تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأجنة الفئران الكاملة الطافرة: من الأرومة إلى نهاية المعدة

Summary

تؤسس هذه الورقة خط أنابيب لمعلقات عالية الجودة للخلية المفردة والنوى لأجنة الفئران المعدة لتسلسل الخلايا المفردة والنوى.

Abstract

على مدى العقد الماضي ، أصبحت مناهج الخلية الواحدة المعيار الذهبي لدراسة ديناميكيات التعبير الجيني ، وعدم تجانس الخلايا ، وحالات الخلايا داخل العينات. قبل تقدم الخلية الواحدة ، كانت جدوى التقاط المشهد الخلوي الديناميكي والتحولات الخلوية السريعة أثناء التطور المبكر محدودة. في هذه الورقة ، تم تصميم خط أنابيب قوي لإجراء تحليل أحادي الخلية ونوى على أجنة الفئران من اليوم الجنيني E6.5 إلى E8 ، وهو ما يتوافق مع بداية واكتمال المعدة. المعدة هي عملية أساسية أثناء التطور تحدد الطبقات الجرثومية الثلاث: الأديم المتوسط ، والأديم الظاهر ، والأديم الباطن ، والتي تعتبر ضرورية لتكوين الأعضاء. تتوفر أدبيات واسعة النطاق حول omics أحادية الخلية المطبقة على الأجنة المحيطة بالمعدة من النوع البري. ومع ذلك ، لا يزال تحليل الخلية الواحدة للأجنة الطافرة نادرا وغالبا ما يقتصر على المجموعات التي تم فرزها بواسطة FACS. ويرجع ذلك جزئيا إلى القيود التقنية المرتبطة بالحاجة إلى التنميط الجيني ، والحمل الموقوت ، وعدد الأجنة ذات الأنماط الجينية المرغوبة لكل حمل ، وعدد الخلايا لكل جنين في هذه المراحل. هنا ، يتم تقديم منهجية مصممة للتغلب على هذه القيود. تضع هذه الطريقة إرشادات للتكاثر والحمل الموقوت لتحقيق فرصة أكبر للحمل المتزامن مع الأنماط الجينية المرغوبة. تسمح خطوات التحسين في عملية عزل الجنين إلى جانب بروتوكول التنميط الجيني في نفس اليوم (3 ساعات) بإجراء خلية مفردة قائمة على القطرات الدقيقة في نفس اليوم ، مما يضمن قابلية عالية للبقاء ونتائج قوية. تتضمن هذه الطريقة أيضا إرشادات لعزل النوى الأمثل عن الأجنة. وبالتالي ، فإن هذه الأساليب تزيد من جدوى نهج الخلية الواحدة للأجنة الطافرة في مرحلة المعدة. نتوقع أن تسهل هذه الطريقة تحليل كيفية تشكيل الطفرات للمشهد الخلوي للمعدة.

Introduction

المعدة هي عملية أساسية مطلوبة للتطور الطبيعي. تحدث هذه العملية السريعة والديناميكية عندما تنتقل الخلايا متعددة القدرات إلى سلائف خاصة بالنسب تحدد كيفية تكوين الأعضاء. لسنوات ، تم تعريف المعدة منذ فترة طويلة على أنها تكوين ثلاث مجموعات متجانسة إلى حد كبير: الأديم المتوسط ، والأديم الظاهر ، والأديم الباطن. ومع ذلك ، فإن التقنيات عالية الدقة والعدد الناشئ من نماذج الخلايا الجذعية الجنينية ^1,2 تكشف النقاب عن عدم تجانس غير مسبوق بين طبقات الجراثيم المبكرة ^3,4. هذا يشير إلى أنه لا يزال هناك الكثير الذي يجب الكشف عنه حول الآليات التي تنظم مجموعات الخلايا المتميزة في المعدة. كان التطور الجنيني للفأر أحد أفضل النماذج لدراسة قرارات مصير الخلية المبكرة أثناء المعدة ^3,5. المعدة في الفئران سريعة ، حيث تحدث عملية المعدة بأكملها في غضون 48 ساعة ، من اليوم الجنيني E6.5 إلى E8⁵.

