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要約

現在の研究では、ウイルス特異的TFH 細胞の早期運命コミットメントを評価し、これらの細胞における遺伝子発現を操作するためのプロトコルを示しています。

要約

濾胞性ヘルパーT(TFH)細胞は、同族のB細胞が高親和性抗体を産生するのを助ける独立したCD4+ T細胞系統として認識され、したがって長期的な液性免疫を確立します。急性ウイルス感染時には、ウイルス特異的TFH細胞の運命コミットメントは感染初期段階で決定され、早期分化型TFH細胞の研究は、T細胞依存性体液性免疫を理解し、ワクチン設計を最適化するために重要です。本研究では、急性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)感染のマウスモデルと、LCMV糖タンパク質エピトープI-AbGP66-77を特異的に認識するCD4+ T細胞を持つTCRトランスジェニックSMARTA(SM)マウスを用いて、フローサイトメトリー染色に基づくウイルス特異的TFH細胞の早期運命コミットメントにアクセスする手順を記述しました。さらに、SM CD4+ T細胞のレトロウイルス形質導入を利用することにより、早期分化型ウイルス特異的TFH細胞の遺伝子発現を操作する方法も提供されています。したがって、これらの方法は、ウイルス特異的TFH細胞の早期関与の根底にあるメカニズムを探求する研究に役立ちます。

概要

さまざまな病原体や脅威に遭遇すると、ナイーブなCD4+ T細胞は、特殊な機能を持つさまざまなヘルパーT(TH)細胞サブセットに分化することにより、免疫応答を調整します1。急性ウイルス感染のシナリオでは、ナイーブCD4+ T細胞の大部分が、B細胞2,3を助ける濾胞性ヘルパーT(TFH)細胞に分化します。他のCD4+ TH細胞サブセット(例えば、TH1、TH2、TH9、およびTH17細胞)とは異なり、TFH細胞は、B細胞ホーミングケモカインCXCL13のケモカイン受容体であるCXCR5をかなり発現し、TFH細胞がB細胞卵胞に移動することを可能にします。B細胞濾胞では、TFH細胞は同族のB細胞が胚中心反応を開始および維持するのを助け、したがって、迅速な高親和性抗体産生と長期体液性記憶を可能にする2,3。

急性

プロトコル

すべての動物実験は、第三軍事医科大学の動物管理委員会および使用委員会によって承認された手順に従って実施されました。本研究では、次のマウス系統が使用されました:C57BL / 6J(B6)マウス(両性別)、6〜8週齢、体重25〜30 g。CD45.1+SM TCRトランスジェニックマウス(B6 CD45.1 × SM TCRトランスジェニック)、両性別、6〜8週齢、体重25〜30g;およびCXCR5-GFP CD45.1+SM TCRトランスジェニックマウス(B6 CD45.1 × SM TCRトランスジェニック×CXCR5-GFPノックイン)、両性別、6〜8週齢、体重25〜30 g。トランスジェニック種は、以前に発表された報告24に従って作製されました。本試験で使用した試薬、バッファー、機器の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 養子移しのためのCD45.1+ SM CD4+ T細胞の採取

  1. 必要な数の6〜8週齢のCD45.1 + TCRトランスジェニックSMマウス24を安楽死させます(施設で承認されたプロトコルに従って)。安楽死させたマウスの腹壁の....

代表的な結果

急性LCMV感染時の早期分化型ウイルス特異的TFH 細胞の特徴
ウイルス特異的TFH細胞の早期運命関与を調べるために、LCMV GPエピトープI-AbGP66-77を特異的に認識するナイーブコンジェニックSM CD4+ T細胞をCD45.2+ C57BL/6レシピエントに養子として移植した。翌日、これらのレシピエントは、急性分解されたLCMVアームストロングの高用量で?.......

ディスカッション

TFH 細胞の分野における研究は、B細胞を助ける上でのTFH 細胞の特殊な機能の発見以来、注目されてきました。蓄積された研究は、TFH 細胞の分化が多段階かつ多因子のプロセス30であり、ここでTFH 細胞の運命コミットメントが初期段階で決定されることを示しました5。したがって、早期分化型TFH 細胞の根底にあるメ.......

開示事項

著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金会(No. 32300785 to X.C.)、China National Postdoctoral Program for Innovative Talents(中国国家革新的才能博士課程プログラム)からの助成金を受けて行われました。BX20230449からX.C.)、および国立科学技術メジャープロジェクト(No.2021YFC2300602からL.Y.)。

....

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTACorning25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFABeyotimeP0099-500mL
70 μm cell strainerMerckCLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)Biolegend1278121:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)Biolegend1107241:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)Biolegend1019101:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouseThe Jackson Laboratory002014
BeaverBeads StreptavidinBeaver22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)Biolegend1231061:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)Biolegend1173041:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)Biolegend1155041:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)Biolegend1007041:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)Biolegend1087041:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)Biolegend1162041:200 dilution
bovine serum albumin, BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)Biolegend6448161:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)Biolegend1352201:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouseThe Jackson Laboratory000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouseIn house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% mediumDMEM medium containing 10% FBS
DMEM mediumGibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
Fetal bovine serum, FBSSigmaF8318
FlowJo (version 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SetInvitrogen00-5523-00The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), BiotinylatedVector laboratoriesBA-9400-1.51:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging SystemThermoFisher Scientific
Isolation bufferFACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitationLife TechnologiesL101991:200 dilution
MigR1addgene#27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM mediumGibco31985070
pCL-Ecoaddgene#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)Biolegend1045081:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)BD Biosciences5615221:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)BD Biosciences5519611:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)Biolegend1005381:200 dilution
recombinant murine IL-2Gibco212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis BufferBeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 mediumSigmaR8758
RPMI 2%RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouseSM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining bufferPBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7eBioscience25-4317-821:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) Cell signaling technology6444S1:400 dilution
TFH cell staining bufferFACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagentMirus BioMIRUMIR2700

参考文献

  1. O'shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
  2. Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of di....

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