Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Özet

Bu makale, tek hücrelerin ve çekirdeklerin dizilimi için gastrulasyon yapan fare embriyolarının yüksek kaliteli tek hücreli ve çekirdek süspansiyonları için bir boru hattı oluşturur.

Özet

Son on yılda, tek hücreli yaklaşımlar, örnekler içindeki gen ekspresyon dinamiklerini, hücre heterojenliğini ve hücre durumlarını incelemek için altın standart haline geldi. Tek hücreli ilerlemelerden önce, erken gelişim sırasında dinamik hücresel manzarayı ve hızlı hücre geçişlerini yakalamanın fizibilitesi sınırlıydı. Bu yazıda, embriyonik gün E6.5'ten E8'e kadar olan fare embriyoları üzerinde, gastrulasyonun başlangıcına ve tamamlanmasına karşılık gelen tek hücre ve çekirdek analizi yapmak için sağlam bir boru hattı tasarlanmıştır. Gastrulasyon, gelişim sırasında üç germinal tabakayı oluşturan temel bir süreçtir: organogenez için gerekli olan mezoderm, ektoderm ve endoderm. Yabani tip perigastrulan embriyolara uygulanan tek hücreli omikler hakkında kapsamlı literatür mevcuttur. Bununla birlikte, mutant embriyoların tek hücreli analizi hala azdır ve genellikle FACS'a göre sıralanmış popülasyonlarla sınırlıdır. Bu kısmen genotipleme ihtiyacı, zamanlanmış gebelikler, gebelik başına istenen genotiplere sahip embriyo sayısı ve bu aşamalarda embriyo başına hücre sayısı ile ilişkili teknik kısıtlamalardan kaynaklanmaktadır. Burada, bu sınırlamaların üstesinden gelmek için tasarlanmış bir metodoloji sunulmaktadır. Bu yöntem, istenen genotiplerle daha yüksek senkronize gebelik şansı elde etmek için üreme ve zamanlanmış gebelik kılavuzları oluşturur. Embriyo izolasyon sürecindeki optimizasyon adımları, aynı gün genotipleme protokolü (3 saat) ile birleştiğinde, mikro damlacık bazlı tek hücrenin aynı gün gerçekleştirilmesine izin vererek, hücrelerin yüksek canlılığını ve sağlam sonuçları garanti eder. Bu yöntem ayrıca embriyolardan optimal çekirdek izolasyonları için kılavuzları içerir. Böylece, bu yaklaşımlar gastrulasyon aşamasındaki mutant embriyoların tek hücreli yaklaşımlarının uygulanabilirliğini arttırmaktadır. Bu yöntemin, mutasyonların gastrulanın hücresel manzarasını nasıl şekillendirdiğinin analizini kolaylaştıracağını tahmin ediyoruz.

Giriş

Gastrulasyon, normal gelişim için gerekli olan temel bir süreçtir. Bu hızlı ve dinamik süreç, pluripotent hücreler, organların nasıl oluştuğunu tanımlayan soya özgü öncülere geçtiğinde meydana gelir. Yıllar boyunca, gastrulasyon uzun zamandır büyük ölçüde homojen üç popülasyonun oluşumu olarak tanımlandı: mezoderm, ektoderm ve endoderm. Bununla birlikte, yüksek çözünürlüklü teknolojiler ve ortaya çıkan sayıda embriyonik kök hücre modeli ^1,2, erken germ katmanları arasında benzeri görülmemiş bir heterojenliği ortaya çıkarmaktadır ^3,4. Bu, gastrulanın farklı hücre popülasyonlarını düzenleyen mekanizmalar hakkında ortaya çıkarılacak çok daha fazla şey olduğunu göstermektedir. Fare embriyonik gelişimi, gastrulasyon sırasında erken hücre kaderi kararlarını incelemek için en iyi modellerden biri olmuştur ^3,5. Farelerde gastrulasyon hızlıdır, çünkü tüm gastrulasyon süreci embriyonik gün E6.5'ten E8^5'e kadar 48 saat içinde gerçekleşir.

Tek hücre teknolojilerindeki son gelişmeler, vahşi tip fare embriyonik gelişiminin ayrıntılı haritalanmasını sağlayarak, gastrulasyon ^3,4,6,7,8 sırasında embriyoların hücresel ve moleküler manzaralarına kapsamlı bir genel bakış sağlamıştır. Bununla birlikte, bu aşamalarda mutant embriyoların analizi daha az yaygındır ve genellikle FACS'a göre sıralanmış popülasyonlarla sınırlıdır ^9,10. Kıt literatür, genotipleme gerektiren gastrulasyon yapan embriyoların manipülasyonu ve tek hücreli hazırlanması ile ilgili teknik zorlukları yansıtmaktadır. Dinamik gastrulasyon sürecini yakalamak, özellikle mutant embriyoları anlamak için hızlı doğası nedeniyle zorluklar doğurabilir. Gebeliklerin zamanlaması ve senkronizasyonu çok önemlidir, çünkü zamanlanmış gebelikler arasındaki küçük farklılıklar bile mutant genden kaynaklanan gelişimsel bir fenotip olarak yanlış yorumlanabilir. Bu, mutant gen gastrulasyon sürecini etkilediğinde özellikle önemli hale gelir^13,14. Bu çalışmada, vajinal tıkaçların (yani, çiftleşmeden sonra dişinin vajinasında oluşan pıhtılaşmış seminal sıvı kütlesi) görselleştirilmesi yoluyla senkronize gebelikler elde etmek için kılavuzlar oluşturulmuştur. Ek olarak, E6.5'ten E8'e kadar mutant gastrulasyon yapan embriyolardan sağlam tek hücreli veriler elde etmek için bir strateji tasarlanmıştır. Bu strateji, gebelik başına istenen genotipe sahip düşük embriyo sayısı ve embriyoların veya hücrelerin dondurulması-çözülmesinin neden olduğu canlılıktaki azalma ile ilişkili kısıtlamaların üstesinden gelmek için tasarlanmıştır.

Bu makale, vajinal tıkaçlar yoluyla zamanlanmış gebeliklerin oluşturulmasından tek hücrelerin/çekirdeklerin son dizilimine kadar optimize edilmiş bir metodolojiyi açıklamaktadır. Bu yöntem, istenen genotipe sahip daha fazla sayıda embriyo elde etmek için senkronize gebelik sayısının nasıl artırılacağını, hücrelerin canlılığını artırmak için hücre/çekirdek izolasyonlarını ve aynı gün genotipleme protokolünü açıklar. Bu el yazması aynı zamanda farklı gastrulasyon zaman noktalarında embriyo izolasyonu sürecini de açıklamaktadır. Metodoloji, dizileme için nihai canlı embriyo hücrelerinin/çekirdeklerinin sayısını artırmaya yardımcı olur ve yüksek kaliteli dizileme verileri sağlar. Bu nedenle, bu yöntem, genotipleme gerektiren gastrulasyon yapan embriyoların tek hücreli çalışmaları için kapıları açacaktır.

Protokol

Bu protokol ve açıklanan tüm hayvan deneyleri resmi olarak onaylanmıştır ve Temple Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından oluşturulan ve Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği uluslararası yönergelerini takip eden kurumsal yönergelere uygun olarak onaylanmıştır. Tarif edilen tüm fareler C57 / BL6N arka plan suşu üzerindeydi. Bu çalışmalarda hayvan sağlığı ile ilgili herhangi bir endişe gözlenmemiştir.

1. Üreme kolonisi ve zamanlanmış gebelikler

1. Vajinal bir tıkaç görselleştirme ile gebelikleri zamanlayın. Fişin yapıldığı gün öğlen E0.5 olarak kabul edilir.
2. Yontma ahşap yatak takımı ve kağıt yuvalama malzemesi içeren yatak malzemesi ile kafeslerde ev fareleri.
   1. Her kafeste fare yemeği, tatlı su ve bir zenginleştirme öğesi (örneğin, tünel ve yuvalama malzemesi) bulunur. Zamanlanmış üreme sırasında koloni bilgilerini günlük olarak takip edin ve toplayın.
   2. Farenin yaşı, dişi farenin sahip olduğu gebelik sayısı, erkek fare tarafından yerleştirilen tıkaç sayısı ve dişi fareler için kızgınlık aşaması (Şekil 2) gibi tüm bilgileri kaydedin.
      NOT: Zaten 1-2 kez doğum yapmış dişiler, sonraki gebeliklerde daha büyük yavru boyutları doğuracaktır.
3. Zamanlanmış gebeliklere başlamadan önce, üremeden 1 hafta önce erkek fareyi tek başına bir kafeste barındırın. Üremenin başladığı hafta boyunca, kafeste erkek başına en az 1 dişi tanıtın.
   NOT: Onaylanmış hayvan protokolüne bağlı olarak, bir üreme kafesine 2-3 dişi eklenmesine izin verilebilir ve tıkaç oluşumunu artırmak için tercih edilir.
4. Kafesler arasında senkronize gebelik şansını artırmak için en az 4 üreme üçlüsü (2 dişi fareye 1 erkek) kurun (diğer bir deyişle, aynı gün içinde birden fazla fiş). Bu, aynı gelişim aşamasında izole edilen embriyo sayısını artıracaktır.
5. Öğleden sonra veya akşam saat 5'ten önce ideal çiftleşmeyi düzenleyin ve dişiler erkeğin kafesine yerleştirilir veya tam tersi olur. Üreme 4-5 gün içinde gerçekleşmezse, çiftleşme partnerlerini her gün değiştirmeyi düşünün.
   NOT: Ertesi sabah vajinal tıkaç olup olmadığını kontrol edemiyorsanız, üreyen çifti bir gece önce ayırın (ör. hafta sonu/tatil günleri).
6. Her gün sabahın erken saatlerinde vajinal tıkaç olup olmadığını kontrol edin; sabah 9'dan önce tercih edilir.
   1. Vajinal tıkaçları kontrol etmek için dişi fareleri kuyruğun tabanından nazikçe kaldırın ve vajinal açıklığı gözlemleyin. Beyaz veya krem renkli jelatinimsi bir kütle arayın. Genellikle, vajinal tıkaç belirgin olabilir, ancak net değilse, cımbız alın ve vajinal açıklığı nazikçe araştırın. İzolasyon için yalnızca daha belirgin tapaları düşünün. Şekil 2C'ye bakın.
      NOT: Potansiyel bir hamileliği kaçırmamak için sabahları mümkün olduğunca erken vajinal tıkaçları kontrol etmek çok önemlidir. Fişler 12 saat sonra düşebilir veya çözülebilir.
      NOT: Bir tıkaç görülse bile, dişi farenin hamile olacağını garanti etmez. Kısmi bir tıkaç gözlenirse veya hiç gözlenmezse, ancak dişi farelerin vajinal açıklığının yakınında kızarıklık varsa, bu dişileri izolasyon için düşünmeyin, çünkü tıkacın yapışma olasılığı daha düşüktür. Çiftleşmeden sonra hamilelik olasılığı fare suşları arasında değişir ve çiftleşme sırasındaki kızgınlık döngüsünün fazına bağlıdır (Şekil 2).
7. Vajinal tıkaç görüldüğünde, günü kaydedin. Vajinal tıkaçın görüldüğü aynı günün öğlen vakti E0.5 olarak kabul edilir. Dişi fareleri üreme kafesinden ayırın ve istenen gastrulasyon aşamasına bağlı olarak embriyoları izole edin.
   NOT: Bu yöntem, çiftleşme için kesin bir zamanlama sağlamaz. Geleneksel olarak, çiftleşmenin önceki gece gece yarısı civarında gerçekleştiği varsayılır. Sonuç olarak, embriyoların vajinal tıkaç görüldüğü gün öğlene kadar yarım günlük (E0.5) olduğu kabul edilir.

