Zugang zur frühen Differenzierung der virusspezifischen follikulären Helferzelle CD4+ T-Zellen in akuten LCMV-infizierten Mäusen

Zusammenfassung

Die aktuelle Studie zeigt Protokolle zur Bewertung der frühen Schicksalsbindung von virusspezifischen_T-FH-Zellen und zur Manipulation der Genexpression in diesen Zellen.

Zusammenfassung

Follikuläre T-Helferzellen (T_FH) werden als eigenständige CD4⁺ T-Zelllinie wahrgenommen, die verwandte B-Zellen bei der Produktion von hochaffinen Antikörpern unterstützt und so eine langfristige humorale Immunität aufbaut. Während einer akuten Virusinfektion wird das Schicksal virusspezifischer_T-FH-Zellen in der frühen Infektionsphase bestimmt, und Untersuchungen der früh differenzierten_T-FH-Zellen sind entscheidend für das Verständnis der T-Zell-abhängigen humoralen Immunität und die Optimierung des Impfstoffdesigns. In der Studie haben wir unter Verwendung eines Mausmodells für eine akute Infektion mit dem lymphozytären Choriomeningitis-Virus (LCMV) und der TCR-transgenen SMARTA (SM)-Maus mit CD4⁺ T-Zellen, die spezifisch das LCMV-Glykoprotein-Epitop I-A^bGP_66-77 erkennen, Verfahren beschrieben, um auf der Grundlage von Durchflusszytometrie-Färbungen auf das frühe Schicksal von virusspezifischen_T-FH-Zellen zuzugreifen. Darüber hinaus werden durch die Ausnutzung der retroviralen Transduktion von SM CD4⁺ T-Zellen auch Methoden zur Manipulation der Genexpression in früh differenzierten virusspezifischen_T-FH-Zellen bereitgestellt. Daher werden diese Methoden bei Studien helfen, die den Mechanismus untersuchen, der der frühen Bindung von virusspezifischen_T-FH-Zellen zugrunde liegt.

Einleitung

Wenn naive CD4⁺ T-Zellen auf unterschiedliche Krankheitserreger oder Bedrohungen treffen, passen sie ihre Immunantworten an, indem sie sich in verschiedene T-Helfer-Zell-Untergruppen (T_H) mit spezialisierten Funktionen differenzieren¹. Im Szenario einer akuten Virusinfektion differenziert sich ein großer Teil der naiven CD4⁺ T-Zellen zu follikulären Helfer-T (T_FH)-Zellen, die den B-Zellen helfen ^2,3. Im Unterschied zu anderen CD4⁺ T_H Zell-Untergruppen (z. B. T_H1, T_H2, T_H9 und T_H17 Zellen) exprimieren T_FH-Zellen eine beträchtliche Menge an CXCR5, dem Chemokinrezeptor für das B-Zell-Homing-Chemokin CXCL13, das es T_FH-Zellen ermöglicht, in B-Zellfollikel zu wandern. In den B-Zell-Follikeln unterstützen_T-FH-Zellen verwandte B-Zellen bei der Initiierung und Aufrechterhaltung von Keimzentrumsreaktionen und ermöglichen so eine schnelle Produktion von Antikörpern mit hoher Affinität und ein humorales Langzeitgedächtnis ^2,3.

Nach einer akuten Virusinfektion erfolgt die frühe Schicksalsbindung von virusspezifischen_T-FH-Zellen innerhalb von 72 h ^4,5 und wird durch den transkriptionellen Repressor B-Zell-Lymphom-6 (Bcl-6)^5,6,7,8 gesteuert, der als "Master-Regulator" fungiert und über das Schicksal von_T-FH-Zellen entscheidet. Ein Mangel an Bcl-6 stumpft die Differenzierung der_T-FH-Zellen stark ab, während die ektopische Bcl-6-Expression die Bindung der T-FH-Zellen an das Schicksal der_T-FH-Zellen erheblich fördert. Zusätzlich zu Bcl-6 sind mehrere Moleküle an der Instruktion des frühen Schicksals der_T-FH-Zellen beteiligt. Die Transkriptionsfaktoren TCF-1 und LEF-1 initiieren die Differenzierung der_T-FH-Zellen über die Induktion von Bcl-6 ^9,10,11. Die Hemmung von Blimp1 sowohl durch Bcl-6 als auch durch TCF-1 ist für die frühe Bindung von_T-FH-Zellen erforderlich^11,12. STAT1 und STAT3 werden auch für die frühe Differenzierung von_T-FH-Zellen benötigt¹³. Darüber hinaus tragen epigenetische Modifikationen durch die Histon-Methyltransferase EZH2^14,15 und die m6A-Methyltransferase METTL3¹⁶ dazu bei, die Transkriptionsprogramme der_T-FH-Zellen (insbesondere Bcl6 und Tcf7) zu stabilisieren und damit das frühe Schicksal der_T-FH-Zellen zu unterstützen. Während Fortschritte, einschließlich der oben genannten Moleküle und anderer, die an anderer Stelle^{zusammengefasst sind 3}, beim Verständnis der transkriptionellen und epigenetischen Regulation des frühen Schicksals von_T-FH-Zellen gemacht wurden, müssen bisher unbekannte Moleküle noch gelernt werden.

Im Mausmodell der akuten lymphozytären Choriomeningitis-Virus (LCMV)-Infektion durchlaufen adoptiv übertragene kongene TCR-transgene SMARTA (SM) CD4⁺ T-Zellen, die spezifisch das LCMV-Glykoprotein-Epitop I-A^bGP_66-77 erkennen, während der Virusinfektion entweder eine_T-FH- oder eine_{T-H1-Zelldifferenzierung}. Dieses T_FH/T_H1-Bifurkationsdifferenzierungsmuster unterstützt die Weiterentwicklung des SM/akuten LCMV-Infektionsmodells bei der Untersuchung der Biologie virusspezifischer T_FH-Zellen. In der Tat ist das SM/akute LCMV-Infektionsmodell in der_{T-FH-Zellforschung} weit verbreitet und hat eine entscheidende Rolle bei bahnbrechenden Entdeckungen in der_{T-FH-Zellbiologie} gespielt. Dies beinhaltet die Identifizierung des bereits erwähnten Bcl-6 als liniendefinierenden Transkriptionsfaktor der_T-FH-Zellen ^5,6 sowie anderer wichtiger transkriptioneller Faktoren (z. B. Blimp-1⁶, TCF-1/LEF ^9,10,11, STAT1/STAT3¹³, STAT5¹⁷, KLF2¹⁸ und Itch¹⁹), die die Differenzierung_von T-FH-Zellen steuern, posttranskriptionelle Regulierungen ( z.B. METTL3¹⁶ und miR-17~92²⁰) der T-FH-Zelldifferenzierung, des T-FH-Zellgedächtnisses und der Plastizität^21,22 und rationaler Impfstrategien, die auf _T-FH-Zellen abzielen (z. B. Selen²³).

Die vorliegende Studie beschreibt reproduzierbare Methoden für den Zugang zur frühen Schicksalsbindung von virusspezifischen_T-FH-Zellen , einschließlich (1) der Etablierung eines akuten LCMV-infizierten SM-Chimären-Mausmodells, das für den Zugang zu früh differenzierten_T-FH-Zellen geeignet ist, (2) der Durchführung von Durchflusszytometrie-Färbungen von Molekülen, die mit frühdifferenzierten_T-FH-Zellen verwandt sind, und (3) der Durchführung retroviraler vektorbasierter Genmanipulation in SM CD4⁺ T-Zellen. Diese Methoden werden für Studien nützlich sein, die die frühe Schicksalsbindung von virusspezifischen_T-FH-Zellen untersuchen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden nach Verfahren durchgeführt, die von den Institutional Animal Care and Use Committees der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt wurden. Die folgenden Mausstämme wurden in der vorliegenden Studie verwendet: C57BL/6J (B6) Maus (beide Geschlechter), im Alter von 6 bis 8 Wochen, mit einem Gewicht von 25-30 g; CD45.1⁺SM TCR-transgene Maus (B6 CD45.1 × SM TCR transgen), beide Geschlechter, im Alter von 6 bis 8 Wochen, mit einem Gewicht von 25-30 g; und CXCR5-GFP CD45.1⁺SM TCR-transgene Maus (B6 CD45.1 × SM TCR-transgene × CXCR5-GFP Knock-in), beide Geschlechter, im Alter von 6 bis 8 Wochen, mit einem Gewicht von 25-30 g. Die transgenen Spezies wurden in Anlehnung an einen zuvor veröffentlichten Bericht^{generiert 24}. Die Einzelheiten zu den in der Studie verwendeten Reagenzien, Puffern und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Ernte von CD45.1⁺ SM CD4⁺ T-Zellen für den adoptiven Transfer

