Akut LCMV ile Enfekte Farelerde Virüse Özgü Foliküler Yardımcı CD4+ T Hücresinin Erken Farklılaşmasına Erişim

Özet

Mevcut çalışma, virüse özgü T_FH hücrelerinin erken kader bağlılığını değerlendirmek ve bu hücrelerde gen ekspresyonunu manipüle etmek için protokoller göstermektedir.

Özet

Foliküler Yardımcı T (T_FH) hücreleri, aynı kökenli B hücrelerinin yüksek afiniteli antikorlar üretmesine yardımcı olan ve böylece uzun süreli humoral bağışıklık sağlayan bağımsız bir CD4⁺ T hücre soyu olarak algılanır. Akut viral enfeksiyon sırasında, virüse özgü T_FH hücrelerinin kader taahhüdü erken enfeksiyon fazında belirlenir ve erken diferansiye T_FH hücrelerinin araştırılması, T hücresine bağımlı humoral bağışıklığın anlaşılmasında ve aşı tasarımının optimize edilmesinde çok önemlidir. Çalışmada, akut lenfositik koriomenenjit virüsü (LCMV) enfeksiyonunun bir fare modeli ve LCMV glikoprotein epitopu I-A^bGP_66-77'yi spesifik olarak tanıyan CD4 ⁺ T hücrelerine sahip TCR-transgenik SMARTA (SM) faresi kullanılarak, akış sitometrisi boyamalarına dayalı olarak virüse özgü T_FH hücrelerinin erken kader taahhüdüne erişmek için prosedürleri tanımladık. Ayrıca, SM CD4 ⁺ T hücrelerinin retroviral transdüksiyonundan yararlanılarak, erken farklılaşmış virüse özgü T_FH hücrelerinde gen ekspresyonunu manipüle etmek için yöntemler de sağlanmaktadır. Bu nedenle, bu yöntemler, virüse özgü T_FH hücrelerinin erken bağlılığının altında yatan mekanizma(lar)ı araştıran çalışmalara yardımcı olacaktır.

Giriş

Farklı patojenler veya tehditlerle karşılaşan saf CD4 ⁺ T hücreleri, özel işlevlere sahip çeşitli yardımcı T (_TH ) hücre alt kümelerine farklılaşarak bağışıklık tepkilerini uyarlar¹. Akut viral enfeksiyon senaryosunda, naif CD4⁺ T hücrelerinin büyük bir kısmı, B hücrelerine yardım sağlayan foliküler yardımcı T (T_FH) hücrelerine farklılaşır ^2,3. Diğer CD4 ⁺ _{T H} hücre alt kümelerinden farklı olarak (örneğin, T_H1, T_H2, T_H9 ve T_H17 hücreleri), T_FH hücreleri, B hücresi homing kemokin CXCL13 için kemokin reseptörü olan önemli bir CXCR5 seviyesini eksprese eder ve T_FH hücrelerinin B hücresi foliküllerine göç etmesini sağlar. B hücre foliküllerinde, T_FH hücreleri, germinal merkez reaksiyonlarını başlatmada ve sürdürmede aynı kökenli B hücrelerine yardımcı olur, böylece hızlı yüksek afiniteli antikor üretimi ve uzun süreli humoral hafıza^{sağlar 2,3}.

