbindung von virusspezifischen_T-FH-Zellen und zur Manipulation der Genexpression in diesen Zellen.

Zusammenfassung

Follikuläre T-Helferzellen (T_FH) werden als eigenständige CD4⁺ T-Zelllinie wahrgenommen, die verwandte B-Zellen bei der Produktion von hochaffinen Antikörpern unterstützt und so eine langfristige humorale Immunität aufbaut. Während einer akuten Virusinfektion wird das Schicksal virusspezifischer_T-FH-Zellen in der frühen Infektionsphase bestimmt, und Untersuchungen der früh differenzierten_T-FH-Zellen sind entscheidend für das Verständnis der T-Zell-abhängigen humoralen Immunität und die Optimierung des Impfstoffdesigns. In der Studie haben wir unter Verwendung eines Mausmodells für eine akute Infektion mit dem lymphozytären Choriomeningitis-Virus (LCMV) und der TCR-transgenen SMARTA (SM)-Maus mit CD4⁺ T-Zellen, die spezifisch das LCMV-Glykoprotein-Epitop I-A^bGP_66-77 erkennen, Verfahren beschrieben, um auf der Grundlage von Durchflusszytometrie-Färbungen auf das frühe Schicksal von virusspezifischen_T-FH-Zellen zuzugreifen. Darüber hinaus werden durch die Ausnutzung der retroviralen Transduktion von SM CD4⁺ T-Zellen auch Methoden zur Manipulation der Genexpression in früh differenzierten virusspezifischen_T-FH-Zellen bereitgestellt. Daher werden diese Methoden bei Studien helfen, die den Mechanismus untersuchen, der der frühen Bindung von virusspezifischen_T-FH-Zellen zugrunde liegt.

Einleitung

Wenn naive CD4⁺ T-Zellen auf unterschiedliche Krankheitserreger oder Bedrohungen treffen, passen sie ihre Immunantworten an, indem sie sich in verschiedene T-Helfer-Zell-Untergruppen (T_H) mit spezialisierten Funktionen differenzieren¹. Im Szenario einer akuten Virusinfektion differenziert sich ein großer Teil der naiven CD4⁺ T-Zellen zu follikulären Helfer-T (T_FH)-Zellen, die den B-Zellen helfen ^2,3. Im Unterschied zu anderen CD4⁺ T_H Zell-Untergruppen (z. B. T_H1, T_H2, T_H9 und T_H....

Protokoll

Alle Tierversuche wurden nach Verfahren durchgeführt, die von den Institutional Animal Care and Use Committees der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt wurden. Die folgenden Mausstämme wurden in der vorliegenden Studie verwendet: C57BL/6J (B6) Maus (beide Geschlechter), im Alter von 6 bis 8 Wochen, mit einem Gewicht von 25-30 g; CD45.1⁺SM TCR-transgene Maus (B6 CD45.1 × SM TCR transgen), beide Geschlechter, im Alter von 6 bis 8 Wochen, mit einem Gewicht von 25-30 g; und CXCR5-GFP CD45.1⁺SM TCR-transgene Maus (B6 CD45.1 × SM TCR-transgene × CXCR5-GFP Knock-in), beide Geschlechter, im Alter von 6 bis 8 Wochen, mit einem Gewicht von 25....

Diskussion

Die Forschung auf dem Gebiet der_T-FH-Zellen ist seit der Entdeckung der spezialisierten Funktion von_T-FH-Zellen bei der Unterstützung von B-Zellen hervorgehoben worden. Häufende Studien deuteten darauf hin, dass die_{T-FH-Zelldifferenzierung} ein mehrstufiger und multifaktorieller Prozess³⁰ ist, wobei die Schicksalsbindung der_T-FH-Zellen im frühen Stadium bestimmt wird⁵. Daher ist ein besseres Verständnis der Mechanismen, die fr?.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Corning	25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA	Beyotime	P0099-500mL
70 μm cell strainer	Merck	CLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)	Biolegend	127812	1:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)	Biolegend	110724	1:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)	Biolegend	101910	1:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse	The Jackson Laboratory	002014
BeaverBeads Streptavidin	Beaver	22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)	Biolegend	123106	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)	Biolegend	117304	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)	Biolegend	115504	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)	Biolegend	108704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)	Biolegend	116204	1:200 dilution
bovine serum albumin, BSA	Sigma	A7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)	Biolegend	644816	1:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)	Biolegend	135220	1:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouse	The Jackson Laboratory	000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouse			In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% medium			DMEM medium containing 10% FBS
DMEM medium	Gibco	11885092
EDTA	Sigma	E9884
FACSFortesa	BD Biosciences
Fetal bovine serum, FBS	Sigma	F8318
FlowJo (version 10.4.0)	BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	Invitrogen	00-5523-00	The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated	Vector laboratories	BA-9400-1.5	1:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific
Isolation buffer			FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)	Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199	1:200 dilution
MigR1	addgene	#27490
NaN3	Sigma	S2002
Opti-MEM medium	Gibco	31985070
pCL-Eco	addgene	#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)	Biolegend	104508	1:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)	BD Biosciences	561522	1:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBS	Gibco	10010072
Polybrene	Solarbio	H8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)	BD Biosciences	551961	1:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)	Biolegend	100538	1:200 dilution
recombinant murine IL-2	Gibco	212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis Buffer	Beyotime	C3702-500mL
RPMI 1640 medium	Sigma	R8758
RPMI 2%			RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouse			SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining buffer			PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7	eBioscience	25-4317-82	1:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)	Cell signaling technology	6444S	1:400 dilution
TFH cell staining buffer			FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagent	Mirus Bio	MIRUMIR2700