Séquençage de l’ARN unicellulaire d’embryons entiers de souris mutantes : de l’épiblaste à la fin de la gastrulation

Résumé

Cet article établit un pipeline pour des suspensions de cellules uniques et de noyaux de haute qualité d’embryons de souris gaztrulants pour le séquençage de cellules uniques et de noyaux.

Résumé

Au cours de la dernière décennie, les approches unicellulaires sont devenues la référence pour l’étude de la dynamique de l’expression des gènes, de l’hétérogénéité cellulaire et des états cellulaires au sein des échantillons. Avant les progrès de la cellule unique, la faisabilité de capturer le paysage cellulaire dynamique et les transitions cellulaires rapides au cours du développement précoce était limitée. Dans cet article, un pipeline robuste a été conçu pour effectuer l’analyse de cellules uniques et de noyaux sur des embryons de souris du jour embryonnaire E6.5 à E8, correspondant au début et à la fin de la gastrulation. La gastrulation est un processus fondamental au cours du développement qui établit les trois couches germinales : mésoderme, ectoderme et endoderme, qui sont essentielles à l’organogenèse. Il existe une littérature abondante sur les omiques unicellulaires appliquées aux embryons périgastrulants de type sauvage. Cependant, l’analyse unicellulaire d’embryons mutants est encore rare et souvent limitée aux populations triées par FACS. Cela est dû en partie aux contraintes techniques associées à la nécessité du génotypage, aux grossesses programmées, au nombre d’embryons avec les génotypes souhaités par grossesse et au nombre de cellules par embryon à ces stades. Nous présentons ici une méthodologie conçue pour surmonter ces limites. Cette méthode établit des lignes directrices en matière de reproduction et de grossesse chronométrée afin d’augmenter les chances de grossesses synchronisées avec les génotypes souhaités. Les étapes d’optimisation du processus d’isolement des embryons couplées à un protocole de génotypage le jour même (3 h) permettent de réaliser des cellules uniques à base de microgouttelettes le même jour, garantissant ainsi une grande viabilité des cellules et des résultats robustes. Cette méthode comprend en outre des lignes directrices pour l’isolement optimal des noyaux à partir d’embryons. Ainsi, ces approches augmentent la faisabilité des approches unicellulaires d’embryons mutants au stade de la gastrulation. Nous prévoyons que cette méthode facilitera l’analyse de la façon dont les mutations façonnent le paysage cellulaire de la gastrula.

Introduction

La gastrulation est un processus fondamental nécessaire au développement normal. Ce processus rapide et dynamique se produit lorsque les cellules pluripotentes se transforment en précurseurs spécifiques à la lignée qui définissent la formation des organes. Pendant des années, la gastrulation a longtemps été définie comme la formation de trois populations largement homogènes : le mésoderme, l’ectoderme et l’endoderme. Cependant, les technologies à haute résolution et un nombre émergent de modèles de cellules souches embryonnaires ^1,2 révèlent une hétérogénéité sans précédent parmi les couches germinales précoces ^3,4. Cela suggère qu’il reste encore beaucoup à découvrir sur les mécanismes régulant les populations cellulaires distinctes de la gastrula. Le développement embryonnaire de souris a été l’un des meilleurs modèles pour étudier les décisions précoces du destin cellulaire pendant la gastrulation ^3,5. La gastrulation chez la souris est rapide, car l’ensemble du processus de gastrulation se produit dans les 48 heures, du jour embryonnaire E6.5 à E8⁵.

Les progrès récents des technologies unicellulaires ont permis une cartographie détaillée du développement embryonnaire de souris de type sauvage, fournissant un aperçu complet des paysages cellulaires et moléculaires des embryons pendant la gastrulation 3,4,6,7,8. Cependant, l’analyse des embryons mutants à ces stades est moins fréquente et souvent limitée aux populations triées par FACS ^9,10. La rareté de la littérature reflète les défis techniques associés à la manipulation et à la préparation de cellules uniques d’embryons gastrulants qui nécessitent un génotypage. La capture du processus dynamique de gastrulation peut poser des défis en raison de sa nature rapide, en particulier pour comprendre les embryons mutants. Le moment et la synchronisation des grossesses sont essentiels, car même de légères différences entre les grossesses programmées peuvent être interprétées à tort comme un phénotype développemental résultant du gène mutant. Cela devient particulièrement important lorsque le gène mutant influence le processus de gastrulation^13,14. Dans cette étude, des lignes directrices sont établies pour obtenir des grossesses synchronisées par la visualisation des bouchons vaginaux (c’est-à-dire la masse de liquide séminal coagulé formée dans le vagin de la femelle après l’accouplement). De plus, une stratégie est conçue pour obtenir des données unicellulaires robustes à partir d’embryons gastrulants mutants de E6.5 à E8. Cette stratégie est conçue pour surmonter les contraintes liées au faible nombre d’embryons avec le génotype souhaité par grossesse et à la diminution de la viabilité causée par la congélation-décongélation d’embryons ou de cellules.