Akut viral enfeksiyon üzerine, virüse özgü T_FH hücrelerinin erken kader taahhüdü 72 saat ^4,5 içinde gerçekleşir ve T_FH hücresi kader kararlarını yöneten "ana düzenleyici" olarak görev yapan transkripsiyonel baskılayıcı B hücreli lenfoma-6 (Bcl-6)^5,6,7,8 tarafından kontrol edilir. Bcl-6 eksikliği, T_FH hücre farklılaşmasını ciddi şekilde köreltirken, ektopik Bcl-6 ekspresyonu, T_FH hücre kaderi bağlılığını önemli ölçüde arttırır. Bcl-6'ya ek olarak, erken T_FH hücre kaderi taahhüdünün talimatında birden fazla molekül yer alır. Transkripsiyon faktörleri TCF-1 ve LEF-1, Bcl-6 ^9,10,11'in indüksiyonu yoluyla T_FH hücre farklılaşmasını başlatır. Blimp1'in hem Bcl-6 hem de TCF-1 tarafından inhibisyonu, erken T_FH hücre kader taahhüdü^11,12 için gereklidir. Erken T_FH hücre farklılaşması için STAT1 ve STAT3 de gereklidir¹³. Ayrıca, histon metiltransferaz EZH2^14,15 ve m6A metiltransferaz METTL3¹⁶ ile yapılan epigenetik modifikasyonlar, T_FH hücre transkripsiyonel programlarını (özellikle Bcl6 ve Tcf7) stabilize etmeye ve böylece erken T_FH hücre kader bağlılığını artırmaya yardımcı olur. Yukarıda bahsedilen moleküller ve diğerleri de dahil olmak üzere, başka bir yerde^{özetlenen ilerlemeler} kaydedilmiş olsa da, erken T_FH hücre kaderi bağlılığının transkripsiyonel ve epigenetik düzenlemelerini anlamada ilerlemeler kaydedilmiş olsa da, daha önce bilinmeyen moleküller öğrenilmeyi beklemektedir.

Akut lenfositik koryomenenjit virüsü (LCMV) enfeksiyonunun fare modelinde, LCMV glikoprotein epitopu I-A^bGP_66-77'yi spesifik olarak tanıyan evlat edinilmiş konjenik TCR-transgenik SMARTA (SM) CD4 ⁺ T hücreleri, viral enfeksiyon sırasında T_FH veya T_H1 hücre farklılaşmasına uğrar. Bu T_FH / T_H1 çatallanma farklılaşma modeli, virüse özgü T_FH hücrelerinin biyolojisini incelemede SM / akut LCMV enfeksiyon modelinin ilerlemesini destekler. Gerçekten de, SM / akut LCMV enfeksiyon modeli, T_FH hücre araştırma alanında yaygın olarak kullanılmaktadır ve T_FH hücre biyolojisindeki kilometre taşı keşiflerinde çok önemli bir rol oynamıştır. Bu, yukarıda bahsedilen Bcl-6'nın T_FH hücrelerinin ^5,6 soy tanımlayıcı transkripsiyon faktörü olarak tanımlanmasını ve ayrıca diğer önemli transkripsiyonel faktörleri (örneğin, Blimp-1⁶, TCF-1 / LEF ^9,10,11, STAT1 / STAT3¹³, STAT5¹⁷, KLF2¹⁸ ve Itch¹⁹) T_FH hücre farklılaşmasına, transkripsiyon sonrası düzenlemelere ( örneğin, METTL3¹⁶ ve miR-17 ~ 92²⁰) T_FH hücre farklılaşması, T_FH hücre hafızası ve plastisite^21,22 ve T_FH hücrelerini hedefleyen rasyonel aşılama stratejileri (örneğin, selenyum²³).

Mevcut çalışma, (1) erken farklılaşmış T_FH hücrelerine erişmek için uygun akut LCMV ile enfekte SM kimera fare modelinin oluşturulması, (2) erken farklılaşmış T_FH hücrelerine ilişkin moleküllerin akış sitometrisi boyamalarının yürütülmesi ve (3) SM CD4 ⁺ 'da retroviral vektör tabanlı gen manipülasyonu gerçekleştirme dahil olmak üzere, virüse özgü T_FH hücrelerinin erken kader taahhüdüne erişmek için tekrarlanabilir yöntemleri açıklamaktadır T hücreleri. Bu yöntemler, virüse özgü T_FH hücrelerinin erken kader bağlılığını araştıran çalışmalar için faydalı olacaktır.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanan prosedürler izlenerek gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada aşağıdaki fare suşları kullanılmıştır: C57BL/6J (B6) fare (her iki cinsiyet), 6 ila 8 haftalık, 25-30 g ağırlığında; CD45.1⁺SM TCR transgenik fare (B6 CD45.1 × SM TCR transgenik), her iki cinsiyet, 6 ila 8 haftalık, 25-30 g ağırlığında; ve CXCR5-GFP CD45.1⁺SM TCR transgenik fare (B6 CD45.1 × SM TCR transgenik × CXCR5-GFP knock-in), her iki cinsiyet, 6 ila 8 haftalık, 25-30 g ağırlığında. Transgenik türler, daha önce yayınlanmış bir raporun ardından üretildi²⁴. Çalışmada kullanılan reaktiflerin, tamponların ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Evlat edinen transfer için CD45.1 ⁺ SM CD4 ⁺ T hücrelerinin toplanması

1. Ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) gerekli sayıda 6 ila 8 haftalık CD45.1 ⁺ TCR transgenik SM fareleri²⁴. Ötenazi yapılan farelerin periton duvarının solunda cerrahi makasla 1 inçlik bir kesi yapın, dalakları peritondan ayırın ve dalağın arkasındaki bağ dokusunu yırtın^25,26.
2. Her dalağı bir Petri kabı (60 mm × 15 mm) içindeki 70 μm'lik bir hücre süzgecine yerleştirin ve dalağı 1 mL'lik bir şırınga pistonu kullanarak 3 mL kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponu ile öğütün.
   NOT: Sadece bağ dokusu kalana kadar dalağı öğütmek için şırınga pistonunun yuvarlak tarafını kullanın.
3. 3 mL RBC lizis tamponunu seyreltmek için her tabağa 6 mL RPMI +% 2 FBS (% 2 RPMI) ekleyin. Hücre süspansiyonlarını tabaktan 15 mL'lik konik bir tüpe pipetleyin. Çanağı ek olarak 3 mL %2 RPMI ile durulayın ve aynı konik tüpe aktarın.
4. Hücre süspansiyonlarını 800 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı dekantasyon yoluyla atın. Hücreleri bir izolasyon tamponu ile yeniden askıya alın ve hücre yoğunluğunu mL başına ~ 1 × 10⁸ hücre olarak ayarlayın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin.
5. CD4 ⁺ T hücrelerinin zenginleştirilmesi için izolasyon tamponunda CD8a, CD19, NK1.1, F4 / 80, CD11c ve Ter119'a karşı 1x biyotinile antikor kokteyli hazırlayın.
   NOT: Biyotinile antikorları, Malzeme Tablosunda belirtildiği gibi belirtilen seyreltmede izolasyon tamponuna ekleyin. Antikor kokteylinin hacmini, adım 1.4'teki izolasyon tamponunun hacmiyle aynı tutun.
6. Hücre süspansiyonlarını 800 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı dekantasyon yoluyla atın.
7. Konik tüpte belirtilen 1x biyotinile antikor kokteyli ile hücre peletini yeniden süspanse edin.
8. Konik boruyu 45 rpm'de 30 dakika boyunca bir çalkalayıcıda buzun üzerine koyun.
9. Biyotinile antikorlarla inkübasyon sırasında, üreticinin talimatlarına göre gerekli hacimde streptavidin kaplı boncuklar hazırlayın.
   NOT: Bir saf fareden alınan toplam splenositlerin 200 μL streptavidin kaplı boncuklara ihtiyacı vardır.
10. Hücreleri 800 x g'da 8-10 mL izolasyon tamponu ile 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyerek yıkayın ve süpernatanı atın. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
11. Hazırlanmış streptavidin kaplı boncuklarla hücre peletini yeniden süspanse edin.
12. Tüpü 45 rpm'de 40 dakika boyunca bir çalkalayıcıda buzun üzerine koyun.
13. Ardından, tüm boncuklar manyetik tarafa monte edilene kadar tüpü 3-4 dakika manyetik bir stand üzerine koyun.
14. Süpernatanı dikkatlice toplayın ve 15 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın.
15. Hücre süspansiyonlarını 800 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dekantasyon ile atın.
    NOT: CD4⁺ T hücresi zenginleştirmesi için, adım 1.5-1.15'te açıklanan CD4⁺ T hücresi zenginleştirme prosedürünün yerine kullanılabilecek başka ticari kitler de mevcuttur.
16. Hücre peletini 2-3 mL% 2 RPMI ile yeniden süspanse edin. CD4 ⁺ T hücresi zenginleştirmesinin (CD4 ve Vα2) etkinliğinin ve hücre canlılığının akış sitometrisi analizi için 50 μL hücre süspansiyonunu aspire edin.
17. Hücre süspansiyonlarını 800 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dekantasyon ile atın. Hücre peletini RPMI ile yeniden askıya alın ve hücre yoğunluğunu mL başına 1 × 10⁷ CD4 ⁺ Vα2 ⁺ SM hücresine ayarlayın. Tüpü buzun üzerine koyun ve bir sonraki adımda evlat edinen hücre transferine geçin.

