Acceso a la diferenciación temprana de células T CD4+ auxiliares foliculares específicas del virus en ratones infectados con LCMV agudo

Resumen

El estudio actual muestra protocolos para evaluar el compromiso del destino temprano de las células T_FH específicas del virus y manipular la expresión génica en estas células.

Resumen

Las células T auxiliares foliculares (T_FH) se perciben como un linaje independiente de células T CD4⁺ que ayuda a las células B afines a producir anticuerpos de alta afinidad, estableciendo así una inmunidad humoral a largo plazo. Durante la infección viral aguda, el compromiso del destino de las células T_FH específicas del virus se determina en la fase temprana de infección, y las investigaciones de las células T_FH diferenciadas tempranamente son cruciales para comprender la inmunidad humoral dependiente de las células T y optimizar el diseño de la vacuna. En el estudio, utilizando un modelo de ratón de infección por el virus de la coriomeningitis linfocítica aguda (LCMV) y el ratón transgénico TCR SMARTA (SM) con linfocitos T CD4⁺ que reconocen específicamente el epítopo de glicoproteína LCMV^{I-A b}GP_66-77, describimos procedimientos para acceder al compromiso del destino temprano de los linfocitos T_FH específicos del virus basados en tinciones por citometría de flujo. Además, mediante la explotación de la transducción retroviral de células T SM CD4⁺ , también se proporcionan métodos para manipular la expresión génica en células T_FH específicas del virus diferenciadas tempranamente. Por lo tanto, estos métodos ayudarán en los estudios que exploran los mecanismos que subyacen al compromiso temprano de las células T_FH específicas del virus.

Introducción

Al encontrarse con diferentes patógenos o amenazas, las células T CD4⁺ ingenuas adaptan sus respuestas inmunitarias diferenciándose en varios subconjuntos de células T (T_H) auxiliares^{con funciones} especializadas. En el escenario de infección viral aguda, una gran parte de las células T CD4⁺ vírgenes se diferencian en células T auxiliares foliculares (T_FH) que proporcionan ayuda a las células B ^2,3. A diferencia de otros subconjuntos de células T_H CD4⁺ (por ejemplo, células T_H1, T_H2, T_H9 y ....

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo siguiendo los procedimientos aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Tercera Universidad Médica Militar. En el presente estudio se utilizaron las siguientes cepas de ratón: ratón C57BL/6J (B6) (ambos sexos), de 6 a 8 semanas de edad, con un peso de 25-30 g; Ratón transgénico CD45.1⁺SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgénico), ambos sexos, de 6 a 8 semanas de edad, con un peso de 25-30 g; y ratón transgénico CXCR5-GFP CD45.1⁺SM TCR (transgénico B6 CD45.1 × SM TCR × CXCR5-GFP knock-in), ambos sexos, de 6 a 8 semanas de edad, con un peso de 25-30 g. Las especies ....

Discusión

La investigación en el campo de las células T_FH se ha destacado desde el descubrimiento de la función especializada de las células T_FH para ayudar a las células B. Los estudios acumulados indicaron que la diferenciación de las células T_FH es un proceso multietapa y multifactorial³⁰, en el que el compromiso con el destino de las células T_FH se determina en la etapa temprana⁵. Por lo tanto, una mejor comprensión de los meca.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Corning	25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA	Beyotime	P0099-500mL
70 μm cell strainer	Merck	CLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)	Biolegend	127812	1:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)	Biolegend	110724	1:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)	Biolegend	101910	1:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse	The Jackson Laboratory	002014
BeaverBeads Streptavidin	Beaver	22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)	Biolegend	123106	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)	Biolegend	117304	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)	Biolegend	115504	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)	Biolegend	108704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)	Biolegend	116204	1:200 dilution
bovine serum albumin, BSA	Sigma	A7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)	Biolegend	644816	1:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)	Biolegend	135220	1:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouse	The Jackson Laboratory	000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouse			In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% medium			DMEM medium containing 10% FBS
DMEM medium	Gibco	11885092
EDTA	Sigma	E9884
FACSFortesa	BD Biosciences
Fetal bovine serum, FBS	Sigma	F8318
FlowJo (version 10.4.0)	BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	Invitrogen	00-5523-00	The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated	Vector laboratories	BA-9400-1.5	1:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific
Isolation buffer			FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)	Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199	1:200 dilution
MigR1	addgene	#27490
NaN3	Sigma	S2002
Opti-MEM medium	Gibco	31985070
pCL-Eco	addgene	#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)	Biolegend	104508	1:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)	BD Biosciences	561522	1:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBS	Gibco	10010072
Polybrene	Solarbio	H8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)	BD Biosciences	551961	1:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)	Biolegend	100538	1:200 dilution
recombinant murine IL-2	Gibco	212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis Buffer	Beyotime	C3702-500mL
RPMI 1640 medium	Sigma	R8758
RPMI 2%			RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouse			SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining buffer			PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7	eBioscience	25-4317-82	1:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)	Cell signaling technology	6444S	1:400 dilution
TFH cell staining buffer			FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagent	Mirus Bio	MIRUMIR2700