مكنت التطورات الحديثة في تقنيات الخلية الواحدة من رسم خرائط مفصلة للتطور الجنيني للفأر من النوع البري ، مما يوفر نظرة عامة شاملة على المناظر الطبيعية الخلوية والجزيئية للأجنة أثناء عملية المعدة^{3،4،6،7،8}. ومع ذلك ، فإن تحليل الأجنة الطافرة في هذه المراحل أقل شيوعا وغالبا ما يقتصر على المجموعات المصنفة^من قبل FACS ^9,10. تعكس الأدبيات النادرة التحديات التقنية المرتبطة بالتلاعب وإعداد خلية واحدة للأجنة المعدة التي تتطلب التنميط الجيني. يمكن أن يشكل التقاط العملية الديناميكية للمعدة تحديات بسبب طبيعتها السريعة ، خاصة لفهم الأجنة الطافرة. يعد توقيت الحمل وتزامنه أمرا ضروريا ، حيث يمكن إساءة تفسير الاختلافات الطفيفة بين حالات الحمل الموقوتة على أنها نمط ظاهري تنموي ناتج عن الجين الطافر. يصبح هذا مهما بشكل خاص عندما يؤثر الجين الطافر على عملية المعدة^13,14. في هذه الدراسة ، تم وضع مبادئ توجيهية للحصول على حالات الحمل المتزامن من خلال تصور المقابس المهبلية (أي كتلة السائل المنوي المتخثر المتشكل في مهبل الأنثى بعد التزاوج). بالإضافة إلى ذلك ، تم تصميم استراتيجية للحصول على بيانات قوية أحادية الخلية من أجنة المعدة الطافرة من E6.5 إلى E8. تم تصميم هذه الاستراتيجية للتغلب على القيود المرتبطة بانخفاض عدد الأجنة ذات النمط الجيني المرغوب فيه لكل حمل وانخفاض القدرة على البقاء الناجم عن تجميد الأجنة أو الخلايا.

تصف هذه الورقة منهجية محسنة من إنشاء حالات الحمل الموقوتة عبر سدادات المهبل إلى التسلسل النهائي للخلايا / النوى المفردة. تشرح هذه الطريقة كيفية زيادة عدد حالات الحمل المتزامن للحصول على عدد أكبر من الأجنة ذات النمط الجيني المطلوب ، وعزل الخلايا / النوى لتحسين صلاحية الخلايا ، وبروتوكول التنميط الجيني في نفس اليوم. تصف هذه المخطوطة أيضا عملية عزل الجنين في نقاط زمنية مختلفة للمعدة. تساعد المنهجية على زيادة عدد الخلايا / النوى الجنينية النهائية القابلة للحياة للتسلسل ، مما يضمن بيانات تسلسل عالية الجودة. لذلك ، ستفتح هذه الطريقة الأبواب أمام دراسات الخلية الواحدة للأجنة المعدية التي تتطلب التنميط الجيني.

Protocol

تمت الموافقة رسميا على هذا البروتوكول وجميع التجارب على الموصوفة ووفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية التي وضعتها لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة تمبل ، والتي تتبع المبادئ التوجيهية الدولية لجمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر. كانت جميع الفئران الموصوفة على سلالة الخلفية C57 / BL6N. لم يلاحظ أي مخاوف تتعلق بصحة في هذه الدراسات.

1. مستعمرة تربية والحمل الموقوت

1. وقت الحمل عن طريق تصور سدادة مهبلية. يعتبر الظهر في يوم القابس E0.5.
2. الفئران المنزلية في أقفاص مع مواد الفراش التي تحتوي على الفراش الخشب الصلب المتكسرة ومواد التعشيش الورقية.
   1. يحتوي كل قفص على تشاو الفأر والمياه العذبة وعنصر التخصيب (على سبيل المثال ، مواد النفق والتعشيش). تتبع وجمع معلومات المستعمرة يوميا أثناء التكاثر الموقوت.
   2. سجل جميع المعلومات مثل عمر الفأر ، وعدد حالات الحمل التي مرت بها أنثى الفأر ، وعدد المقابس التي وضعها ذكر الفأر ، ومرحلة الشهوة (الشكل 2) لإناث الفئران.
      ملاحظة: الإناث اللواتي أنجبن بالفعل 1-2 مرات سوف يلدن أحجام قمامة أكبر في حالات الحمل المستقبلية.
3. قبل البدء في الحمل الموقوت ، قم بإيواء الفأر الذكر وحده في قفص قبل أسبوع من التكاثر. خلال أسبوع بدء التكاثر ، أدخل ما لا يقل عن 1 أنثى لكل ذكر في القفص.
   ملاحظة: اعتمادا على بروتوكول المعتمد ، قد يسمح بإضافة 2-3 إناث إلى قفص التربية ويفضل زيادة توليد القابس.
4. قم بإعداد ما لا يقل عن 4 ثلاثيات تكاثر (2 إناث فئران إلى 1 ذكر) لزيادة فرص الحمل المتزامن عبر الأقفاص (ويعرف أيضا باسم المقابس المتعددة في نفس اليوم). سيؤدي ذلك إلى زيادة عدد الأجنة المعزولة في نفس المرحلة التنموية.
5. رتب التزاوج المثالي في فترة ما بعد الظهر أو في المساء قبل الساعة 5 مساء ، ويتم وضع الإناث في قفص الذكور أو العكس. إذا لم يحدث التكاثر خلال 4-5 أيام ، ففكر في تبديل شركاء التزاوج كل يوم.
   ملاحظة: إذا لم تتمكن من التحقق من وجود سدادة مهبلية في صباح اليوم التالي ، فافصل زوج التكاثر في الليلة السابقة (أي عطلة نهاية الأسبوع / العطلات).
6. تحقق من وجود سدادات مهبلية كل يوم في الصباح الباكر. قبل الساعة 9 صباحا هو المفضل.
   1. للتحقق من وجود سدادات مهبلية ، ارفع الفئران الإناث برفق من قاعدة الذيل وراقب فتحة المهبل. ابحث عن كتلة هلامية بيضاء أو كريمية اللون. في كثير من الأحيان ، يمكن أن تكون السدادة المهبلية واضحة ، ولكن إذا لم تكن واضحة ، خذ ملاقط وتحقق برفق من فتحة المهبل. ضع في اعتبارك فقط المقابس الأكثر وضوحا للعزل. راجع الشكل 2C.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان التحقق من وجود سدادات مهبلية في أقرب وقت ممكن في الصباح لتجنب فقدان الحمل المحتمل. يمكن أن تسقط المقابس أو تذوب بعد 12 ساعة.
      ملاحظة: حتى إذا لوحظ وجود سدادة ، فهذا لا يضمن أن أنثى الفأرة ستكون حاملا. إذا لوحظت سدادة جزئية أو معدومة ولكن كان هناك احمرار بالقرب من الفتحة المهبلية لإناث الفئران ، فلا تفكر في عزل هؤلاء الإناث لأن هناك فرصة أقل احتمالا لالتصاق القابس. يختلف احتمال الحمل بعد التزاوج بين سلالات الفئران ويعتمد على مرحلة الدورة الشحمية أثناء التزاوج (الشكل 2).
7. بمجرد ملاحظة سدادة مهبلية ، سجل اليوم. يعتبر ظهر نفس اليوم الذي يتم فيه ملاحظة السدادة المهبلية E0.5. افصل الفئران الإناث عن قفص التكاثر وعزل الأجنة اعتمادا على مرحلة المعدة المطلوبة.
   ملاحظة: لا توفر هذه الطريقة توقيتا دقيقا للتزاوج. تقليديا ، يفترض أن يحدث التزاوج حوالي منتصف الليل في الليلة السابقة. وبالتالي ، تعتبر الأجنة نصف يوم من العمر (E0.5) بحلول ظهر اليوم الذي يتم فيه ملاحظة السدادة المهبلية.

2. عزل أجنة الفئران أثناء المعدة

1. قبل البدء في عزل الجنين ، قم بإعداد جميع الكواشف والمعدات المطلوبة.
   1. نظف المنطقة جيدا باستخدام 70٪ إيثانول. تأكد من غسل وتعقيم جميع أدوات التشريح (الملقط والمقص). احصل على 5 مل معقمة من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) / 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 20 مل DPBS^-/- وضعه على الثلج.
   2. قم بإجراء جميع عمليات العزل باستخدام مجهر مجسم مع مرحلة ضوئية مرسلة وكاميرا للمساعدة في التنميط الظاهري التنموي الإجمالي.
2. القتل الرحيم لسد الفأر الحامل وبدء العزل على الفور.
   1. ضع السد الحامل في غرفة CO₂ مع تعديل معدل تدفق CO₂ لإزاحة 20٪ من حجم القفص في الدقيقة. راقب الماوس عن كثب وتأكد من الموت من خلال ملاحظة عدم وجود حركات التنفس.
   2. الحفاظ على تدفق CO₂ لمدة دقيقتين إضافيتين بعد غياب حركات التنفس. تأكيد القتل الرحيم عن طريق إجراء خلع عنق الرحم.
   3. ضع الفئران في وضع الوقوف الطبيعي على سطح مستو صلب. ثم ، مع الإبهام والإصبع الأول من يد واحدة على الجزء الخلفي من الرقبة عند قاعدة الجمجمة ، ادفع للأمام ولأسفل أثناء السحب للخلف مع اليد الأخرى التي تمسك قاعدة الذيل.
   4. تحقق من فعالية الخلع من خلال الشعور بفصل فقرات عنق الرحم. عندما يتم قطع الحبل الشوكي ، ستكون مساحة 2-4 مم واضحة بين اللقمات القذالية والفقرة العنقية الأولى.
      ملاحظة: لا تقم بالقتل الرحيم لعدة سدود حامل في وقت واحد ، حيث ستتأثر صلاحية الخلية. يمكن استخدام الأيزوفلوران كعامل مخدر بديل إذا تمت الموافقة عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) أو هيئة مماثلة.
3. ضع السد الحامل على ظهره وعقم المنطقة القريبة من فتحة المهبل بالإيثانول.
   1. باستخدام مقص التشريح والملاقط ، ارفع طية الجلد بالقرب من فتحة المهبل وقم بعمل قطع صغير على شكل حرف V ، وكشف ببطء عن رحم السد الحامل (الشكل 3 [السهم الأصفر]).
   2. تشريح القرن الرحمي للسد الحامل عن طريق إمساك أحد طرفيه بملاقط وقطعه ، مع التأكد من إزالة عنق الرحم. ضع قرن الرحم في طبق بتري 10 سم يحتوي على DPBS^-/- على الجليد (الشكل 3).
      ملاحظة: اعتمادا على مرحلة عزل الجنين ، سيشبه الرحم مواقع زرع أصغر أو أكبر (أي "لآلئ" على خيط).
4. باستخدام مقص التشريح والملاقط ، قم بقطع كل موقع زرع ("لآلئ") يحتوي على التورمات العشرية بالداخل ووضعه في DPBS الطازج ^{- / -} في طبق بتري 6 سم على الجليد (الشكل 3).
   ملاحظة: سيحتوي السد الحامل المتوسط على حوالي 6-8 أجنة مزروعة.
5. خذ موقع زرع واحد وضعه على طبق بتري جديد 6 سم أعلى مرحلة المجهر المجسم وأضف 500 ميكرولتر من DPBS^-/- فوقه. اضبط تركيز المجهر ومصدر الضوء (الشكل 3).
   ملاحظة: اعتمادا على حجم موقع الزرع ، قد تختلف كمية DPBS ؛ الهدف هو الحصول على ما يكفي من DPBS بحيث يتم غمر موقع الزرع.
6. باستخدام ملاقط تشريح دقيقة ، قم بإزالة عضلة الرحم من موقع الزرع. اضغط باستمرار على موقع الزرع بمجموعة واحدة من الملقط في يد واحدة وأدخل ببطء زوجا آخر من الملقط باليد الأخرى في نهاية موقع الزرع المقطوع من قرن الرحم ، وكشف ببطء عن تورم النفضية (الشكل 3).
   ملاحظة: لا تسحب أو تشد بشدة على سطح الرحم ، لأنه يمكن أن يؤدي إلى تمزق التورم العشري أو حتى تحلل الجنين.
7. بعد عزل التورم العشري ، تابع الكشف عن الجنين.
   1. امسك الطرف المضاد للانتفاخ العشري بزوج واحد من الملقط ، ومع الزوج الآخر ، قم بعمل قطع أفقي ببطء حوالي 1/4 حجم التورم العشري من الطرف المتوسط (أي غالبا ما تكون النهاية المدببة للتورم العشري).
   2. الآن ، باستخدام كلا الملقطين ، ادفع ببطء من الطرف المضاد للانتفاخ العشري ، وسيخرج الجنين من الطرف المقطوع حديثا (الشكل 3).
      ملاحظة: لا تمزق التورم العشري ، لأن هذا سيكسر الجنين. إذا لزم الأمر ، قم بعمل جروح أصغر على طول الطرف المتوسط للتورم اللبني.
8. بمجرد الكشف عن الجنين ، قم بإزالة أي أنسجة خارج الجنين متصلة.
   1. قد يخرج كيس الأديم الباطن الجداري ومخروط المشيمة الخارجية تلقائيا من الجنين أثناء عملية الكشف ، ولكن إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاستخدم زوجا من الملقط وقم بإزالته مع أي دم أم مرتبط به. ثم ، باستخدام ملقطين ، اضغط باستمرار على الجنين بزوج واحد وقشر ببطء كيس الصفار الحشوي من الجنين باستخدام المجموعة الأخرى.
   2. باستخدام ماصة P20 ، ضع كيس الصفار مع ما لا يزيد عن 10 ميكرولتر من DPBS^-/- من الطبق في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المكون من 8 شرائط على الجليد ، حيث سيتم استخدام هذا للتنميط الجيني في نفس اليوم.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان ألا تكون عينة كيس الصفار ملوثة بأنسجة من السد الحامل. قد يؤدي التلوث إلى تعيين النمط الجيني غير الصحيح للجنين.
9. التقط صورا ميدانية مشرقة للأجنة المعزولة حديثا لضمان تشابه مرحلة رفقاء القمامة. باستخدام ماصة P200 ، قم بسحب الجنين ببطء باستخدام 50 ميكرولتر من DMEM / 10٪ FBS وضعه في أنبوب سعة 1.5 مل على الثلج. دع الأجنة تبقى على الجليد حتى يتم تأكيد الأنماط الجينية.
   ملاحظة: تم الاحتفاظ بالأجنة على الجليد لمدة 3-4 ساعات دون أي تدهور واضح ، ولكن لا تتجاوز هذا الوقت ، حيث سيحدث انخفاض في صلاحية الخلية. قم بتسمية الأجنة وأنابيب التنميط الجيني وفقا لذلك. يتم تشجيع التقاط صور ميدانية ساطعة لتحديد الاختلافات الظاهرية الإجمالية بين الأجنة والتعليق عليها.
10. كرر هذه الخطوات لجميع التورمات اللبنية المتبقية. نظف جميع أدوات التشريح واستخدم مواد بلاستيكية جديدة لكل عزل لضمان عدم التلوث من العزلات السابقة.
    ملاحظة: تأكد من أن إجراءات التشريح تقتصر على 1 ساعة من لحظة جمع موقع الزرع من السد الحامل.
11. المضي قدما في عزل الأجنة من السد الحامل التالي (إذا تم تحديد حالات حمل متزامنة متعددة) قبل الانتقال إلى خطوة التنميط الجيني في نفس اليوم.

3. التنميط الجيني في نفس اليوم (الشكل 4)

1. هضم كل كيس صفار حشوي في أنبوب PCR من 8 أشرطة. باستخدام ماصة P20 ، أضف 19.3 ميكرولتر من محلول تحلل الحمض النووي لقالب تفاعل البوليميراز المتسلسل و 0.7 ميكرولتر من 0.2 ميكروغرام / مل بروتيناز K إلى كل عينة كيس صفار.
2. دوامة العينة لمدة 10 ثوان وتدور لأسفل لوضع العينات في الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام جهاز طرد مركزي صغير مع محول شريطي عند 1000 × جم لمدة 10 ثوان. ضع أنبوب PCR المكون من 8 شرائط في كتلة حرارة 85 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة ودوامة لمدة 5 ثوان كل 5 دقائق.
   ملاحظة: من المهم أخذ عينات دوامة أثناء الهضم لزيادة تحلل الخلايا إلى أقصى حد في 45 دقيقة.
3. بعد 45 دقيقة ، قم بتدوير شريط الأنبوب لأسفل باستخدام جهاز طرد مركزي صغير مع محول شريطي عند 1000 × جم لمدة 10 ثوان ، وتابع تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد الهوية الجينية المطلوبة. كمرجع ، يتم توفير نموذج بروتوكول لنظام Cre-lox. فيما يلي مثال على شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل للتنميط الجيني Cre. صمم مواد أولية لتضخيم المناطق 5 و 3 من موقع Cre المستهدف.
4. لإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل للتنميط الجيني Cre ، قم بإعداد مزيج رئيسي PCR لكل أنبوب PCR مكون من 8 شرائط لكل كيس صفار يحتوي على 10 ميكرولتر من مزيج بوليميراز Taq DNA ، و 0.5 ميكرولتر من 0.5 ميكرومتر إلى الأمام Cre التمهيدي ، و 0.5 ميكرولتر من 0.5 ميكرومتر التمهيدي Cre العكسي ، و 5 ميكرولتر من الماء المعتمد من PCR ، و 4 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني لكيس الصفار.
   ملاحظة: في حالة استخدام بروتوكول تم تحسينه للتنميط الجيني لذيل الفأر ، أضف ضعف كمية الحمض النووي المستخدمة عادة للحصول على نتائج أنظف.
5. بمجرد إجراء المزيج الرئيسي PCR ، قم بتشغيل برنامج تضخيم الدورة الحرارية PCR. بالنسبة للتنميط الجيني Cre ، تكون الدورة كما يلي: (1) 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، (2) 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، (3) 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، (4) 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، الخطوة المتكررة 2-4 لمدة 34 دورة ، (5) 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، (6) 4 درجات مئوية. قم بتشغيل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على جل أغاروز 1٪ لاستخلاص استنتاجات التنميط الجيني.
   ملاحظة: إذا كان هناك أكثر من تفاعل البوليميراز المتسلسل ضروريا لتحديد الهوية الجينية ، فقم بتشغيل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في وقت واحد لتحسين التوقيت. لتسريع العملية ، قم بإعداد هلام الأغاروز قبل يوم من يوم التجربة وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل. لا تفكر في أي عينات بدون أنماط وراثية واضحة. ضع في اعتبارك كلا من النمط الوراثي ومرحلة النمو للعينات ، حيث يمكن أن يكون زملاء القمامة في مراحل مختلفة من المعدة ويحتمل أن تكون النتائج منحرفة. عند إجراء التنميط الجيني لأليلات LoxP ، قد تختلف نطاقات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتوقعة في الجل اعتمادا على برنامج تشغيل Cre المستخدم. على سبيل المثال ، إذا تم التعبير عن برنامج تشغيل Cre في كيس الصفار الحشوي ، فسيظهر شريط Loxp متغيرا في أجنة Cre-positive (Cre +) ، مقارنة ب Cre-negative (Cre-). ومع ذلك ، إذا لم يتم التعبير عن Cre في كيس الصفار الحشوي ، فسيكون حجم شريط Loxp بنفس الحجم في Cre + و Cre- embryos (أي أن أليلات Loxp لن تتخبط في سلالة كيس الصفار). يعتبر الجنين الذي يحمل أليل Cre + واحد واثنين من أليلات Loxp جنينا KO مشروطا. ومع ذلك ، لتأكيد حذف الجين المتخبط ، يوصى بإجراء تأكيد لضربة قاضية الجين على الخلايا التي تعبر عن محرك Cre ، إما عن طريق تكرار بروتوكول التنميط الجيني أو عن طريق تحليل qPCR لمستويات mRNA للجين المتخبط (الشكل 4D ، E).
6. قم بتخزين عينات كيس الصفار المهضومة المتبقية في الفريزر -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