Cet article décrit une méthodologie optimisée depuis l’établissement de grossesses programmées via des bouchons vaginaux jusqu’au séquençage final de cellules uniques/noyaux. Cette méthode explique comment augmenter le nombre de grossesses synchronisées pour obtenir un plus grand nombre d’embryons avec le génotype souhaité, des isolements de cellules/noyaux pour améliorer la viabilité des cellules et un protocole de génotypage le jour même. Ce manuscrit décrit également le processus d’isolement des embryons à différents points temporels de la gastrulation. La méthodologie permet d’augmenter le nombre de cellules/noyaux embryonnaires viables finaux pour le séquençage, garantissant ainsi des données de séquençage de haute qualité. Par conséquent, cette méthode ouvrira la porte à des études unicellulaires d’embryons gaztrulants nécessitant un génotypage.

Protocole

Ce protocole et toutes les expériences sur les animaux décrites ont été officiellement approuvés et conformes aux directives institutionnelles établies par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Temple, qui suit les directives internationales de l’Association pour l’évaluation et l’accréditation des soins aux animaux de laboratoire. Toutes les souris décrites appartenaient à la souche de fond C57/BL6N. Aucune préoccupation pour la santé animale n’a été observée dans ces études.

1. Colonie de reproduction et grossesses programmées

1. Chronométrer les grossesses par la visualisation d’un plug vaginal. Midi le jour de la prise est considéré comme E0.5.
2. Souris domestiques dans des cages avec une litière contenant de la litière en bois dur déchiqueté et du matériel de nidification en papier.
   1. Chaque cage contient de la nourriture de souris, de l’eau douce et un objet d’enrichissement (p. ex. tunnel et matériel de nidification). Suivez et collectez quotidiennement des informations sur la colonie pendant la reproduction programmée.
   2. Consignez toutes les informations telles que l’âge de la souris, le nombre de grossesses qu’une souris femelle a eues, le nombre de bouchons placés par une souris mâle et le stade de l’œstrus (figure 2) pour les souris femelles.
      REMARQUE : Les femelles qui ont déjà mis bas 1 à 2 fois donneront naissance à des portées plus grandes lors de futures grossesses.
3. Avant de commencer les grossesses programmées, hébergez la souris mâle seule dans une cage 1 semaine avant la reproduction. Pendant la semaine d’initiation à la reproduction, introduire au moins 1 femelle par mâle dans la cage.
   REMARQUE : Selon le protocole approuvé pour l’animal, l’ajout de 2 à 3 femelles dans une cage d’élevage peut être autorisé et est préférable pour augmenter la génération de bouchons.
4. Mettez en place au moins 4 trios de reproduction (2 souris femelles pour 1 mâle) pour augmenter les chances de grossesses synchronisées dans les cages (c’est-à-dire plusieurs prises dans la même journée). Cela augmentera le nombre d’embryons isolés au même stade de développement.
5. Organisez l’accouplement idéal dans l’après-midi ou le soir avant 17 heures, et les femelles sont placées dans la cage du mâle ou vice versa. Si la reproduction n’a pas lieu dans les 4 à 5 jours, envisagez de changer de partenaire d’accouplement tous les deux jours.
   REMARQUE : Si vous ne parvenez pas à vérifier la présence d’un plug vaginal le lendemain matin, séparez le couple reproducteur la veille (c’est-à-dire le week-end/les jours fériés).
6. Vérifiez la présence de bouchons vaginaux tous les jours tôt le matin ; avant 9 heures du matin est préférable.
   1. Pour vérifier la présence de bouchons vaginaux, soulevez doucement les souris femelles par la base de la queue et observez l’ouverture vaginale. Recherchez une masse gélatineuse de couleur blanche ou crème. Souvent, le bouchon vaginal peut être évident, mais s’il n’est pas clair, prenez une pince à épiler et sondez doucement l’ouverture vaginale. Ne considérez que les fiches les plus apparentes pour l’isolation. Reportez-vous à la Figure 2C.
      REMARQUE : Il est essentiel de vérifier la présence de bouchons vaginaux le plus tôt possible le matin pour éviter de manquer une grossesse potentielle. Les bouchons peuvent tomber ou se dissoudre après 12 h.
      REMARQUE : Même si un bouchon est observé, cela ne garantit pas que la souris femelle sera enceinte. Si un bouchon partiel ou aucun bouchon n’est observé, mais qu’il y a une rougeur près de l’ouverture vaginale des souris femelles, ne considérez pas ces femelles comme isolantes car il y a moins de chances que le bouchon colle. La probabilité de gestation après l’accouplement varie selon les souches de souris et dépend de la phase du cycle œstral pendant l’accouplement (figure 2).
7. Une fois qu’un plug vaginal est observé, notez la journée. Le midi du même jour où le plug vaginal est observé est considéré comme E0.5. Séparez les souris femelles de la cage d’élevage et isolez les embryons en fonction du stade de gastrulation souhaité.
   REMARQUE : Cette méthode ne fournit pas de moment précis pour l’accouplement. Traditionnellement, l’accouplement est supposé avoir lieu vers minuit la nuit précédente. Par conséquent, les embryons sont considérés comme âgés d’une demi-journée (E0.5) à midi le jour où le plug vaginal est observé.

2. Isolement des embryons de souris pendant la gastrulation

1. Avant de commencer l’isolement de l’embryon, préparez tous les réactifs et l’équipement nécessaires.
   1. Nettoyez soigneusement la zone avec de l’éthanol à 70 %. Assurez-vous que tous les outils de dissection (pinces et ciseaux) sont lavés et stérilisés. Procurez-vous 5 ml stériles de milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco/sérum de veau fœtal à 10 % et 20 ml de DPBS^{-/- et placez-les} sur de la glace.
   2. Effectuer toutes les isolements à l’aide d’un stéréomicroscope doté d’une platine de lumière transmise et d’une caméra pour aider au phénotypage macroscopique du développement.
2. Euthanasiez la digue de souris enceinte et commencez immédiatement l’isolement.
   1. Placez la mère enceinte dans une chambre de CO₂ avec le débit de CO₂ ajusté pour déplacer 20 % du volume de la cage par minute. Surveillez de près la souris et confirmez la mort en observant l’absence de mouvements respiratoires.
   2. Maintenez le flux de CO₂ pendant 2 minutes supplémentaires après l’absence de mouvements respiratoires. Confirmer l’euthanasie en effectuant une luxation cervicale.
   3. Placez les souris dans une position debout normale sur une surface ferme et plane. Ensuite, avec le pouce et l’index d’une main contre l’arrière du cou à la base du crâne, poussez vers l’avant et vers le bas tout en tirant vers l’arrière avec l’autre main tenant la base de la queue.
   4. Vérifier l’efficacité de la luxation en palpant la séparation des vertèbres cervicales. Lorsque la moelle épinière est sectionnée, un espace de 2 à 4 mm sera palpable entre les condyles occipitaux et la première vertèbre cervicale.
      REMARQUE : N’euthanasiez pas plusieurs mères gestantes à la fois, car la viabilité cellulaire serait affectée. L’isofluorane peut être utilisé comme agent anesthésique alternatif s’il est approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) ou un organisme équivalent.
3. Placez la mère enceinte sur son dos et stérilisez la zone près de l’ouverture vaginale avec de l’éthanol.
   1. À l’aide de ciseaux de dissection et d’une pince à épiler, soulevez le pli cutané près de l’ouverture vaginale et faites une petite incision en forme de V, révélant lentement l’utérus de la mère enceinte (figure 3 [flèche jaune]).
   2. Disséquez la corne utérine de la mère enceinte en tenant une extrémité de celle-ci avec une pince à épiler et en coupant le long de celle-ci, en vous assurant de retirer le col de l’utérus. Placez la corne utérine dans une boîte de Pétri de 10 cm contenant du DPBS^-/- sur de la glace (Figure 3).
      REMARQUE : Selon le stade d’isolement de l’embryon, l’utérus ressemblera à des sites d’implantation plus petits ou plus grands (c’est-à-dire des « perles » sur un fil).
4. À l’aide de ciseaux de dissection et d’une pince à épiler, coupez chaque site d’implantation (« perles ») contenant les gonflements déciduals à l’intérieur et placez-les dans des DPBS^-/- frais dans une boîte de Pétri de 6 cm sur de la glace (Figure 3).
   REMARQUE : Une mère enceinte moyenne aura environ 6 à 8 embryons implantés.
5. Prenez un site d’implantation et placez-le sur une nouvelle boîte de Pétri de 6 cm au-dessus de la platine du stéréomicroscope et ajoutez 500 μL de DPBS^-/- par-dessus. Réglez la mise au point du microscope et la source lumineuse (Figure 3).
   REMARQUE : Selon la taille du site d’implantation, la quantité de DPBS peut varier ; l’objectif est d’avoir suffisamment de DPBS pour que le site d’implantation soit submergé.
