Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Özet

Bu makale, tek hücrelerin ve çekirdeklerin dizilimi için gastrulasyon yapan fare embriyolarının yüksek kaliteli tek hücreli ve çekirdek süspansiyonları için bir boru hattı oluşturur.

Özet

Son on yılda, tek hücreli yaklaşımlar, örnekler içindeki gen ekspresyon dinamiklerini, hücre heterojenliğini ve hücre durumlarını incelemek için altın standart haline geldi. Tek hücreli ilerlemelerden önce, erken gelişim sırasında dinamik hücresel manzarayı ve hızlı hücre geçişlerini yakalamanın fizibilitesi sınırlıydı. Bu yazıda, embriyonik gün E6.5'ten E8'e kadar olan fare embriyoları üzerinde, gastrulasyonun başlangıcına ve tamamlanmasına karşılık gelen tek hücre ve çekirdek analizi yapmak için sağlam bir boru hattı tasarlanmıştır. Gastrulasyon, gelişim sırasında üç germinal tabakayı oluşturan temel bir süreçtir: organogenez için gerekli olan mezoderm, ektoderm ve endoderm. Yabani tip perigastrulan embriyolara uygulanan tek hücreli omikler hakkında kapsamlı literatür mevcuttur. Bununla birlikte, mutant embriyoların tek hücreli analizi hala azdır ve genellikle FACS'a göre sıralanmış popülasyonlarla sınırlıdır. Bu kısmen genotipleme ihtiyacı, zamanlanmış gebelikler, gebelik başına istenen genotiplere sahip embriyo sayısı ve bu aşamalarda embriyo başına hücre sayısı ile ilişkili teknik kısıtlamalardan kaynaklanmaktadır. Burada, bu sınırlamaların üstesinden gelmek için tasarlanmış bir metodoloji sunulmaktadır. Bu yöntem, istenen genotiplerle daha yüksek senkronize gebelik şansı elde etmek için üreme ve zamanlanmış gebelik kılavuzları oluşturur. Embriyo izolasyon sürecindeki optimizasyon adımları, aynı gün genotipleme protokolü (3 saat) ile birleştiğinde, mikro damlacık bazlı tek hücrenin aynı gün gerçekleştirilmesine izin vererek, hücrelerin yüksek canlılığını ve sağlam sonuçları garanti eder. Bu yöntem ayrıca embriyolardan optimal çekirdek izolasyonları için kılavuzları içerir. Böylece, bu yaklaşımlar gastrulasyon aşamasındaki mutant embriyoların tek hücreli yaklaşımlarının uygulanabilirliğini arttırmaktadır. Bu yöntemin, mutasyonların gastrulanın hücresel manzarasını nasıl şekillendirdiğinin analizini kolaylaştıracağını tahmin ediyoruz.

Giriş

Gastrulasyon, normal gelişim için gerekli olan temel bir süreçtir. Bu hızlı ve dinamik süreç, pluripotent hücreler, organların nasıl oluştuğunu tanımlayan soya özgü öncülere geçtiğinde meydana gelir. Yıllar boyunca, gastrulasyon uzun zamandır büyük ölçüde homojen üç popülasyonun oluşumu olarak tanımlandı: mezoderm, ektoderm ve endoderm. Bununla birlikte, yüksek çözünürlüklü teknolojiler ve ortaya çıkan sayıda embriyonik kök hücre modeli ^1,2, erken germ katmanları arasında benzeri görülmemiş bir heterojenliği ortaya çıkarmaktadır ^3,4. Bu, gastrulanın fa....

Protokol

Bu protokol ve açıklanan tüm hayvan deneyleri resmi olarak onaylanmıştır ve Temple Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından oluşturulan ve Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği uluslararası yönergelerini takip eden kurumsal yönergelere uygun olarak onaylanmıştır. Tarif edilen tüm fareler C57 / BL6N arka plan suşu üzerindeydi. Bu çalışmalarda hayvan sağlığı ile ilgili herhangi bir endişe gözlenmemiştir.

1. Üreme kolonisi ve zamanlanmış gebelikler

1. Vajinal bir tıkaç görselleştirme ile gebelikleri zamanlayın. Fişin yapıldığı gün öğlen E0.5 olarak kabul edilir.<....

Tartışmalar

Bu yazıda, gastrulasyon yapan fare embriyolarından yüksek kaliteli tek hücreli ve çekirdek süspansiyonları elde etmek için, erken gelişimde hücre kaderi spesifikasyon mekanizmaları üzerine çalışmaları kolaylaştırmak için özel olarak tasarlanmış sağlam bir boru hattı sunulmaktadır. Bu yöntem, cinsiyet veya somatik genler gibi genotipler gerektiren embriyoların analizini optimize ederek gastrulasyon alanındaki çok önemli bir boşluğu giderir. Genetik mutasyon fare modellerini kullanarak ve t?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000