2. Erken diferansiye SM T FH hücrelerine erişim için akut LCMV ile enfekte SM kimera fare modelinin oluşturulması

1. İntravenöz enjeksiyon için kuyruk damarını genişletmek için 6 ila 8 haftalık C57BL / 6 alıcı fareleri kızılötesi bir lamba ile ısıtın.
2. Adım 1.17'de hazırlanan 1 × 10⁶ SM hücresi içeren 100 μL hücre süspansiyonunu bir insülin şırıngası ile aspire edin.
   NOT: Enjeksiyon hacmi her araştırmacı tarafından değiştirilmeli ve kurumsal ve yerel yasaların izin verdiği maksimum enjeksiyon hacmini aşmamalıdır.
3. Fareleri bir fare sabitleyici ile yerinde tutun, kuyruğu düzeltin ve kuyruk damarını görünür hale getirmek için bir pamuk top kullanarak kuyruğu %75 etanol ile silin.
4. İnsülin şırınga iğnesini kuyruk damarına yerleştirin ve hücre süspansiyonlarını düzgün ve yavaş bir şekilde enjekte edin. Ardından, alıcı farelerin gece boyunca dinlenmesine izin verin.
5. Ertesi gün, 1 × 10⁷ plak oluşturan birim / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için LCMV Armstrong virüs stoğunu RPMI ortamı ile seyreltin.
6. 100 μL seyreltilmiş LCMV Armstrong solüsyonu (1 × 10⁶ plak oluşturan birim içeren) alıcı farelerin kuyruk damarına enjekte edin.
   NOT: Her araştırmacı, önerilen bulaşıcı titreye kurumsal ve yerel yasalar tarafından izin verilip verilmediği konusunda dikkatli olmalıdır.