1. Euthanasieren Sie (gemäß institutionell zugelassenen Protokollen) die erforderliche Anzahl von CD45.1⁺ TCR-transgenen SM-Mäusen im Alter von 6 bis 8 Wochen²⁴. Machen Sie einen 1-Zoll-Schnitt links von der Peritonealwand der euthanasierten Mäuse mit einer chirurgischen Schere, präparieren Sie die Milz vom Peritoneum und reißen Sie das Bindegewebe hinter der Milz^{auf 25,26}.
2. Legen Sie jede Milz in ein 70-μm-Zellsieb in einer Petrischale (60 mm × 15 mm) und mahlen Sie die Milz mit 3 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC) unter Verwendung eines 1-ml-Spritzenkolbens.
   HINWEIS: Verwenden Sie die runde Seite des Spritzenkolbens, um die Milz zu schleifen, bis nur noch Bindegewebe übrig ist.
3. Geben Sie 6 ml RPMI + 2 % FBS (RPMI 2 %) in jede Schale, um 3 ml Erythrozyten-Lysepuffer zu verdünnen. Pipettieren Sie die Zellsuspensionen in ein konisches 15-ml-Röhrchen aus der Schale. Spülen Sie das Gericht mit zusätzlichen 3 ml 2 % RPMI aus und geben Sie es in dasselbe konische Röhrchen.
4. Die Zellsuspensionen werden bei 800 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand durch Dekantieren verworfen. Resuspendieren Sie die Zellen mit einem Isolationspuffer und stellen Sie die Zelldichte auf ~1 × 10⁸ Zellen pro ml ein. Lege das Rohr auf Eis.
5. Bereiten Sie einen 1x biotinylierten Antikörpercocktail gegen CD8a, CD19, NK1.1, F4/80, CD11c und Ter119 in Isolationspuffer für die Anreicherung von CD4⁺ T-Zellen vor.
   HINWEIS: Biotinylierte Antikörper in den Isolationspuffer in der angegebenen Verdünnung geben, wie in der Materialtabelle angegeben. Das Volumen des Antikörpercocktails ist das Volumen des Isolationspuffers in Schritt 1.4 gleich zu halten.
6. Die Zellsuspensionen werden bei 800 × g 5 min lang bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand durch Dekantieren verworfen.
7. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit dem angegebenen 1x biotinylierten Antikörpercocktail im konischen Röhrchen.
8. Legen Sie das konische Rohr für 30 min bei 45 U/min in einem Shaker auf Eis.
9. Während der Inkubation mit biotinylierten Antikörpern ist die erforderliche Menge an Streptavidin-beschichteten Kügelchen gemäß den Anweisungen des Herstellers herzustellen.
   HINWEIS: Die Gesamtsplenozyten einer naiven Maus benötigen 200 μl Streptavidin-beschichtete Kügelchen.
10. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 800 x g mit 8-10 mL Isolationspuffer für 5 min bei 4 °C gewaschen und der Überstand verworfen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male.
11. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit vorbereiteten Streptavidin-beschichteten Kügelchen.
12. Legen Sie das Rohr für 40 min bei 45 U/min in einen Shaker auf Eis.
13. Legen Sie dann das Rohr für 3-4 Minuten auf einen Magnetständer, bis alle Perlen auf der magnetischen Seite zusammengefügt sind.
14. Sammeln Sie den Überstand vorsichtig und geben Sie ihn in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen.
15. Die Zellsuspensionen werden bei 800 × g 5 min lang bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand durch Dekantieren verworfen.
    HINWEIS: Es gibt andere kommerzielle Kits für die CD4⁺ T-Zell-Anreicherung, die als Ersatz für das in den Schritten 1.5-1.15 beschriebene Verfahren zur Anreicherung von CD4⁺ T-Zellen verwendet werden können.
16. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 2-3 mL mit 2 % RPMI. Aspirieren Sie 50 μl Zellsuspension für die durchflusszytometrische Analyse der Effizienz der CD4⁺ T-Zellanreicherung (CD4 und Vα2) und der Zellviabilität.
17. Die Zellsuspensionen werden bei 800 × g 5 min lang bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand durch Dekantieren verworfen. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit RPMI und stellen Sie die Zelldichte auf 1 ×^{10 7} CD4⁺Vα2⁺ SM-Zellen pro ml ein. Legen Sie das Röhrchen auf Eis und fahren Sie im nächsten Schritt mit dem adoptiven Zelltransfer fort.

2. Etablierung des akuten LCMV-infizierten SM-Chimären-Mausmodells für den Zugang zu früh differenzierten SM T_FH-Zellen

1. Erwärmen Sie die 6 bis 8 Wochen alten C57BL/6-Empfängermäuse mit einer Infrarotlampe, um die Schwanzvene für die intravenöse Injektion zu erweitern.
2. 100 μl der in Schritt 1.17 hergestellten Zellsuspension mit 1 ×^{10 6} SM-Zellen mit einer Insulinspritze aspirieren.
   HINWEIS: Das Injektionsvolumen sollte von jedem Forscher geändert werden und sollte das nach institutionellen und lokalen Gesetzen zulässige maximale Injektionsvolumen nicht überschreiten.
3. Halten Sie die Mäuse mit einem Mausfixateur an Ort und Stelle, richten Sie den Schwanz aus und wischen Sie den Schwanz mit einem Wattebausch mit 75% Ethanol ab, um die Schwanzvene sichtbar zu machen.
4. Führen Sie die Insulinspritzennadel in die Schwanzvene ein und injizieren Sie die Zellsuspensionen sanft und langsam. Lassen Sie die Empfängermäuse dann über Nacht ruhen.
5. Am folgenden Tag wird der LCMV-Armstrong-Virusbestand mit RPMI-Medium verdünnt, um eine Endkonzentration von 1 × 10⁷ plaquebildenden Einheiten/ml zu erreichen.
6. Injizieren Sie 100 μl verdünnte LCMV-Armstrong-Lösung (enthält 1 × 10⁶ plaquebildende Einheiten) in die Schwanzvene der Empfängermäuse.
   HINWEIS: Jeder Forscher sollte vorsichtig sein, ob der empfohlene infektiöse Titer nach institutionellem und lokalem Recht zulässig ist.

