JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

يتم عرض إجراء جراحي طفيف التوغل هنا ، والذي يتضمن وضع مسبار دوبلر بالليزر على الجمجمة فوق المنطقة البعيدة من الشريان الدماغي الأوسط (MCA) ، وهو موقع حول الحجاج مناسب للفئران والفئران ، لتقييم تدفق الدم أثناء انسداد MCA العابر.

Abstract

انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) هو الطريقة القياسية الذهبية للنمذجة قبل السريرية للسكتة الدماغية الإقفارية في القوارض. ومع ذلك ، فإن الانسداد الناجح غير مضمون حتى من قبل أمهر الأيدي الجراحية. تحدث الأخطاء في المقام الأول عندما لا يتم وضع الفتيل في العمق الصحيح وتشمل حالات عدم وجود احتشاء أو ثقب في الأوعية الدموية ، مما قد يتسبب في الوفاة. قياس تدفق دوبلر بالليزر (LDF) هو تقنية موثوقة توفر ملاحظات في الوقت الفعلي حول تدفق الدم الدماغي الموضعي (CBF) أثناء إجراء MCAO. نوضح هنا تقنية سريعة للتنسيب حول الحجاج لمسبار دوبلر ليزر لقياس CBF في كل من الفئران والجرذان. كان الأساس المنطقي لدينا هو تبسيط تنفيذ LDF ، وتشجيع الاستخدام الواسع النطاق لتحسين الموثوقية الجراحية. تلغي هذه التقنية الحاجة إلى ترقق الجمجمة والمعدات المتخصصة ، مع وضعها في المنطقة المحيطة بالحجاج بدلا من التنسيب الظهري ، مما يعزز الكفاءة وسهولة التبني. يشمل البروتوكول الموصوف هنا الاستعدادات قبل الجراحة ، ووضع مسبار دوبلر حول الحجاج ، ورعاية ما بعد الجراحة. تتضمن النتائج التمثيلية صورا مرئية للعناصر الإجرائية جنبا إلى جنب مع تتبع LDF التمثيلي الذي يوضح جراحات MCAO الناجحة ، مع حالات وضع الخيوط غير الناجحة التي تؤدي إلى مضاعفات. يوضح البروتوكول LDF في تأكيد وضع الخيوط بشكل صحيح ويقدم إجراء مبسطا مقارنة بالطرق البديلة.

Introduction

تم استخدام طريقة انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) على نطاق واسع في القوارض منذ تقديمها إلى المجتمع العلمي لتطبيقها على الفئران في عام 19861 مع تكيف Longa الموصوف في عام 19902 ، والتكيفات مع الفئران بعد فترة وجيزة3. على الرغم من عدم وصفه في منشور لونجا ، إلا أن استخدام إشارة قياس التدفق بالليزر دوبلر (LDF) لتأكيد وضع الفتيل سرعان ما تم وصفه في الأدبيات4. يظهر توظيف LDF أثناء إجراء MCAO بشكل بارز في الأدبيات ولكن تم تعيينه كخطوة اختيارية في الإجراءات التشغيلية القياسية الحالية لشبكات التقييم قبل السريري للسكتة الدماغية (SPAN) 5.

يؤكد استخدام LDF وضع الخيوط الصحيح أثناء إجراء MCAO ، وبالتالي يساهم في دقة تصميم الدراسة والنتائج اللاحقة ، لا سيما في التجارب المصممة لاستكشاف فعالية الدواء. يقلل استخدام LDF من الأخطاء الجراحية الناجمة عن وضع الخيط بشكل غير صحيح ، مما يؤدي إلى حالة ثنائية التفرع إما إما عدم وجود إصابة عندما لا يتم وضع الفتيل بعيدا بما فيه الكفاية أو نفوق بسبب ثقب الأوعية الدموية الذي يحدث عند إدخال الفتيل بعيدا جدا. من ناحية أخرى ، لا يرتبط استخدام LDF بتباين حجم الاحتشاء الذي يتم ملاحظته بشكل شائع بعد إجراء MCAO6. قد ينظر إلى استخدام LDF في إجراء MCAO على أنه صعب ومرهق ، خاصة في الفئران ، لأن الجمجمة أكثر سمكا من الفئران وقد تتطلب ترقق الجمجمة قبل وضع LDF7،8. أيضا ، غالبا ما يتم وصف وضع المسبار الظهري ببعض البروتوكولات التي تتطلب معدات متخصصة أو إعداد7،8،9. مع أي من هذه الحواجز ، قد لا يتم تنفيذ LDF لتأكيد وضع الفتيل.

في هذا البروتوكول ، نصف وضع مسبار دوبلر بالليزر في الجمجمة وفوق المنطقة البعيدة من الشريان الدماغي الأوسط - وهو وضع حول الحجاج - لتقييم تدفق الدم أثناء إجراء MCAO في كل من الفئران والجرذان. كان الأساس المنطقي لدينا هو تطوير إجراء له مزايا متعددة على بعض الطرق المذكورة في الأدبيات7،8،9،10 من حيث أنه طفيف التوغل وسريع ولا يتطلب ترقق الجمجمة أو معدات متخصصة تتجاوز مسبار دوبلر بالليزر.

Protocol

تم استخدام الفئران والجرذان البالغة لتوضيح هذا البروتوكول (25 جم ، C57BL / 6J ، مختبرات جاكسون ؛ 250 جم ، Sprague Dawley ، Envigo). تم تنفيذ التعامل مع والإجراءات التجريبية بموافقة والامتثال للجنة رعاية المؤسسي بجامعة أريزونا والقوانين الوطنية ووفقا لمبادئ رعاية المختبر11. تم إيواء الفئران والفئران بجدول ضوئي / مظلم لمدة 12 ساعة (7 صباحا - 7 مساء) مع توفر الطعام والماء المتاح.

1. التحضير قبل الجراحة

ملاحظة: عادة ما يتم إجراء جراحة MCAO في القوارض كجراحة للبقاء على قيد الحياة ، مما يستلزم استخدام تقنية جراحية معقمة أو نصائح فقط ، كما هو موضح في بروتوكول IACUC الخاص بالمؤسسة. في هذه الحالة ، يستخدم الجراح تقنية النصائح فقط مع الأدوات والإمدادات المعقمة.

  1. قم بتطهير سطح العمل الجراحي بمطهر تجاري وقم بإعداد عبوات جراحية معقمة من الأدوات والستائر والشاش والمسحات والخيوط وشفرات المشرط عن طريق التعقيم. الحفاظ على ظروف معقمة أثناء جراحة البقاء على قيد الحياة وفقا للتقنيات المعتمدة من IACUC ، مثل تغطية مقابض المجهر واللف باستخدام غلاف بلاستيكي مخصص للطعام.
  2. استخدم معقم الخرز الجاف المبتذب لإعادة تعقيم الأدوات الجراحية بين الإجراءات إذا تم إجراء عمليات جراحية متعددة للقوارض خلال جلسة واحدة.
  3. ضع الجرذ أو الفأر في غرفة الحث وقم بالتخدير باستخدام 3٪ -5٪ أيزوفلوران (1 لتر / دقيقة باستخدام خليط 80٪ هواء و 20٪ أكسجين).
  4. انقل من الغرفة إلى المقعد ومخروط الأنف للتخدير (الفأر: 0.5 لتر / دقيقة 80٪ / 20٪ خليط أكسجين / هواء ؛ الفئران: 1.5 لتر / دقيقة 80٪ / 20٪ خليط أكسجين / هواء). ضع مرهم العين على كلتا العينين واحلق المسافة بين الأذن وتجويف العين بعناية على جانب جراحة MCAO (عادة على اليمين) ، حتى لا تقطع أي جلد باستخدام المقصات. في الفئران ، عند الحلاقة ، ستكون غمازة الشعيرات مرئية في منتصف الطريق تقريبا بين محجر العين والأذن. استمر في حلق المناطق حسب الحاجة لإجراء MCAO9 (ليس في نطاق هذه الورقة).
  5. أعد إلى الغرفة حسب الحاجة أو انقله إلى مخروط أنف على طاولة الجراحة المعدة دافئة إلى 37 درجة مئوية. أدخل مقياس حرارة المستقيم. يجب أن يحفظ عند حوالي 36 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية طوال الإجراء ووفقا لبروتوكول IACUC المعتمد.
  6. ضع البيتادين على قطعة قطن وقم بتطهير الجلد ، وتصاعد للخارج من مركز المنطقة الجراحية. امسحي بضمادة تحضير الكحول. كرر كلتا الخطوتين لما مجموعه ثلاث دورات. تأكد من التخدير المناسب وقم بتقييمه كل 15 دقيقة أثناء الإجراء باستخدام ارتجاع قرصة إصبع القدم.

2. وضع مسبار دوبلر حول الحجاج

  1. باستخدام مقص صغير ، قم بعمل قطع رأسي (الماوس: ~ 0.5 سم ؛ الفئران: ~ 0.7 سم) بين زاوية العين وطية الأذن ، كما هو موضح في الشكل 2 أ (فأر) والشكل 3 أ (الفئران) لفضح الوجه الفائق والعضلات الأساسية.
    ملاحظة: عالج الألم قبل الجراحة وفقا لموافقة بروتوكول IACUC.
  2. باستخدام ملقط حاد ومقص منحني ، قم بقطع طبقة العضلات بعناية حتى يتم الوصول إلى الجمجمة. ستكون الجمجمة مسطحة ويصعب لمسها بطرف الملقط. هذه هي النافذة التي سيجلس فيها مسبار دوبلر بالليزر ، كما هو موضح في الشكل 2 ب.
  3. استخدم أداة كي الملقط لتخثر الدم الناشئ وتوسيع النافذة والتأكد من الطريق إلى الجمجمة.
  4. بمجرد فتح النافذة ، امسح بمسحات قطنية لإزالة الدم الزائد حسب الضرورة.
    ضع الفأر أو الجرذ في وضع ضعيف.
  5. استخدم الملقط لسحب أي جلد أو نسيج ووضع مسبار دوبلر في النافذة المحيطة بالحجاج بحيث يتاخم الجمجمة بشكل عمودي مع عدم وجود جلد أو عضلة لإعاقة إشارة الليزر. تقع هذه المنطقة فوق MCA البعيدة كما هو موضح في الشكل 1 أ ، ب. قم بتأمين موضع المسبار بشريط مختبر. في هذا البروتوكول ، يتم وصف استخدام مسبار مستقيم.
    ملاحظة: نحن نقر بأن بروتوكولات الجراحة ستختلف بين المختبرات. في الأدبيات (عند الإبلاغ عنها) ، يطحن البعض الجمجمة بشكل رقيق ، والبعض الآخر لايفعل ذلك 9. قد يكون ذلك لأن الجمجمة أرق في المنطقة المحيطة بالحجاج ، لكن هذه مجرد تكهنات. من خلال تجربتنا ، يمكن تحقيق التنسيب المباشر بدون طحن في الفئران والجرذان وهو ما يتضح في هذا البروتوكول.
  6. راقب قراءات تدفق الدم النسبية على الشاشة باستخدام البرنامج المناسب (الشكل 2 د ، الشكل 3 ج ، د). ستختلف قراءات LDF. ومع ذلك ، فإن النطاق الأمثل للكشف عن قطرات تدفق الدم هو >200 وحدة تروية (PU).
  7. انتقل إلى جراحة MCAO9 (ليست في نطاق هذه الورقة). أثناء جراحة MCAO ، اختبر وضع المسبار عن طريق ربط الشريان السباتي المشترك لفترة وجيزة ، مما قد يتسبب في انخفاض مفاجئ في تدفق الدم (~ 50٪).

3. إزالة مسبار دوبلر ورعاية ما بعد الجراحة

  1. في ختام MCAO أو عند اكتمال قراءات تدفق الدم ، قم بإزالة مسبار دوبلر بالليزر من نافذة الجراحة. عادة ما يظل مسبار دوبلر في مكانه طوال مدة جراحة MCAO للفأر لأن أوقات نقص التروية غالبا ما تكون أقل من 90 دقيقة. من ناحية أخرى ، في إجراء MCAO للفئران ، يمكن إزالة مسبار دوبلر بعد وضع الفتيل وأثناء نقص التروية (عادة > 90 دقيقة) ثم وضعه مرة أخرى في النافذة حول الحجاج لتأكيد إعادة التروية بتكرار الخطوتين 2.6 و 2.7.
    ملاحظة: يمكن ملاحظة تتبع LDF المستمر النموذجي من MCAO الماوس في الشكل 4 أ. يتم توضيح تتبع LDF النموذجي من إجراء MCAO للفئران في الشكل 4 ب.
  2. حقن مخدر موضعي معتمد من IACUC تحت الجلد على طول موقع الشق المحتمل.
  3. أغلق الجلد ب 1-2 خيوط باستخدام عقدة جراحية قياسية بخيط خياطة قابل للامتصاص أو غراء جراحي ، وفقا لبروتوكول IACUC المعتمد. علاج آلام ما بعد الجراحة وفقا لموافقة بروتوكول IACUC (على سبيل المثال بوبيفاكائين HCL 0.5٪ وليدوكائين 2٪ ، مرة واحدة داخل شق للفئران والجرذان). لا ينبغي ترك دون رقابة حتى تتمكن من الحفاظ على الاستلقاء القصي ، ولا يتم إرجاع أي إلى صحبة الأخرى حتى يتم تعافيها تماما.