3. Erken diferansiye SM, T,_FH hücrelerinin akış sitometrisi boyamaları

1. Enfeksiyondan sonraki 3. günde adım 2.6'dan itibaren fareleri (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) feda edin ve dalaklardan lenfositleri adım 1'de açıklandığı gibi işleyin. Hücre yoğunluğunu mL başına yaklaşık 2 × 10⁷ hücreye ayarlayın.
2. Yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakaya 50 μL hücre süspansiyonu (~ 1 × 10⁶ hücre) yükleyin ve oyuk başına 150 μL boyama tamponu ile doldurun. Plakayı buzun üzerinde tutun.
3. Saflaştırılmış sıçan anti-fare CXCR5 antikor kokteylini (yani, CXCR5 birincil antikoru) bir tüpteki her numune için 50 μL T_FH hücre boyama tamponunda 1:50 seyreltmede hazırlayın. Tüpü iyice girdaplayın ve parçacıkları toplamak için 4 ° C'de 3 dakika boyunca 15.000 × g'da santrifüjleyin. Tüpü buz üzerinde tutun.
4. 96 oyuklu plakayı 800 × g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı dekantasyon ile atın, plakayı kısaca girdaplayın ve oyuk başına 200 μL boyama tamponu ekleyin.
5. Adım 3.4'ü tekrarlayın ve hücreleri kuyucuk başına 50 μL CXCR5 birincil antikoru ile yeniden süspanse edin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve buz üzerinde 1 saat inkübe edin.
6. Biyotinile edilmiş keçi anti-sıçan antikor kokteylini (yani, CXCR5 ikincil antikoru) yeni bir tüpteki her numune için 50 μL T_FH hücre boyama tamponunda 1:200 seyreltmede hazırlayın. Tüpü girdaplayın ve parçacıkları toplamak için 4 ° C'de 3 dakika boyunca 15.000 × g'da santrifüjleyin. Tüpü buz üzerinde tutun.
7. Plakayı 800 × g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı dekantasyon ile atın, plakayı kısaca girdaplayın ve oyuk başına 200 μL boyama tamponu ekleyin.
8. Adım 3.7'yi iki kez tekrarlayın ve plakayı buz üzerinde tutun.
9. Plakaya oyuk başına 50 μL CXCR5 ikincil antikoru ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
10. Floresan konjuge streptavidin (yani, CXCR5 üçüncül antikor) her numune için 50 μL T_FH hücre boyama tamponunda 1:200 seyreltmede hazırlayın. Bu arada, yüzey belirteçlerine (örneğin, CD45.1, CD4, PD-1, CD25 ve diğer ilgili moleküller) ve CXCR5 üçüncül antikoru ile birlikte ölü hücre boyasına karşı başka antikorlar ekleyin.
11. Tüpü vorteksleyin ve parçacıkları toplamak için 4 ° C'de 3 dakika boyunca 15.000 × g'da santrifüjleyin. Tüpü buz üzerinde tutun.
12. Plakayı 800 × g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı dekantasyon ile atın, plakayı kısaca girdaplayın ve oyuk başına 200 μL boyama tamponu ekleyin.
13. Adım 3.12'yi iki kez tekrarlayın ve plakayı buz üzerinde tutun.
14. Plakaya her kuyucuk için 50 μL CXCR5 üçüncül antikor kokteyli ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve karanlıkta 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
15. Üreticinin talimatlarına göre her kuyucuk için 200 μL fiksasyon/geçirgenleştirme tamponu hazırlayın.
16. Plakayı 800 × g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı dekantasyon ile atın, plakayı kısaca girdaplayın ve oyuk başına 200 μL boyama tamponu ekleyin.
17. Adım 3.16'yı iki kez tekrarlayın ve plakayı karanlıkta buz üzerinde tutun.
18. Her kuyucuğa 200 μL fiksasyon/geçirgenleştirme tamponu ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek ve oda sıcaklığında 30 dakika (karanlıkta) inkübe ederek iyice karıştırın.
    NOT: Geçirgenleştirme tamponunu (1x) üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
19. Bcl-6, TCF-1, T-bet ve diğer ilgili moleküller dahil olmak üzere transkripsiyonel faktörlere karşı antikor kokteylini, yeni bir tüpteki her bir kuyucuk için 50 μL geçirgenlik tamponunda (1x) hazırlayın.
20. Tüpü girdaplayın ve parçacıkları toplamak için 4 ° C'de 3 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin.
21. Plakayı 4 ° C'de 1 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin, süpernatanı dekantasyon ile atın, plakayı kısaca girdaplayın ve kuyucuk başına 50 μL transkripsiyonel faktör antikor kokteyli ekleyin. İyice karıştırın ve karanlıkta 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
22. Plakayı 800 × g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın, plakayı dekantasyon ile kısaca vorteksleyin ve oyuk başına 200 μL geçirgenlik tamponu (1x) ekleyin.
23. Adım 3.22'yi tekrarlayın.
24. Her bir oyuğa 200 μL boyama tamponu ekleyin, plakayı 800 × g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı dekantasyon ile atın ve plakayı kısaca girdaplayın.
25. Her bir oyuktaki hücre peletini 200 μL boyama tamponu ile yeniden süspanse edin ve hücreleri anında akış sitometresi analizi için akış sitometri tüplerine aktarın.
    NOT: Alternatif olarak, numuneler her tüpe 200 μl %2 PFA eklenmesi ve karanlıkta 4 °C'de saklanması koşullarında 3 gün içinde tespit edilebilir.

4. Retrovirüs üretimi

1. 293T hücrelerini (on geçişten az olan) DMEM% 10 ortamı ile 10 cm'lik bir kültür kabında 2-3 geçişlik bir süre boyunca yetiştirin.
2. Hücreler% 90 birleşmeye ulaştığında, eski ortamı atın ve hücreleri PBS ile iki kez nazikçe yıkayın, ardından 1 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 mL% 0.25 Tripsin-EDTA kullanarak 293T hücrelerinin kısa bir tripsinizasyonu yapın.
3. Hücreleri 2 mL önceden ısıtılmış %10 DMEM ortamında yeniden süspanse ederek, 15 mL'lik konik bir tüpe aktararak ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyerek sindirim sürecini durdurun.
4. Süpernatanı atın ve 2 mL önceden ısıtılmış %10 DMEM ortamı ile kültür ortamını yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini yeniden süspanse edin.
5. 6 oyuklu bir plakada oyuk başına 2.5 mL% 10 DMEM ortamında 5 ×^{10 5} hücre hücre ve plaka sayısını ölçün.
   NOT: 293T hücrelerinin tabağa eşit şekilde yayılmasını sağlamak için tabağı hafifçe döndürün.
6. 293T hücre birleşmesi %80'i aştığında, transfeksiyon reaktiflerini adım 4.7 ila 4.9'da açıklandığı gibi hazırlayın.
7. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğu için, steril 1,5 mL'lik bir tüpe 250 μL önceden ısıtılmış Opti-MEM ortamı ekleyin. Ardından, Opti-MEM ortamına 3 μg plazmit DNA (2 μg retroviral vektör ve 1 μg pCL-Eco içeren) ekleyin, ardından tam karıştırmayı sağlamak için yukarı ve aşağı hafifçe pipetleme yapın.
   NOT: Bu çalışmada örnek olarak kullanılan retroviral vektörler, IRES-GFP'nin (MigR1-Bcl6) yukarı akışında Bcl6 CDS bölgesi ile MigR1 ve modifiye MigR1 vektörüdür.
8. Daha sonra, karışıma 7,5 μL önceden ısıtılmış transfeksiyon reaktifi (ticari olarak elde edilir) ekleyin ve iyice karıştırmayı sağlamak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
9. Karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
10. Karışımı, 293T hücre kültürü yapılmış kuyucuğun farklı bölgelerine damla damla dağıtın, ardından karışımın eşit dağılımını sağlamak için kültür kabını ileri geri ve yan yana hareketlerle hafifçe sallayın.
11. 293T hücrelerini% 5 CO₂ içeren 37 ° C inkübatörde 72 saat inkübe edin.
12. Bir floresan mikroskobu veya akış sitometrisi kullanarak transfekte edilmiş 293T hücrelerinde transfeksiyon etkinliğinin vekili olarak retroviral vektörün etiketini tespit edin.
    NOT: Örneğin, MigR1 vektör transfekte edilmiş 293T hücrelerinin önemli bir kısmında GFP floresan sinyalini doğruladık, bu da yüksek kaliteli transfeksiyon olduğunu düşündürdü.
13. Hücre kültürü ortamını toplayın ve hücresel kalıntıları ortadan kaldırmak için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 2.500 × g'da santrifüjleyin. Elde edilen süpernatant, -80 °C'de uzun süreli koruma için dikkatlice toplanmalı ve saklanmalı veya geçici olarak 4 °C'de tutulmalıdır.

5. SM CD4 + T hücrelerinin in vivo aktivasyonu, retrovirüs transdüksiyonu ve evlat edinici transferi

1. 100 μL RPMI ortamı hacminde 200 μg LCMV GP_61-77 peptid^11,14 ile intravenöz olarak bir CD45.1⁺ SM faresine (6 ila 8 haftalık) enjekte edin.
   NOT: Enjeksiyon hacmi her araştırmacı tarafından değiştirilmeli ve kurum ve yerel yasaların izin verdiği maksimum enjeksiyon hacmini aşmamalıdır.
2. Peptit enjeksiyonundan 16-18 saat sonra SM faresini ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Adım 1'de belirtilen prosedürleri izleyerek splenositleri edinin.
   NOT: Alternatif olarak, in vitro anti-CD3 / anti-CD28 stimülasyon yöntemi^27,28, adım 5.1 ve ^5.2'de açıklanan in vivo peptit stimülasyonu yerine SM CD4 ⁺ T hücrelerini aktive etmek için kullanılabilir.
3. Splenositleri% 2 RPMI ile askıya alın ve hücre yoğunluğunu 15 mL'lik konik bir tüpte mL başına yaklaşık 1 ×^{10 8} hücreye ayarlayın. Tüpü buz üzerinde tutun.
4. 50 μL hücre süspansiyonunu yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakaya dağıtın ve oyuk başına 150 μL boyama tamponu ile destekleyin.
5. Hücreleri peletlemek için 96 oyuklu plakayı 800 × g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı dekantasyon ile dikkatlice çıkarın, plakayı kısaca girdaplayın ve oyuk başına 200 μL boyama tamponu ekleyin.
6. Adım 5.5'i tekrarlayın ve SM CD4 ⁺ T hücrelerinin aktivasyon durumunu tespit etmek için hücreleri CD4, CD25 ve CD69 dahil olmak üzere 50 μL yüzey antikor kokteyli ile yeniden süspanse edin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve karanlıkta 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
7. Her bir kuyucuğu 200 μL'ye kadar boyama tamponu ile doldurun, ardından plakayı 4 ° C'de 1 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dekantasyon ile atın ve plakayı kısaca girdaplayın.
8. Adım 5.7'yi iki kez tekrarlayın.
9. Hücreleri 200 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve bunları bir akış sitometri tüpüne aktarın.
10. SM CD4 ⁺ T hücrelerinin aktivasyon durumunu değerlendirmek için floresan konjuge antikor lekeli hücreleri bir akış sitometrisi ile analiz edin.
    NOT: Aktive edilmiş SM CD4 ⁺ T hücreleri, naif hücrelere kıyasla bol miktarda CD25 ve CD69 ekspresyonu sergiledi, böylece sonraki transdüksiyon prosedürlerini mümkün kıldı.
11. 24 oyuklu bir plakaya kuyucuk başına 1 × 10⁶ SM CD4 ⁺ T hücresi (adım 5.3'ten itibaren) ekleyin. Hücreleri 800 × g'da 4 °C'de 3 dakika boyunca döndürün, ardından ortamı dekantasyon ile dikkatlice çıkarın.
12. Her bir oyuk için adım 4.13'te tarif edildiği gibi 1 mL retrovirüs ortamı ve 8 μg polibren ekleyin.
13. Hücreleri 37 ° C'de 2 saat boyunca 800 × g'da döndürün.
14. Retrovirüs ortamını pipetleme ile dikkatlice atın ve her oyuğa 10 ng/mL rekombinant murin IL-2 ile desteklenmiş 1 mL önceden ısıtılmış %10 RPMI ekleyin.
15. Hücreleri% 5 CO₂ içeren 37 ° C'lik bir inkübatörde 48 saat inkübe edin.
16. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri 4 ° C'de 6 dakika boyunca 800 × g'da döndürün.
17. Süpernatanı dekantasyon ile çıkarın ve 15 mL'lik bir konik tüpte mL başına 1 ×^{10 8} hücrelik bir hücre yoğunluğu elde etmek için hücreleri uygun bir hacim% 2 RPMI ile yeniden süspanse edin. Tüpü buz üzerinde tutun.
18. 50 μL hücre süspansiyonunu yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakaya dağıtın ve oyuk başına 150 μL boyama tamponu ile destekleyin.
19. Hücreleri peletlemek için 96 oyuklu plakayı 800 × g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı dekantasyon ile dikkatlice çıkarın, plakayı kısaca girdaplayın ve oyuk başına 200 μL boyama tamponu ekleyin.
20. Adım 5.19'u tekrarlayın ve hücreleri CD4, Vα2 ve vektör etiketi ile ilişkili antikor dahil olmak üzere 50 μL yüzey antikor kokteyli ile yeniden süspanse edin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve karanlıkta 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
21. Her bir kuyucuğu 200 μL'ye kadar boyama tamponu ile doldurun, ardından plakanın 1 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjlenmesini izleyin. Süpernatanı dekantasyon ile atın ve plakayı kısaca girdaplayın.
22. Adım 5.21'i iki kez tekrarlayın.
23. Hücreleri 200 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve bunları bir akış sitometri tüpüne aktarın.
24. SM CD4 ⁺ T hücrelerinde transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için floresan konjuge antikor lekeli hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin.
    NOT: Verimli bir şekilde transdüksiyon yapan SM CD4 ⁺ T hücreleri, çalışmada GFP gibi retrovirüs etiketinin yüksek ekspresyonunu sergiledi.
25. Hücre süspansiyonlarını adım 5.17'den itibaren 800 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı dekantasyon ile atın. RPMI ile hücre peletini yeniden süspanse edin ve hücre yoğunluğunu 1 × 10⁷ CD4 ⁺ Vα2 ⁺ SM hücreleri / mL'ye ayarlayın.
26. Adım 5.25'te 100 μL hücre süspansiyonunun intravenöz enjeksiyonu ile her bir C57BL / 6 alıcı fareye (6 ila 8 haftalık) toplam 1 × 10⁶ CD45.1 ⁺ SM CD4 ⁺ T hücresi aktarın.
27. Ertesi gün, C57BL / 6 alıcı fareleri intravenöz enjeksiyon yoluyla 1 × 10⁶ plak oluşturan ünite LCMV Armstrong ile enfekte edin.