3. Durchflusszytometrische Färbungen von frühdifferenzierten SM T_FH-Zellen

1. Die Mäuse (gemäß institutionell anerkannten Protokollen) aus Schritt 2.6 am Tag 3 nach der Infektion töten und Lymphozyten aus der Milz wie in Schritt 1 beschrieben verarbeiten. Stellen Sie die Zelldichte auf ca. 2 × 10⁷ Zellen pro ml ein.
2. Laden Sie 50 μl Zellsuspensionen (~1 × 10⁶ Zellen) auf eine 96-Well-Platte mit rundem Boden und füllen Sie sie mit 150 μl Färbepuffer pro Vertiefung auf. Den Teller auf Eis legen.
3. Bereiten Sie den gereinigten Ratten-Anti-Maus-CXCR5-Antikörpercocktail (d. h. CXCR5-Primärantikörper) in einer Verdünnung von 1:50 in 50 μl T-FH-Zellfärbepuffer für jede Probe in einem Röhrchen zu. Das Röhrchen gründlich vortexen und bei 15.000 × g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren, um die Partikel zu aggregieren. Halten Sie die Tube auf Eis.
4. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 800 × g für 1 min bei 4 °C, verwerfen Sie den Überstand durch Dekantieren, wirbeln Sie die Platte kurz vor und fügen Sie 200 μl Färbepuffer pro Vertiefung hinzu.
5. Wiederholen Sie Schritt 3.4 und resuspendieren Sie die Zellen mit 50 μl des CXCR5-Primärantikörpers pro Well. Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und 1 h auf Eis inkubieren.
6. Bereiten Sie den biotinylierten Ziegen-Anti-Ratten-Antikörper-Cocktail (d. h. CXCR5-Sekundärantikörper) in einer Verdünnung von 1:200 in 50 μl T-FH-Zellfärbepuffer für jede Probe in einem neuen Röhrchen vor. Wirbeln Sie das Röhrchen vor und zentrifugieren Sie es bei 15.000 × g für 3 min bei 4 °C, um die Partikel zu aggregieren. Halten Sie die Tube auf Eis.
7. Die Platte wird 1 min lang bei 4 °C bei 800 × g zentrifugiert, der Überstand durch Dekantieren verworfen, die Platte kurz vortexen und 200 μl Färbepuffer pro Vertiefung zugegeben.
8. Wiederholen Sie Schritt 3.7 zweimal und halten Sie die Platte auf Eis.
9. Geben Sie 50 μl CXCR5-Sekundärantikörper pro Vertiefung in die Platte. Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und 30 Minuten auf Eis inkubieren.
10. Bereiten Sie fluoreszenzkonjugiertes Streptavidin (d. h. CXCR5-Tertiärantikörper) in einer Verdünnung von 1:200 in 50 μl T-FH-Zellfärbepuffer für jede Probe vor. In der Zwischenzeit fügen Sie weitere Antikörper gegen Oberflächenmarker (z. B. CD45.1, CD4, PD-1, CD25 und andere interessierte Moleküle) und die Färbung toter Zellen zusammen mit dem CXCR5-Tertiärantikörper hinzu.
11. Wirbeln Sie das Röhrchen vor und zentrifugieren Sie es bei 15.000 × g für 3 min bei 4 °C, um die Partikel zu aggregieren. Halten Sie die Tube auf Eis.
12. Die Platte wird 1 min lang bei 4 °C bei 800 × g zentrifugiert, der Überstand durch Dekantieren verworfen, die Platte kurz vortexen und 200 μl Färbepuffer pro Vertiefung zugegeben.
13. Wiederholen Sie Schritt 3.12 zweimal und halten Sie die Platte auf Eis.
14. Geben Sie 50 μl CXCR5-Tertiärantikörpercocktail pro Vertiefung auf die Platte. Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und 30 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubieren.
15. Bereiten Sie 200 μl Fixierungs-/Permeabilisierungspuffer für jede Vertiefung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
16. Die Platte wird 1 min lang bei 4 °C bei 800 × g zentrifugiert, der Überstand durch Dekantieren verworfen, die Platte kurz vortexen und 200 μl Färbepuffer pro Vertiefung zugegeben.
17. Wiederholen Sie Schritt 3.16 zweimal und lassen Sie die Platte im Dunkeln auf Eis.
18. Geben Sie 200 μl Fixierungs-/Permeabilisierungspuffer in jede Vertiefung. Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und 30 Minuten lang (im Dunkeln) bei Raumtemperatur inkubieren.
    HINWEIS: Bereiten Sie den Permeabilisierungspuffer (1x) gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
19. Bereiten Sie den Antikörpercocktail gegen transkriptionelle Faktoren, einschließlich Bcl-6, TCF-1, T-bet und andere interessierte Moleküle, in 50 μl Permeabilisierungspuffer (1x) für jede Vertiefung in einem neuen Röhrchen vor.
20. Das Röhrchen vortexen und bei 15.000 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren, um die Partikel zu aggregieren.
21. Die Platte wird 1 Minute lang bei 4 °C bei 800 × g zentrifugiert, der Überstand durch Dekantieren verworfen, die Platte kurz vortexen und 50 μl Transkriptionsfaktor-Antikörper-Cocktail pro Vertiefung zugegeben. Gut mischen und 30 min im Dunkeln auf Eis inkubieren.
22. Die Platte bei 800 × g 1 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand verwerfen, die Platte kurz durch Dekantieren vortexen und 200 μl Permeabilisierungspuffer (1x) pro Vertiefung hinzufügen.
23. Wiederholen Sie Schritt 3.22.
24. Geben Sie 200 μl Färbepuffer in jede Vertiefung, zentrifugieren Sie die Platte bei 800 × g für 1 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand durch Dekantieren und wirbeln Sie die Platte kurz ein.
25. Resuspendieren Sie das Zellpellet in jeder Vertiefung mit 200 μl Färbepuffer und überführen Sie die Zellen in Durchflusszytometrieröhrchen für die sofortige Durchflusszytometeranalyse.
    HINWEIS: Alternativ können die Proben innerhalb von 3 Tagen nachgewiesen werden, wenn 200 μl 2 % PFA in jedes Röhrchen gegeben und bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden.

4. Retrovirus-Produktion

1. Kultivieren Sie die 293T-Zellen (mit weniger als zehn Durchgängen) mit DMEM 10% Medium in einer 10-cm-Kulturschale für eine Dauer von 2-3 Durchgängen.
2. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreicht haben, entsorgen Sie das alte Medium und waschen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit PBS, gefolgt von einer kurzen Trypsinisierung von 293T-Zellen mit 1 ml 0,25 % Trypsin-EDTA bei Raumtemperatur für 1 min.
3. Stoppen Sie den Verdauungsprozess, indem Sie die Zellen in 2 mL vorgewärmtem 10%igem DMEM-Medium resuspendieren, sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführen und bei 200 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
4. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie das Kulturmedium mit 2 ml vorgewärmtem 10%igem DMEM-Medium auf und ab pipettieren.
5. Quantifizieren Sie die Anzahl der Zellen und der Platte: 5 × 10,⁵ Zellen in 2,5 mL 10 % DMEM-Medium pro Well in einer 6-Well-Platte.
   HINWEIS: Schwenken Sie die Schale vorsichtig, damit sich die 293T-Zellen gleichmäßig auf der Platte verteilen können.
6. Wenn die Konfluenz der 293T-Zellen 80 % übersteigt, bereiten Sie die Transfektionsreagenzien wie in den Schritten 4.7 bis 4.9 beschrieben vor.
7. Geben Sie für jede Vertiefung einer 6-Well-Platte 250 μl vorgewärmtes Opti-MEM-Medium in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. Geben Sie dann 3 μg Plasmid-DNA (davon 2 μg retroviraler Vektor und 1 μg pCL-Eco) in das Opti-MEM-Medium, gefolgt von einem sanften Auf- und Abpipettieren, um eine vollständige Mischung zu gewährleisten.
   HINWEIS: Die retroviralen Vektoren, die in dieser Studie als Beispiele verwendet werden, sind MigR1 und modifizierte MigR1-Vektoren mit Bcl6-CDS-Region stromaufwärts von IRES-GFP (MigR1-Bcl6).
8. Geben Sie anschließend 7,5 μl vorgewärmtes Transfektionsreagenz (kommerziell erhältlich) zu der Mischung und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten.
9. Die Mischung 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
10. Geben Sie die Mischung tropfenweise in verschiedene Bereiche der 293T-Zellkulturvertiefung und bewegen Sie das Kulturgefäß anschließend vorsichtig in einer Hin- und Her- und Seitwärtsbewegung, um eine gleichmäßige Verteilung der Mischung zu gewährleisten.
11. Die 293T-Zellen werden 72 Stunden lang in einem 37 °C-Inkubator mit 5 % CO₂ inkubiert.
12. Erkennen Sie den Tag des retroviralen Vektors als Proxy für die Transfektionswirksamkeit in den transfizierten 293T-Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop oder einer Durchflusszytometrie.
    HINWEIS: Zum Beispiel haben wir das GFP-Fluoreszenzsignal in einem signifikanten Teil der MigR1-Vektor-transfizierten 293T-Zellen bestätigt, was auf eine qualitativ hochwertige Transfektion hindeutet.
13. Sammeln Sie das Zellkulturmedium und zentrifugieren Sie es bei 2.500 × g für 10 Minuten bei 4 °C, um Zelltrümmer zu entfernen. Der resultierende Überstand sollte sorgfältig gesammelt und entweder für die Langzeitkonservierung bei -80 °C oder vorübergehend bei 4 °C gelagert werden.

