تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأجنة الفئران الكاملة الطافرة: من الأرومة إلى نهاية المعدة

Summary

تؤسس هذه الورقة خط أنابيب لمعلقات عالية الجودة للخلية المفردة والنوى لأجنة الفئران المعدة لتسلسل الخلايا المفردة والنوى.

Abstract

على مدى العقد الماضي ، أصبحت مناهج الخلية الواحدة المعيار الذهبي لدراسة ديناميكيات التعبير الجيني ، وعدم تجانس الخلايا ، وحالات الخلايا داخل العينات. قبل تقدم الخلية الواحدة ، كانت جدوى التقاط المشهد الخلوي الديناميكي والتحولات الخلوية السريعة أثناء التطور المبكر محدودة. في هذه الورقة ، تم تصميم خط أنابيب قوي لإجراء تحليل أحادي الخلية ونوى على أجنة الفئران من اليوم الجنيني E6.5 إلى E8 ، وهو ما يتوافق مع بداية واكتمال المعدة. المعدة هي عملية أساسية أثناء التطور تحدد الطبقات الجرثومية الثلاث: الأديم المتوسط ، والأديم الظاهر ، والأديم الباطن ، والتي تعتبر ضرورية لتكوين الأعضاء. تتوفر أدبيات واسعة النطاق حول omics أحادية الخلية المطبقة على الأجنة المحيطة بالمعدة من النوع البري. ومع ذلك ، لا يزال تحليل الخلية الواحدة للأجنة الطافرة نادرا وغالبا ما يقتصر على المجموعات التي تم فرزها بواسطة FACS. ويرجع ذلك جزئيا إلى القيود التقنية المرتبطة بالحاجة إلى التنميط الجيني ، والحمل الموقوت ، وعدد الأجنة ذات الأنماط الجينية المرغوبة لكل حمل ، وعدد الخلايا لكل جنين في هذه المراحل. هنا ، يتم تقديم منهجية مصممة للتغلب على هذه القيود. تضع هذه الطريقة إرشادات للتكاثر والحمل الموقوت لتحقيق فرصة أكبر للحمل المتزامن مع الأنماط الجينية المرغوبة. تسمح خطوات التحسين في عملية عزل الجنين إلى جانب بروتوكول التنميط الجيني في نفس اليوم (3 ساعات) بإجراء خلية مفردة قائمة على القطرات الدقيقة في نفس اليوم ، مما يضمن قابلية عالية للبقاء ونتائج قوية. تتضمن هذه الطريقة أيضا إرشادات لعزل النوى الأمثل عن الأجنة. وبالتالي ، فإن هذه الأساليب تزيد من جدوى نهج الخلية الواحدة للأجنة الطافرة في مرحلة المعدة. نتوقع أن تسهل هذه الطريقة تحليل كيفية تشكيل الطفرات للمشهد الخلوي للمعدة.

Introduction

المعدة هي عملية أساسية مطلوبة للتطور الطبيعي. تحدث هذه العملية السريعة والديناميكية عندما تنتقل الخلايا متعددة القدرات إلى سلائف خاصة بالنسب تحدد كيفية تكوين الأعضاء. لسنوات ، تم تعريف المعدة منذ فترة طويلة على أنها تكوين ثلاث مجموعات متجانسة إلى حد كبير: الأديم المتوسط ، والأديم الظاهر ، والأديم الباطن. ومع ذلك ، فإن التقنيات عالية الدقة والعدد الناشئ من نماذج الخلايا الجذعية الجنينية ^1,2 تكشف النقاب عن عدم تجانس غير مسبوق بين طبقات الجراثيم المبكرة ^3,4. هذا يشير إلى أنه لا يزال هناك الكثير الذي يجب الكشف عنه حول الآليات التي تنظم مجموعات الخلايا المت....

Protocol

تمت الموافقة رسميا على هذا البروتوكول وجميع التجارب على الموصوفة ووفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية التي وضعتها لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة تمبل ، والتي تتبع المبادئ التوجيهية الدولية لجمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر. كانت جميع الفئران الموصوفة على سلالة الخلفية C57 / BL6N. لم يلاحظ أي مخاوف تتعلق بصحة في هذه الدراسات.

1. مستعمرة تربية والحمل الموقوت

1. وقت الحمل عن طريق تصور سدادة مهبلية. يعتبر الظهر في يوم القابس E0.5.
2. الفئران المنزلية في أقفاص مع مواد الفراش التي تحتوي على الفراش الخشب الصلب المتكسرة ومواد التعشيش الورقية.
   1. يحتوي كل قفص على تشاو الفأر والمياه العذبة وعنصر التخصيب (على سبيل ....

النتائج

تهدف المنهجية المصممة في هذه الورقة على وجه التحديد إلى تعزيز تحضير عينات الأجنة لأوميكس وحيد الخلية من E6.5 إلى E8. يتكون خط الأنابيب القوي هذا من خمس خطوات رئيسية: الحمل المتزامن ، وعزل الأجنة ، والتنميط الجيني في نفس اليوم ، وتفكك الخلايا ، وتقييم صلاحية الخلية (الشكل 1 أ). ب?.......

Discussion

يتم تقديم خط أنابيب قوي في هذه الورقة للحصول على معلقات عالية الجودة للخلية الواحدة والنوى من أجنة الفئران المعدة ، المصممة خصيصا لتسهيل الدراسات حول آليات تحديد مصير الخلية في التطور المبكر. تعالج هذه الطريقة فجوة حاسمة في مجال المعدة من خلال تحسين تحليل الأجنة التي تتطلب أنماطا وراثية ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000