6. À l’aide d’une pince à épiler à dissection à pointe fine, retirez le muscle utérin du site d’implantation. Maintenez le site d’implantation avec une pince à épiler dans une main et insérez lentement une autre paire de pinces avec l’autre main dans l’extrémité du site d’implantation coupé de la corne utérine, révélant lentement le gonflement décidua (Figure 3).
   REMARQUE : Ne tirez pas ou ne tirez pas trop fort sur la surface utérine, car cela peut entraîner la rupture du gonflement décidual ou même la lyse de l’embryon.
7. Une fois que le gonflement décidual est isolé, procédez à la révélation de l’embryon.
   1. Tenez l’extrémité anti-mésométriale du gonflement décidual à l’aide d’une paire de pinces et, avec l’autre paire, faites lentement une coupe horizontale d’environ 1/4 de la taille du gonflement décidual à partir de l’extrémité mésomentale (c’est-à-dire souvent l’extrémité la plus pointue du gonflement décidual).
   2. Maintenant, avec les deux pinces, poussez lentement à partir de l’extrémité anti-mésométriale du gonflement décidual, et l’embryon sortira de l’extrémité mésométriale fraîchement coupée (Figure 3).
      REMARQUE : Ne déchirez pas le gonflement décidual, car cela briserait l’embryon. Si nécessaire, faites de plus petites incisions le long de l’extrémité mésodomère du gonflement décidual.
8. Une fois l’embryon révélé, retirez tous les tissus extraembryonnaires attachés.
   1. Le sac endodermique pariétal et le cône ectoplacentaire peuvent se détacher spontanément de l’embryon pendant le processus de révélation, mais si ce n’est pas le cas, utilisez une paire de pinces et retirez-les avec tout sang maternel associé. Ensuite, à l’aide de deux pinces, maintenez l’embryon avec une paire et décollez lentement le sac vitellin viscéral de l’embryon à l’aide de l’autre ensemble.
   2. À l’aide d’une pipette P20, placez le sac vitellin avec pas plus de 10 μL de ^DPBS-/- de la boîte dans un tube de réaction en chaîne par polymérase (PCR) à 8 bandelettes sur de la glace, car il sera utilisé pour le génotypage le jour même.
      REMARQUE : Il est essentiel que l’échantillon du sac vitellin ne soit pas contaminé par des tissus provenant de la mère gravide. La contamination peut entraîner une attribution incorrecte du génotype de l’embryon.
9. Prenez des photos en plein champ d’embryons fraîchement isolés pour vous assurer que la mise en scène des compagnons de portée est similaire. À l’aide d’une pipette P200, pipetez lentement l’embryon avec 50 μL de DMEM/10 % FBS et placez-le dans un tube de 1,5 ml sur de la glace. Laissez les embryons sur la glace jusqu’à ce que les génotypes aient été confirmés.
   REMARQUE : Les embryons ont été conservés sur de la glace pendant 3 à 4 h sans dégradation évidente, mais ne dépassez pas ce temps, car une diminution de la viabilité cellulaire se produira. Étiquetez les embryons et les tubes de génotypage en conséquence. La prise d’images en champ clair est encouragée pour identifier et annoter les différences phénotypiques grossières entre les embryons.
10. Répétez ces étapes pour tous les gonflements déciduals restants. Nettoyez tous les outils de dissection et utilisez de nouveaux plastiques pour chaque isolement afin d’éviter toute contamination par les isolements précédents.
    REMARQUE : Assurez-vous que les procédures de dissection sont limitées à 1 h à partir du moment du prélèvement du site d’implantation de la mère enceinte.
11. Procéder à l’isolement des embryons de la prochaine mère gestante (si plusieurs grossesses synchronisées ont été identifiées) avant de passer à l’étape de génotypage le jour même.