5. In vivo Aktivierung, Retrovirus-Transduktion und adoptiver Transfer von SM CD4⁺ T-Zellen

1. Injizieren Sie einer CD45.1⁺ SM-Maus (im Alter von 6 bis 8 Wochen) intravenös 200 μg LCMV GP_61-77 Peptid^11,14 in einem Volumen von 100 μl RPMI-Medium.
   HINWEIS: Das Injektionsvolumen sollte von jedem Forscher geändert werden und darf das maximale Injektionsvolumen nicht überschreiten, das von der Institution und den örtlichen Gesetzen zugelassen ist.
2. Euthanasieren Sie die SM-Maus 16-18 h nach der Peptidinjektion (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen). Erwerben Sie die Milzzellen nach den oben genannten Verfahren in Schritt 1.
   HINWEIS: Alternativ kann das In-vitro-Anti-CD3/Anti-CD28-Stimulationsverfahren^27,28 verwendet werden, um SM CD4⁺ T-Zellen anstelle der in vivo Peptidstimulation zu aktivieren, die in den Schritten 5.1 und 5.2 beschrieben ist.
3. Suspendieren Sie die Splenozyten mit 2 % RPMI und stellen Sie die Zelldichte auf ca. 1 × 10⁸ Zellen pro ml in einem konischen 15-ml-Röhrchen ein. Halten Sie die Tube auf Eis.
4. Geben Sie 50 μl Zellsuspension in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden und ergänzen Sie sie mit 150 μl Färbepuffer pro Well.
5. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 800 × g für 1 min bei 4 °C, um die Zellen zu pelletieren, entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Dekantieren, wirbeln Sie die Platte kurz vor und fügen Sie 200 μl Färbepuffer pro Vertiefung hinzu.
6. Wiederholen Sie Schritt 5.5 und resuspendieren Sie die Zellen mit 50 μl Oberflächenantikörper-Cocktail, einschließlich CD4, CD25 und CD69, um den Aktivierungsstatus von SM CD4⁺ T-Zellen zu ermitteln. Gründlich mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und 30 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubieren.
7. Füllen Sie jede Vertiefung mit Färbepuffer auf 200 μl auf, gefolgt von einer Zentrifugation der Platte bei 800 × g für 1 Minute bei 4 °C. Den Überstand durch Dekantieren entsorgen und die Platte kurz umwirbeln.
8. Wiederholen Sie Schritt 5.7 zweimal.
9. Die Zellen werden in 200 μl Färbepuffer resuspendiert und in ein Durchflusszytometrieröhrchen überführt.
10. Analysieren Sie die fluoreszenzkonjugierten Antikörper-gefärbten Zellen mit einer Durchflusszytometrie, um den Aktivierungsstatus von SM CD4⁺ T-Zellen zu beurteilen.
    HINWEIS: Aktivierte SM CD4⁺ T-Zellen wiesen im Vergleich zu naiven Zellen eine hohe CD25- und CD69-Expression auf, was nachfolgende Transduktionsverfahren ermöglichte.
11. 1 × 10⁶ SM CD4⁺ T-Zellen (aus Schritt 5.3) pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte geben. Die Zellen bei 800 × g 3 min bei 4 °C herunterschleudern und dann das Medium vorsichtig durch Dekantieren entfernen.
12. 1 ml Retrovirusmedium wie in Schritt 4.13 beschrieben und 8 μg Polybren in jede Vertiefung geben.
13. Die Zellen werden bei 800 × g für 2 h bei 37 °C spin-transduziert.
14. Verwerfen Sie das Retrovirusmedium vorsichtig durch Pipettieren und geben Sie 1 ml vorgewärmtes 10 % RPMI, ergänzt mit 10 ng/ml, rekombinantes murines IL-2 in jede Vertiefung.
15. Inkubieren Sie die Zellen 48 h lang in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂.
16. Die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen geben und die Zellen bei 800 × g für 6 min bei 4 °C abschleudern.
17. Entfernen Sie den Überstand durch Dekantieren und resuspendieren Sie die Zellen mit einem geeigneten Volumen von 2 % RPMI, um eine Zelldichte von 1 × 10⁸ Zellen pro ml in einem konischen 15-ml-Röhrchen zu erhalten. Halten Sie die Tube auf Eis.
18. Geben Sie 50 μl Zellsuspension in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden und ergänzen Sie sie mit 150 μl Färbepuffer pro Well.
19. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 800 × g für 1 min bei 4 °C, um die Zellen zu pelletieren, entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Dekantieren, wirbeln Sie die Platte kurz vor und fügen Sie 200 μl Färbepuffer pro Vertiefung hinzu.
20. Wiederholen Sie Schritt 5.19 und resuspendieren Sie die Zellen mit 50 μl Oberflächenantikörper-Cocktail, einschließlich CD4, Vα2 und Vektor-Tag-assoziiertem Antikörper. Gründlich mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und 30 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubieren.
21. Füllen Sie jede Vertiefung mit Färbepuffer auf 200 μl auf, gefolgt von einer Zentrifugation der Platte bei 800 × g für 1 min. Den Überstand durch Dekantieren entsorgen und die Platte kurz umwirbeln.
22. Wiederholen Sie Schritt 5.21 zweimal.
23. Die Zellen werden in 200 μl Färbepuffer resuspendiert und in ein Durchflusszytometrieröhrchen überführt.
24. Analysieren Sie die fluoreszenzkonjugierten Antikörper-gefärbten Zellen mit Durchflusszytometrie, um die Transduktionseffizienz in SM CD4⁺ T-Zellen zu beurteilen.
    HINWEIS: Effizient transduzierte SM CD4⁺ T-Zellen zeigten in der Studie eine hohe Expression des Tags von Retroviren, wie z. B. GFP.
25. Die Zellsuspensionen aus Schritt 5.17 bei 800 × g werden 5 min lang bei 4 ΰC zentrifugiert und der Überstand durch Dekantieren verworfen. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit RPMI und stellen Sie die Zelldichte auf 1 ×^{10 7} CD4⁺Vα2⁺ SM-Zellen/ml ein.
26. Übertragen Sie adoptiv eine Gesamtanzahl von 1 × 10 CD45.1⁺ SM CD4⁺ T-Zellen auf jede C57BL/6-Empfängermaus (6 bis 8 Wochen alt) durch eine intravenöse Injektion von 100 μl Zellsuspension in Schritt 5.25.
27. Am nächsten Tag infizieren Sie C57BL/6-Empfängermäuse mit 1 × 10⁶ plaquebildenden Einheiten LCMV Armstrong durch intravenöse Injektion.

6. Durchflusszytometrische Analyse von Retrovirus-transduzierten SM T_FH-Zellen im frühen akuten LCMV-Infektionsstadium

1. Erwerben Sie die Splenozyten von C57BL/6-Mäusen aus Schritt 5.25 am Tag 3 nach der Infektion.
2. Führen Sie eine Durchflusszytometrie-Färbung von Oberflächenmarkern, einschließlich CD4, CD45.1, CXCR5, CD25 und anderen interessierten Molekülen, in Splenozyten durch, wie in Schritt 3 beschrieben.
3. Für den Nachweis von Transkriptionsfaktoren in SM CD4⁺ T-Zellen, die mit Retroviren transduziert wurden, die durch fluoreszierende Proteine markiert sind, geben Sie 200 μl 2 % PFA in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
4. Führen Sie eine Fixierung/Permeabilisierung, eine durchflusszytometrische Färbung der interessierten Transkriptionsfaktoren und eine durchflusszytometrische Analyse durch, wie in Schritt 3 beschrieben.

Ergebnisse

Eigenschaften von früh differenzierten virusspezifischen_T-FH-Zellen während einer akuten LCMV-Infektion
Um die frühe Schicksalsbindung von virusspezifischen_T-FH-Zellen zu untersuchen, wurden naive kongene SM CD4⁺ T-Zellen, die spezifisch das LCMV-GP-Epitop I-A^bGP_66-77 erkennen, adoptiv in CD45.2⁺ C57BL/6-Empfänger übertragen. Am nächsten Tag wurden diese Empfänger intravenös mit einer hohen Dosierung des akut aufgelösten LCMV A...

Diskussion

Die Forschung auf dem Gebiet der_T-FH-Zellen ist seit der Entdeckung der spezialisierten Funktion von_T-FH-Zellen bei der Unterstützung von B-Zellen hervorgehoben worden. Häufende Studien deuteten darauf hin, dass die_{T-FH-Zelldifferenzierung} ein mehrstufiger und multifaktorieller Prozess³⁰ ist, wobei die Schicksalsbindung der_T-FH-Zellen im frühen Stadium bestimmt wird⁵. Daher ist ein besseres Verständnis der Mechanismen, die fr?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Corning	25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA	Beyotime	P0099-500mL
70 μm cell strainer	Merck	CLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)	Biolegend	127812	1:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)	Biolegend	110724	1:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)	Biolegend	101910	1:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse	The Jackson Laboratory	002014
BeaverBeads Streptavidin	Beaver	22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)	Biolegend	123106	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)	Biolegend	117304	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)	Biolegend	115504	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)	Biolegend	108704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)	Biolegend	116204	1:200 dilution
bovine serum albumin, BSA	Sigma	A7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)	Biolegend	644816	1:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)	Biolegend	135220	1:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouse	The Jackson Laboratory	000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouse			In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% medium			DMEM medium containing 10% FBS
DMEM medium	Gibco	11885092
EDTA	Sigma	E9884
FACSFortesa	BD Biosciences
Fetal bovine serum, FBS	Sigma	F8318
FlowJo (version 10.4.0)	BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	Invitrogen	00-5523-00	The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated	Vector laboratories	BA-9400-1.5	1:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific
Isolation buffer			FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)	Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199	1:200 dilution
MigR1	addgene	#27490
NaN3	Sigma	S2002
Opti-MEM medium	Gibco	31985070
pCL-Eco	addgene	#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)	Biolegend	104508	1:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)	BD Biosciences	561522	1:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBS	Gibco	10010072
Polybrene	Solarbio	H8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)	BD Biosciences	551961	1:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)	Biolegend	100538	1:200 dilution
recombinant murine IL-2	Gibco	212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis Buffer	Beyotime	C3702-500mL
RPMI 1640 medium	Sigma	R8758
RPMI 2%			RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouse			SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining buffer			PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7	eBioscience	25-4317-82	1:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)	Cell signaling technology	6444S	1:400 dilution
TFH cell staining buffer			FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagent	Mirus Bio	MIRUMIR2700