4. تفكك الخلايا للأجنة وصلاحية الخلية

1. بمجرد تأكيد الأنماط الجينية ، خذ ماصة P200 وماصة 50 ميكرولتر من DMEM / 10٪ FBS. اجمع الأجنة التي لها نفس النمط الجيني في أنبوب جديد سعة 1.5 مل وضع الأنبوب على الجليد.
   ملاحظة: لا تتابع التجربة إذا لم يكن هناك ما لا يقل عن 5 أجنة لكل مجموعة (E7-E7.5) أو 3 (E7.75-E8) ، حيث سينخفض عدد الخلايا وصلاحيتها بشكل كبير.
2. بعد تجميع الأجنة بناء على الأنماط الجينية ، اسمح لها بالاستقرار في قاع الأنبوب. اغسل الأجنة المجمعة بإضافة 50 ميكرولتر من DPBS^-/- ، ثم انتظر حتى تستقر الأجنة قبل إزالة أكبر قدر ممكن من DPBS^-/- دون إزالة الأجنة من الأنبوب. كرر هذه الخطوة مرتين.
   ملاحظة: إن تثبيت الأنبوب سعة 1.5 مل لأعلى إلى مصدر ضوء أو باتجاه النافذة سيجعل من السهل رؤية الأجنة تستقر في قاع الأنبوب.
3. أضف 100 ميكرولتر من التربسين إلى الأجنة المجمعة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في كتلة حرارية لمدة 5 دقائق. حرك الأنابيب سعة 1.5 مل برفق كل 30 ثانية لمساعدة الخلايا على الانفصال.
   ملاحظة: لا تستخدم دوامة أو ماصة أثناء عملية التربسين، لأنها تلحق الضرر بالخلايا. إذا تم تجميع أكثر من 5 أجنة (E7-E7.5) أو 3 أجنة (E7.75-E8) ، فقم بإجراء هضم التربسين في أنبوب آخر بكمية مكافئة من التربسين (~ 20 ميكرولتر لكل 1 جنين). استخدم ~ 20 ميكرولتر من التربسين لكل جنين (E6.5-E7.5) ، 35 ميكرولتر لكل جنين (E7.75) ، و 40 ميكرولتر للجنين (E8).
4. بعد 5 دقائق، قم بتحييد التربسين باستخدام 300 ميكرولتر من DMEM/10٪ FBS. الطرد المركزي للأجنة المجمعة عند 100 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). بعد الطرد المركزي ، ستظهر حبيبات صغيرة لجميع العينات. أعد تعليق الكريات في 40 ميكرولتر من DMEM / 10٪ FBS وضعها على الثلج.
   ملاحظة: سيختلف حجم الحبيبات حسب عدد الأجنة المجمعة. من الممكن أن تكون الحبيبات غير مرئية ولكن تابع الخطوة التالية. تعتمد كمية DMEM / 10٪ FBS المطلوبة لتحييد التربسين على كمية التربسين المضافة. أضف 3 أضعاف كمية DMEM / 10٪ إلى كمية التربسين.
5. حدد تركيز الخلايا المعاد تعليقها (40 ميكرولتر) باستخدام عداد الخلايا الآلي. امزج 5 ميكرولتر من الخلايا مع 5 ميكرولتر من التريبان الأزرق في أنبوب جديد سعة 1.5 مل. تخلط الماصة جيدا وماصة على شريحة لتحديد رقم الخلية وصلاحيتها. التركيز الأمثل للخلايا هو 700-1200 خلية / ميكرولتر ، وصلاحية الخلية 90٪ أو أعلى.
   ملاحظة: إذا كان التركيز أقل من 200 خلية / ميكرولتر وكانت الصلاحية أقل من 50٪ ، فلا تستمر في التجربة. إذا كان تركيز الخلية مرتفعا جدا ، فقم بتخفيف تعليق الخلية وإعادة فرز الخلايا مرة أخرى. إذا لوحظت كتل الخلايا ، فاستخدم مصفاة خلية لضمان تعليق خلية واحدة.
6. انتقل إلى تقسيم الخلية الواحدة باستخدام شريحة الموائع الدقيقة واتبع البروتوكول من الشركات المصنعة لرقائق الموائع الدقيقة¹¹.

5. أجنة فأر عزل النوى (خيار لنقاط زمنية جنينية أكبر من E8 فصاعدا)

1. تحضير تحلل طازج وغسل المخازن المؤقتة الموضحة في الجدول 1 ، ووضعها على الجليد.
   ملاحظة: يمكن إجراء عزل النوى على عينات طازجة أو مجمدة. إذا تم تجميد العينات ، اتركها تذوب لمدة 2-5 دقائق على الجليد.
2. قبل بدء التجربة ، تأكد من جميع الأنماط الجينية واجمع فقط الأجنة ذات الأنماط الجينية الواضحة.
3. باستخدام ماصة P200 ، أضف 50 ميكرولتر من محلول تحلل النوى إلى الأجنة المجمعة في أنبوب سعة 1.5 مل ، بهدف الحصول على 3 أجنة على الأقل لكل مجموعة متحولة. اترك العينات تجلس على الجليد مع مخزن التحلل لمدة 5 دقائق ودوامة كل 30 ثانية.
4. بعد 5 دقائق من الحضانة ، أجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. باستخدام ماصة P200 ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من محلول الغسيل. بمجرد إعادة الإرسال ، أجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
5. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها في 40 ميكرولتر من DPBS^-/-. عد الخلايا باستخدام عداد خلايا آلي. امزج 5 ميكرولتر من النوى مع 5 ميكرولتر من التريبان الأزرق في أنبوب جديد سعة 1.5 مل. ماصة الخليط جيدا وتحميله على شريحة لتحديد رقم الخلية وصلاحيتها.
   ملاحظة: الغشاء النووي هو نفاذية إلى تريبان الأزرق. لذلك ، فإن صبغة النوى المعزولة موجبة ل Tripan Blue. في عداد الخلايا الآلي ، يتم استخدام النسبة المئوية للخلايا الميتة لتقدير النسبة المئوية للنوى المعزولة (الشكل 5 أ).
6. إذا كانت النسبة المئوية للنوى السليمة أكبر من 90٪ (مما يعني أن 90٪ على الأقل من النوى ملطخة باللون الأزرق المثقب وتظهر شكلا دائريا وجانبا منتفخا ؛ راجع الشكل 5B ، C) ، تابع استخدام شريحة الموائع الدقيقة واتبع البروتوكول من مصنعي رقائق الموائع الدقيقة¹¹.

6. تقسيم الخلية الواحدة (بما في ذلك تضخيم cDNA وبناء المكتبة)

1. تابع على الفور بروتوكول تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية باتباع بروتوكول الشركة المصنعة لشريحة الموائع الدقيقة¹¹ للحصول على أفضل النتائج. اضبط استرداد الخلية المستهدفة على 6000 خلية أو أكبر.

7. التسلسل

1. بعد إنشاء المكتبات ، قم بقياس توزيع حجم الشظايا وتركيزات العينات باستخدام محلل كهربائي آلي.
   ملاحظة: تتراوح توزيعات حجم الشظايا المثلى بين 300-1000 نقطة أساس.
2. العينات جاهزة للتحميل في جهاز التسلسل. تجمع المكتبات من عينات مختلفة معا. تركيز التحميل النهائي للمكتبات المجمعة هو 750 pM في حجم إجمالي قدره 24 ميكرولتر. قم بتحميل المكتبات المجمعة في خرطوشة الكاشف ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة للتسلسل¹².
3. قم بتسلسل المكتبات التي تم تحميلها في خلية التدفق والخرطوشة المجمعة مسبقا وفقا لعمق التسلسل المطلوب مع الفهرسة المزدوجة ذات النهاية الزوجية. يقرأ التسلسل الملتزم بالبروتوكول الذي حدده مصنعو رقائق الموائع الدقيقة على النحو التالي¹¹: اقرأ 1: 28 دورة ، مؤشر i7: 10 دورات ، مؤشر i5: 10 دورات ، وقراءة 2: 90 دورة. بعد الانتهاء من التسلسل ، تخضع البيانات لتحليل المعلوماتية الحيوية.
4. استخدام أساليب المعلوماتية الحيوية لأداء ضوابط الجودة. يتضمن ذلك تقييم عدد الخلايا المتسلسلة ، والقراءات لكل خلية ، وعدد الجينات المعينة لكل خلية.
   ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، يبلغ عدد الخلايا المتسلسلة 80٪ على الأقل من الخلايا المستهدفة. يوصى بأن يكون عدد القراءات لكل خلية 30000 على الأقل ، وعدد الجينات المكتشفة أعلى من 3000 (لعينات الفئران).

النتائج

تهدف المنهجية المصممة في هذه الورقة على وجه التحديد إلى تعزيز تحضير عينات الأجنة لأوميكس وحيد الخلية من E6.5 إلى E8. يتكون خط الأنابيب القوي هذا من خمس خطوات رئيسية: الحمل المتزامن ، وعزل الأجنة ، والتنميط الجيني في نفس اليوم ، وتفكك الخلايا ، وتقييم صلاحية الخلية (الشكل 1 أ). ب?...

Discussion

يتم تقديم خط أنابيب قوي في هذه الورقة للحصول على معلقات عالية الجودة للخلية الواحدة والنوى من أجنة الفئران المعدة ، المصممة خصيصا لتسهيل الدراسات حول آليات تحديد مصير الخلية في التطور المبكر. تعالج هذه الطريقة فجوة حاسمة في مجال المعدة من خلال تحسين تحليل الأجنة التي تتطلب أنماطا وراثية ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000