3. Génotypage le jour même (figure 4)

1. Digérer chaque sac vitellin viscéral dans un tube PCR à 8 bandelettes. À l’aide d’une pipette P20, ajoutez 19,3 μL de tampon de lyse d’ADN de matrice PCR et 0,7 μL de 0,2 μg/mL de protéinase K à chaque échantillon de sac vitellin.
2. Vortex l’échantillon pendant 10 s et tournez-le vers le bas pour positionner les échantillons au fond du tube à l’aide d’une mini centrifugeuse avec un adaptateur de bande à 1 000 x g pendant 10 s. Placez le tube PCR à 8 bandes dans un bloc de chaleur à 85 °C pendant 45 min et faites un vortex pendant 5 s toutes les 5 min.
   REMARQUE : Il est important de vortex les échantillons pendant la digestion pour maximiser la lyse cellulaire en 45 min.
3. Après 45 min, faites tourner la bande tubulaire à l’aide d’une mini-centrifugeuse avec un adaptateur de bande à 1 000 x g pendant 10 s, puis procédez à la PCR pour l’identification génétique souhaitée. À titre de référence, un exemple de protocole pour un système Cre-lox est fourni. Voici un exemple de conditions de PCR pour le génotypage Cre. Concevoir des amorces pour amplifier les régions 5' et 3' du site Cre ciblé.
4. Pour effectuer la réaction PCR pour le génotypage Cre, préparez un mélange maître PCR par tube PCR à 8 bandelettes pour chaque sac vitellin contenant 10 μL de mélange d’ADN polymérase Taq, 0,5 μL d’amorce Cre directe de 0,5 μM, 0,5 μL d’amorce Cre inverse de 0,5 μM, 5 μL d’eau certifiée PCR et 4 μL d’ADN génomique du sac vitellin.
   REMARQUE : Si vous utilisez un protocole optimisé pour le génotypage de la queue de souris, ajoutez le double de la quantité d’ADN généralement utilisée pour des résultats plus propres.
5. Une fois le mélange maître PCR réalisé, exécutez le programme d’amplification du cycle thermique PCR. Pour le génotypage Cre, le cycle est le suivant : (1) 95 °C pendant 3 min, (2) 95 °C pendant 30 s, (3) 55 °C pendant 30 s, (4) 72 °C pendant 30 s, pas répétés 2-4 pendant 34 cycles, (5) 72 °C pendant 10 min, (6) maintien à 4 °C. Exécutez les produits PCR sur un gel d’agarose à 1 % pour tirer des conclusions de génotypage.
   REMARQUE : Si plus d’une PCR est nécessaire pour l’identification génétique, exécutez les réactions PCR simultanément pour optimiser le timing. Pour accélérer le processus, préparez le gel d’agarose un jour à l’avance le jour de l’expérience et conservez-le à 4 °C pendant la nuit. Ne considérez pas d’échantillons sans génotypes clairs. Tenez compte à la fois du génotype et du stade de développement pour les échantillons, car les compagnons de portée pourraient être à différents stades de gastrulation et potentiellement fausser les résultats. Lors de la réalisation du génotypage des allèles LoxP, les bandes PCR attendues dans le gel peuvent varier en fonction du Cre-driver utilisé. Par exemple, si le pilote Cre est exprimé dans le sac vitellin viscéral, la bande Loxp apparaîtra décalée dans les embryons Cre-positifs (Cre+), par rapport aux embryons Cre-négatifs (Cre-). Cependant, si le Cre n’est pas exprimé dans le sac vitellin viscéral, la taille de la bande Loxp sera la même chez les embryons Cre+ et Cre- (c’est-à-dire que les allèles Loxp ne seront pas floxés dans la lignée du sac vitellin). Un embryon portant un allèle Cre+ et deux allèles Loxp est considéré comme un embryon KO conditionnel. Cependant, pour confirmer la délétion du gène floxé, il est recommandé d’effectuer une confirmation de l’inactivation du gène sur les cellules qui expriment le pilote Cre, soit en répétant le protocole de génotypage, soit par analyse qPCR des niveaux d’ARNm du gène floxé (Figure 4D, E).
6. Conservez les échantillons restants du sac vitellin digéré dans le congélateur à -20 °C pour un stockage à long terme.

4. Dissociation cellulaire des embryons et viabilité cellulaire

1. Une fois les génotypes confirmés, prendre une pipette P200 et pipeter 50 μL de DMEM/10% FBS. Mettez en commun les embryons du même génotype dans un nouveau tube de 1,5 mL et placez le tube sur de la glace.
   REMARQUE : Ne poursuivez pas l’expérience s’il n’y a pas au moins 5 embryons par groupe (E7-E7.5) ou 3 (E7.75-E8), car le nombre et la viabilité des cellules diminueront considérablement.
2. Une fois que les embryons ont été regroupés en fonction des génotypes, laissez-les se déposer au fond du tube. Lavez les embryons regroupés en ajoutant 50 μL de DPBS^-/-, puis attendez que les embryons se déposent avant de retirer autant de ^DPBS-/- que possible sans retirer les embryons du tube. Répétez cette étape deux fois.
   REMARQUE : Tenir le tube de 1,5 ml près d’une source de lumière ou vers une fenêtre permettra de voir plus facilement les embryons se déposer au fond du tube.
3. Ajouter 100 μL de trypsine aux embryons regroupés et incuber à 37 °C dans un bloc thermique pendant 5 min. Agitez doucement les tubes de 1,5 ml toutes les 30 s pour aider les cellules à se dissocier.
   REMARQUE : N’utilisez pas de vortex ou de pipette pendant le processus de trypsinisation, car cela endommage les cellules. Si plus de 5 embryons (E7-E7.5) ou 3 embryons (E7.75-E8) sont regroupés, effectuer la digestion de la trypsine dans un autre tube contenant une quantité équivalente de trypsine (~20 μL par 1 embryon). Utilisez ~20 μL de trypsine par embryon (E6.5-E7.5), 35 μL par embryon (E7.75) et 40 μL pour l’embryon (E8).
4. Après 5 min, neutralisez la trypsine avec 300 μL de DMEM/10% FBS. Centrifuger les embryons regroupés à 100 x g pendant 4 min à température ambiante (RT). Après la centrifugation, une petite pastille apparaîtra pour tous les échantillons. Remettez les granulés en suspension dans 40 μL de DMEM/10% FBS et placez-les sur de la glace.
   REMARQUE : La taille de la pastille variera en fonction du nombre d’embryons regroupés. Il est possible que le granulé ne soit pas visible, mais passez à l’étape suivante. La quantité de DMEM/10% FBS nécessaire pour neutraliser la trypsine dépendra de la quantité de trypsine ajoutée. Ajoutez 3 fois la quantité de DMEM/10% à la quantité de trypsine.
5. Déterminez la concentration des cellules remises en suspension (40 μL) à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Mélangez 5 μL de cellules avec 5 μL de bleu de trypan dans un nouveau tube de 1,5 mL. Mélangez soigneusement à la pipette et pipetez sur une lame pour déterminer le nombre de cellules et la viabilité des cellules. La concentration optimale de cellules est de 700 à 1200 cellules/μL, et la viabilité cellulaire est de 90 % ou plus.
   REMARQUE : Si la concentration est inférieure à 200 cellules/μL et que la viabilité est inférieure à 50 %, ne poursuivez pas l’expérience. Si la concentration cellulaire est trop élevée, diluez la suspension cellulaire et recomptez à nouveau les cellules. Si des amas de cellules sont observés, utilisez une passoire cellulaire pour assurer une suspension unicellulaire.
6. Procédez au partitionnement d’une seule cellule à l’aide d’une puce microfluidique et suivez le protocole des fabricants de puces microfluidiques¹¹.

5. Isolement des noyaux d’embryons de souris (option pour des points de temps embryonnaires plus grands à partir de E8)

1. Préparez des tampons de lyse et de lavage frais décrits au tableau 1 et placez-les sur de la glace.
   REMARQUE : L’isolement des noyaux peut être effectué sur des échantillons frais ou congelés. Si les échantillons sont congelés, laissez-les décongeler pendant 2 à 5 minutes sur de la glace.
2. Avant de commencer l’expérience, confirmez tous les génotypes et ne regroupez que les embryons dont les génotypes sont clairs.
3. À l’aide d’une pipette P200, ajouter 50 μL de tampon de lyse des noyaux aux embryons regroupés dans un tube de 1,5 mL, en visant un minimum de 3 embryons par groupe de mutants. Laisser les échantillons reposer sur de la glace avec un tampon de lyse pendant 5 minutes et agiter toutes les 30 s.
4. Après 5 min d’incubation, centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. À l’aide d’une pipette P200, retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 50 μL de tampon de lavage. Une fois remis en suspension, centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
5. Retirer le surnageant et le remettre en suspension dans 40 μL de DPBS^-/-. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Mélangez 5 μL de noyaux avec 5 μL de bleu de trypan dans un nouveau tube de 1,5 mL. Pipetez soigneusement le mélange et chargez-le sur une lame pour déterminer le nombre de cellules et la viabilité.
   REMARQUE : La membrane nucléaire est perméable au bleu trypan ; Par conséquent, la coloration des noyaux isolés est positive pour le bleu de trypan. Dans un compteur de cellules automatisé, le pourcentage de cellules mortes est utilisé pour estimer le pourcentage de noyaux isolés (Figure 5A).
6. Si le pourcentage de noyaux intacts est supérieur à 90 % (c’est-à-dire qu’au moins 90 % des noyaux sont colorés au bleu de trypan et présentent une forme arrondie et un aspect turgescent ; reportez-vous aux figures 5B et C), utilisez une puce microfluidique et suivez le protocole des fabricants de puces microfluidiques¹¹.

6. Partitionnement d’une seule cellule (y compris l’amplification de l’ADNc et la construction de banques)

1. Procédez immédiatement avec le protocole de séquençage de l’ARN unicellulaire en suivant le protocole¹¹ du fabricant de la puce microfluidique pour obtenir les résultats les plus optimaux. Définissez la récupération de cellules cible sur 6000 cellules ou plus.

7. Séquençage

1. Une fois les banques construites, mesurez la distribution de la taille des fragments et les concentrations des échantillons à l’aide d’un analyseur d’électrophorèse automatisé.
   REMARQUE : Les distributions optimales de la taille des fragments se situent entre 300 et 1000 pb.
2. Les échantillons sont prêts à être chargés dans le séquenceur. Regroupez les bibliothèques de différents échantillons. La concentration finale de charge des banques regroupées est de 750 pM dans un volume total de 24 μL. Chargez les banques regroupées dans la cartouche de réactifs, en suivant le protocole¹² du fabricant du séquençage.
3. Séquencez les bibliothèques chargées dans la cellule d’écoulement et la cartouche pré-assemblées en fonction de la profondeur de séquençage souhaitée avec une double indexation par paire. Les lectures de séquençage conformes au protocole décrit par les fabricants de puces microfluidiques sont les suivantes^{: Lecture} 1 : 28 cycles, Indice i7 : 10 cycles, Indice i5 : 10 cycles et Lecture 2 : 90 cycles. Une fois le séquençage terminé, les données font l’objet d’une analyse bioinformatique.
4. Utiliser des méthodes bioinformatiques pour effectuer des contrôles de qualité. Cela comprend l’évaluation du nombre de cellules séquencées, des lectures par cellule et du nombre de gènes cartographiés par cellule.
   REMARQUE : Pour des résultats optimaux, le nombre de cellules séquencées est d’au moins 80 % des cellules ciblées. Il est recommandé que le nombre de lectures par cellule soit d’au moins 30 000 et que le nombre de gènes détectés soit supérieur à 3000 (pour les échantillons de souris).

Résultats

La méthodologie conçue dans cet article est spécifiquement destinée à améliorer la préparation d’échantillons d’embryons pour les omiques unicellulaires de E6.5 à E8. Ce pipeline robuste se compose de cinq étapes principales : les grossesses synchronisées, les isolements d’embryons, le génotypage le jour même, la dissociation cellulaire et l’évaluation de la viabilité cellulaire (Figure 1A). Bien que les données présentées se concentrent sur des points temporels de ...

Discussion

Cet article présente un pipeline robuste pour l’obtention de suspensions de cellules uniques et de noyaux de haute qualité à partir d’embryons de souris gaztrulants, spécialement conçues pour faciliter les études sur les mécanismes de spécification du destin cellulaire dans le développement précoce. Cette méthode comble une lacune cruciale dans le domaine de la gastrulation en optimisant l’analyse des embryons nécessitant des génotypes, tels que le sexe ou les gènes somatiques. En utilisant des modèl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000