6. Erken akut LCMV enfeksiyonu aşamasında retrovirüs ile transdüksiyonlu SM T_FH hücrelerinin akış sitometrisi analizi

1. Enfeksiyondan sonraki 3. günde adım 5.25'ten itibaren C57BL / 6 farelerinden splenositleri alın.
2. CD4, CD45.1, CXCR5, CD25 ve diğer ilgili moleküller dahil olmak üzere yüzey belirteçlerinin akış sitometrisi boyamalarını adım 3'te açıklandığı gibi splenositlerde gerçekleştirin.
3. Floresan proteinler tarafından etiketlenen retrovirüs ile transdüksiyona uğrayan SM CD4 ⁺ T hücrelerinde transkripsiyonel faktörlerin tespiti için, her bir oyuğa 200 μL% 2 PFA ekleyin ve karanlıkta 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
4. İlgili transkripsiyonel faktörlerin fiksasyon/geçirgenlik, akış sitometrisi boyaması ve adım 3'te açıklandığı gibi akış sitometrisi analizi gerçekleştirin.

Sonuçlar

Akut LCMV enfeksiyonu sırasında erken diferansiye virüse özgü T_FH hücrelerinin özellikleri
Virüse özgü T_FH hücrelerinin erken kader bağlılığını araştırmak için, LCMV GP epitopu IA^bGP_66-77'yi spesifik olarak tanıyan naif konjenik SM CD4⁺ T hücreleri, CD45.2⁺ C57BL / 6 alıcılarına evlat edinerek aktarıldı. Ertesi gün, bu alıcılara intravenöz olarak yüksek dozda akut rezolüsyonlu LCMV Armstrong enjekte edil...

Tartışmalar

T_FH hücreleri alanındaki araştırmalar, T_FH hücrelerinin B hücrelerine yardımcı olmada özel işlevinin keşfedilmesinden bu yana vurgulanmıştır. Biriken çalışmalar, T_FH hücre farklılaşmasının çok aşamalı ve çok faktörlü bir süreç^{olduğunu göstermiştir 30}, burada T_FH hücre kaderi taahhüdü erken evre^5'te belirlenir. Bu nedenle, erken diferansiye T_FH hücrelerinin altında yatan mekanizmalar...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Corning	25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA	Beyotime	P0099-500mL
70 μm cell strainer	Merck	CLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)	Biolegend	127812	1:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)	Biolegend	110724	1:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)	Biolegend	101910	1:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse	The Jackson Laboratory	002014
BeaverBeads Streptavidin	Beaver	22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)	Biolegend	123106	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)	Biolegend	117304	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)	Biolegend	115504	1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)	Biolegend	108704	1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)	Biolegend	116204	1:200 dilution
bovine serum albumin, BSA	Sigma	A7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)	Biolegend	644816	1:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)	Biolegend	135220	1:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouse	The Jackson Laboratory	000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouse			In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% medium			DMEM medium containing 10% FBS
DMEM medium	Gibco	11885092
EDTA	Sigma	E9884
FACSFortesa	BD Biosciences
Fetal bovine serum, FBS	Sigma	F8318
FlowJo (version 10.4.0)	BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	Invitrogen	00-5523-00	The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated	Vector laboratories	BA-9400-1.5	1:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific
Isolation buffer			FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)	Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199	1:200 dilution
MigR1	addgene	#27490
NaN3	Sigma	S2002
Opti-MEM medium	Gibco	31985070
pCL-Eco	addgene	#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)	Biolegend	104508	1:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)	BD Biosciences	561522	1:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBS	Gibco	10010072
Polybrene	Solarbio	H8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)	BD Biosciences	551961	1:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)	Biolegend	100538	1:200 dilution
recombinant murine IL-2	Gibco	212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis Buffer	Beyotime	C3702-500mL
RPMI 1640 medium	Sigma	R8758
RPMI 2%			RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouse			SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining buffer			PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7	eBioscience	25-4317-82	1:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)	Cell signaling technology	6444S	1:400 dilution
TFH cell staining buffer			FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagent	Mirus Bio	MIRUMIR2700