النتائج

تم تصوير وضع مسبار دوبلر بالليزر في منطقة MCA بصريا في الشكل 1 ، حيث يقدم صورة تخطيطية للأوعية الدموية ويعمل كدليل مرئي من المنظورات السهمية والظهرية. يلخص الشكل 2 الخطوات الحاسمة لوضع مسبار دوبلر بالليزر والنتائج في الماوس. يقد?...

Discussion

MCAO هو الإجراء القياسي الذهبي لنمذجة انسداد الشريان الدماغي وإعادة التروية في القوارض وكان حجر الزاوية في أبحاث السكتة الدماغية قبل السريرية ، مما مكن من تحريض نقص التروية البؤري في القوارض لتقليد الفيزيولوجيا المرضية للسكتة الدماغية البشرية. إنه إجراء جراحي صارم مع تب...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من قبل NINDS 1R41NS124450. بيورندر: KT26JWLYF6

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
curved spring scissorsCastroviejo1501710
forceps #5Fine science tools11250-20
forceps #5/45Fine science tools1151-35
Forcepts Cautery toolConmedM18019-01
Laboratory tapeFisherbrand Labeling Tape15-950
Laser Doppler MonitorMoore Instruments MOORVMS-LDF
LDF softwarePerisoft for Windows or moorSOFTNA
Mouse clippersPhilips NorelcoMG7910
Periflux System 4000, probe 407Perimedequipment no longer available
plastic wrapGladpress n seal
Rat clippersosterA5 or similar
Small rodent anesthesiaJD Medicalcustom order
small scissorsexcelta362 Sissors or similar
Temperature monitor system with probePhysitempTCAT-2AC Controller

References

  1. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese J Stroke. 20 (1), 84-91 (1986).
  2. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84 (1989).
  3. Hata, R., et al. A reproducible model of middle cerebral artery occlusion in mice: hemodynamic, biochemical, and magnetic resonance imaging. J Cereb Blood Flow Metab. 18 (4), 367-375 (1998).
  4. Dirnagl, U., Kaplan, B., Jacewicz, M., Pulsinelli, W. Continuous measurement of cerebral cortical blood flow by laser-Doppler flowmetry in a rat stroke model. J Cereb Blood Flow Metab. 9 (5), 589-596 (1989).
  5. Lyden, P. D., et al. The stroke preclinical assessment network: Rationale, design, feasibility, and stage 1 results. Stroke. 53 (5), 1802-1812 (2022).
  6. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Effect of laser Doppler flowmetry and occlusion time on outcome variability and mortality in rat middle cerebral artery occlusion: inconclusive results. BMC Neurosci. 19 (1), 24 (2018).
  7. Spratt, N. J., et al. Modification of the method of thread manufacture improves stroke induction rate and reduces mortality after thread-occlusion of the middle cerebral artery in young or aged rats. J Neurosci Methods. 155 (2), 285-290 (2006).
  8. Watcharotayangul, J., et al. Post-ischemic vascular adhesion protein-1 inhibition provides neuroprotection in a rat temporary middle cerebral artery occlusion model. J Neurochem. 123 Suppl 2 (Suppl 2), 116-124 (2012).
  9. Beretta, S., et al. Optimized system for cerebral perfusion monitoring in the rat stroke model of intraluminal middle cerebral artery occlusion. J Vis Exp. (72), e50214 (2013).
  10. Ritter, L. S., Stempel, K. M., Coull, B. M., McDonagh, P. F. Leukocyte-platelet aggregates in rat peripheral blood after ischemic stroke and reperfusion. Biol Res Nursing. 6 (4), 281 (2005).
  11. National Research Council. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.. , (2011).
  12. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Sci Rep. 6, (2016).
  13. Morais, A., et al. Embracing heterogeneity in the multicenter stroke preclinical assessment network (SPAN) trial. Stroke. 54 (2), 620-631 (2023).
  14. Ström, J. O., Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Method parameters' impact on mortality and variability in rat stroke experiments: a meta-analysis. BMC Neurosci. 14, 41 (2013).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Periorbital Placement of a Laser Doppler Probe for Cerebral Blood Flow Monitoring Prior to Middle Cerebral Artery Occlusion in Rodent Models
Posted by JoVE Editors on 3/18/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66839

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

MCAO CBF LDF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved