Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Temsili Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mevcut çalışma, virüse özgü TFH hücrelerinin erken kader bağlılığını değerlendirmek ve bu hücrelerde gen ekspresyonunu manipüle etmek için protokoller göstermektedir.

Özet

Foliküler Yardımcı T (TFH) hücreleri, aynı kökenli B hücrelerinin yüksek afiniteli antikorlar üretmesine yardımcı olan ve böylece uzun süreli humoral bağışıklık sağlayan bağımsız bir CD4+ T hücre soyu olarak algılanır. Akut viral enfeksiyon sırasında, virüse özgü TFH hücrelerinin kader taahhüdü erken enfeksiyon fazında belirlenir ve erken diferansiye TFH hücrelerinin araştırılması, T hücresine bağımlı humoral bağışıklığın anlaşılmasında ve aşı tasarımının optimize edilmesinde çok önemlidir. Çalışmada, akut lenfositik koriomenenjit virüsü (LCMV) enfeksiyonunun bir fare modeli ve LCMV glikoprotein epitopu I-AbGP66-77'yi spesifik olarak tanıyan CD4 + T hücrelerine sahip TCR-transgenik SMARTA (SM) faresi kullanılarak, akış sitometrisi boyamalarına dayalı olarak virüse özgü TFH hücrelerinin erken kader taahhüdüne erişmek için prosedürleri tanımladık. Ayrıca, SM CD4 + T hücrelerinin retroviral transdüksiyonundan yararlanılarak, erken farklılaşmış virüse özgü TFH hücrelerinde gen ekspresyonunu manipüle etmek için yöntemler de sağlanmaktadır. Bu nedenle, bu yöntemler, virüse özgü TFH hücrelerinin erken bağlılığının altında yatan mekanizma(lar)ı araştıran çalışmalara yardımcı olacaktır.

Giriş

Farklı patojenler veya tehditlerle karşılaşan saf CD4 + T hücreleri, özel işlevlere sahip çeşitli yardımcı T (TH ) hücre alt kümelerine farklılaşarak bağışıklık tepkilerini uyarlar1. Akut viral enfeksiyon senaryosunda, naif CD4+ T hücrelerinin büyük bir kısmı, B hücrelerine yardım sağlayan foliküler yardımcı T (TFH) hücrelerine farklılaşır 2,3. Diğer CD4 + T H hücre alt kümelerinden farklı olarak (örneğin, TH1, TH2, TH9 ve TH17 hücreleri), TFH hücreleri, B hücresi hom....

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanan prosedürler izlenerek gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada aşağıdaki fare suşları kullanılmıştır: C57BL/6J (B6) fare (her iki cinsiyet), 6 ila 8 haftalık, 25-30 g ağırlığında; CD45.1+SM TCR transgenik fare (B6 CD45.1 × SM TCR transgenik), her iki cinsiyet, 6 ila 8 haftalık, 25-30 g ağırlığında; ve CXCR5-GFP CD45.1+SM TCR transgenik fare (B6 CD45.1 × SM TCR transgenik × CXCR5-GFP knock-in), her iki cinsiyet, 6 ila 8 haftalık, 25-30 g ağırlığında. Transgenik türler, daha önce yayınlanmış bir raporun ardından üretildi

Temsili Sonuçlar

Akut LCMV enfeksiyonu sırasında erken diferansiye virüse özgü TFH hücrelerinin özellikleri
Virüse özgü TFH hücrelerinin erken kader bağlılığını araştırmak için, LCMV GP epitopu IAbGP66-77'yi spesifik olarak tanıyan naif konjenik SM CD4+ T hücreleri, CD45.2+ C57BL / 6 alıcılarına evlat edinerek aktarıldı. Ertesi gün, bu alıcılara intravenöz olarak yüksek dozda akut rezolüsyonlu LCMV Armstrong enjekte edil.......

Tartışmalar

TFH hücreleri alanındaki araştırmalar, TFH hücrelerinin B hücrelerine yardımcı olmada özel işlevinin keşfedilmesinden bu yana vurgulanmıştır. Biriken çalışmalar, TFH hücre farklılaşmasının çok aşamalı ve çok faktörlü bir süreçolduğunu göstermiştir 30, burada TFH hücre kaderi taahhüdü erken evre5'te belirlenir. Bu nedenle, erken diferansiye TFH hücrelerinin altında yatan mekanizmalar.......

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 32300785 - X.C.), Çin Ulusal Yenilikçi Yetenekler Doktora Sonrası Programı (No. BX20230449'den X.C.'ye) ve Ulusal Bilim ve Teknoloji Büyük Projesi (No. 2021YFC2300602'den L.Y.'ye).

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTACorning25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFABeyotimeP0099-500mL
70 μm cell strainerMerckCLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)Biolegend1278121:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)Biolegend1107241:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)Biolegend1019101:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouseThe Jackson Laboratory002014
BeaverBeads StreptavidinBeaver22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)Biolegend1231061:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)Biolegend1173041:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)Biolegend1155041:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)Biolegend1007041:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)Biolegend1087041:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)Biolegend1162041:200 dilution
bovine serum albumin, BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)Biolegend6448161:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)Biolegend1352201:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouseThe Jackson Laboratory000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouseIn house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% mediumDMEM medium containing 10% FBS
DMEM mediumGibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
Fetal bovine serum, FBSSigmaF8318
FlowJo (version 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SetInvitrogen00-5523-00The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), BiotinylatedVector laboratoriesBA-9400-1.51:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging SystemThermoFisher Scientific
Isolation bufferFACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitationLife TechnologiesL101991:200 dilution
MigR1addgene#27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM mediumGibco31985070
pCL-Ecoaddgene#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)Biolegend1045081:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)BD Biosciences5615221:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)BD Biosciences5519611:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)Biolegend1005381:200 dilution
recombinant murine IL-2Gibco212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis BufferBeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 mediumSigmaR8758
RPMI 2%RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouseSM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining bufferPBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7eBioscience25-4317-821:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) Cell signaling technology6444S1:400 dilution
TFH cell staining bufferFACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagentMirus BioMIRUMIR2700

Referanslar

  1. O'shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
  2. Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of di....

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Folik ler Yard mc T TFH H creleriVir se zg TFH H creleriAkut Viral EnfeksiyonLCMV EnfeksiyonuSMARTA FareTCR transgenikErken Kader Ba l lFlow SitometriRetroviral Transd ksiyonGen Ekspresyon Manip lasyonu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır