Séquençage de l’ARN unicellulaire d’embryons entiers de souris mutantes : de l’épiblaste à la fin de la gastrulation

Résumé

Cet article établit un pipeline pour des suspensions de cellules uniques et de noyaux de haute qualité d’embryons de souris gaztrulants pour le séquençage de cellules uniques et de noyaux.

Résumé

Au cours de la dernière décennie, les approches unicellulaires sont devenues la référence pour l’étude de la dynamique de l’expression des gènes, de l’hétérogénéité cellulaire et des états cellulaires au sein des échantillons. Avant les progrès de la cellule unique, la faisabilité de capturer le paysage cellulaire dynamique et les transitions cellulaires rapides au cours du développement précoce était limitée. Dans cet article, un pipeline robuste a été conçu pour effectuer l’analyse de cellules uniques et de noyaux sur des embryons de souris du jour embryonnaire E6.5 à E8, correspondant au début et à la fin de la gastrulation. La gastrulation est un processus fondamental au cours du développement qui établit les trois couches germinales : mésoderme, ectoderme et endoderme, qui sont essentielles à l’organogenèse. Il existe une littérature abondante sur les omiques unicellulaires appliquées aux embryons périgastrulants de type sauvage. Cependant, l’analyse unicellulaire d’embryons mutants est encore rare et souvent limitée aux populations triées par FACS. Cela est dû en partie aux contraintes techniques associées à la nécessité du génotypage, aux grossesses programmées, au nombre d’embryons avec les génotypes souhaités par grossesse et au nombre de cellules par embryon à ces stades. Nous présentons ici une méthodologie conçue pour surmonter ces limites. Cette méthode établit des lignes directrices en matière de reproduction et de grossesse chronométrée afin d’augmenter les chances de grossesses synchronisées avec les génotypes souhaités. Les étapes d’optimisation du processus d’isolement des embryons couplées à un protocole de génotypage le jour même (3 h) permettent de réaliser des cellules uniques à base de microgouttelettes le même jour, garantissant ainsi une grande viabilité des cellules et des résultats robustes. Cette méthode comprend en outre des lignes directrices pour l’isolement optimal des noyaux à partir d’embryons. Ainsi, ces approches augmentent la faisabilité des approches unicellulaires d’embryons mutants au stade de la gastrulation. Nous prévoyons que cette méthode facilitera l’analyse de la façon dont les mutations façonnent le paysage cellulaire de la gastrula.

Introduction

La gastrulation est un processus fondamental nécessaire au développement normal. Ce processus rapide et dynamique se produit lorsque les cellules pluripotentes se transforment en précurseurs spécifiques à la lignée qui définissent la formation des organes. Pendant des années, la gastrulation a longtemps été définie comme la formation de trois populations largement homogènes : le mésoderme, l’ectoderme et l’endoderme. Cependant, les technologies à haute résolution et un nombre émergent de modèles de cellules souches embryonnaires ^1,2 révèlent une hétérogénéité sans précédent parmi les couches germinales précoce....

Protocole

Ce protocole et toutes les expériences sur les animaux décrites ont été officiellement approuvés et conformes aux directives institutionnelles établies par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Temple, qui suit les directives internationales de l’Association pour l’évaluation et l’accréditation des soins aux animaux de laboratoire. Toutes les souris décrites appartenaient à la souche de fond C57/BL6N. Aucune préoccupation pour la santé animale n’a été observée dans ces études.

1. Colonie de reproduction et grossesses programmées

1. Chronométrer les grossesses par la visualisati....

Discussion

Cet article présente un pipeline robuste pour l’obtention de suspensions de cellules uniques et de noyaux de haute qualité à partir d’embryons de souris gaztrulants, spécialement conçues pour faciliter les études sur les mécanismes de spécification du destin cellulaire dans le développement précoce. Cette méthode comble une lacune cruciale dans le domaine de la gastrulation en optimisant l’analyse des embryons nécessitant des génotypes, tels que le sexe ou les gènes somatiques. En utilisant des modèl.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000