2. Gastrulasyon sırasında fare embriyolarının izolasyonu

1. Embriyo izolasyonuna başlamadan önce, gerekli tüm reaktifleri ve ekipmanı hazırlayın.
   1. Alanı %70 etanol ile iyice temizleyin. Tüm diseksiyon aletlerinin (forseps ve makas) yıkandığından ve sterilize edildiğinden emin olun. Steril 5 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) /% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 20 mL DPBS^-/- alın ve buzun üzerine yerleştirin.
   2. Brüt gelişimsel fenotiplemeye yardımcı olmak için iletilen bir ışık aşaması ve kamera ile bir stereomikroskop kullanarak tüm izolasyonları gerçekleştirin.
2. Hamile fare barajına ötenazi yapın ve izolasyona hemen başlayın.
   1. Hamile barajı, CO₂ akış hızı dakikada kafes hacminin %20'sini yer değiştirecek şekilde ayarlanmış bir CO₂ odasına yerleştirin. Fareyi yakından izleyin ve solunum hareketlerinin olmadığını gözlemleyerek ölümü onaylayın.
   2. Solunum hareketlerinin yokluğundan sonra CO₂ akışını 2 dakika daha koruyun. Servikal çıkık yaparak ötenaziyi onaylayın.
   3. Fareleri sağlam, düz bir yüzey üzerinde normal bir ayakta durma pozisyonunda konumlandırın. Daha sonra, bir elin baş parmağı ve ilk parmağı kafatasının tabanındaki boynun arkasına dayayarak, diğer elinizle kuyruk tabanını tutarak geriye doğru çekerken ileri ve aşağı doğru itin.
   4. Servikal omurların ayrılmasını hissederek çıkığın etkinliğini doğrulayın. Omurilik koptuğunda, oksipital kondiller ile birinci servikal vertebra arasında 2-4 mm'lik bir boşluk hissedilecektir.
      NOT: Hücre canlılığı etkileneceğinden, aynı anda birden fazla hamile baraja ötenazi yapmayın. İzofloran, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) veya eşdeğer bir kuruluş tarafından onaylanırsa alternatif bir anestezik ajan olarak kullanılabilir.
3. Hamile barajını sırtına yerleştirin ve vajinal açıklığın yakınındaki alanı etanol ile sterilize edin.
   1. Diseksiyon makası ve cımbız kullanarak, vajinal açıklığın yakınındaki deri kıvrımını kaldırın ve hamile barajın rahmini yavaşça ortaya çıkaran V şeklinde küçük bir kesi yapın (Şekil 3 [sarı ok]).
   2. Hamile barajın uterus boynuzunu, bir ucunu cımbızla tutarak ve keserek, rahim ağzını çıkardığınızdan emin olarak inceleyin. Rahim boynuzunu buz üzerinde DPBS^-/- içeren 10 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin (Şekil 3).
      NOT: Embriyo izolasyon aşamasına bağlı olarak, rahim daha küçük veya daha büyük implantasyon bölgelerine (yani, bir ip üzerindeki 'inciler') benzeyecektir.
4. Diseksiyon makası ve cımbızla, içindeki yaprak döken şişlikleri içeren her bir implantasyon bölgesini ('inciler') kesin ve buz üzerinde 6 cm'lik bir Petri kabına taze DPBS-^/- yerleştirin (Şekil 3).
   NOT: Ortalama bir hamile barajında yaklaşık 6-8 implante edilmiş embriyo olacaktır.
5. Bir implantasyon bölgesi alın ve stereomikroskop aşamasının üzerine 6 cm'lik yeni bir Petri kabına yerleştirin ve üzerine 500 μL DPBS^-/- ekleyin. Mikroskobun ve ışık kaynağının odağını ayarlayın (Şekil 3).
   NOT: İmplantasyon bölgesinin boyutuna bağlı olarak, DPBS miktarı değişebilir; Amaç, implantasyon bölgesinin suya batırılması için yeterli DPBS'ye sahip olmaktır.
6. İnce uçlu diseksiyon cımbızı kullanarak uterus kasını implantasyon bölgesinden çıkarın. Bir elinizle bir cımbız seti ile implantasyon bölgesini basılı tutun ve diğer elinizle uterus boynuzundan kesilen implantasyon bölgesinin ucuna yavaşça başka bir forseps çifti yerleştirin ve desidua şişliğini yavaşça ortaya çıkarın (Şekil 3).
   NOT: Rahim yüzeyini çok sert çekmeyin veya çekmeyin, çünkü yaprak döken şişliğin yırtılmasına ve hatta embriyonun parçalanmasına neden olabilir.
7. Yaprak döken şişlik izole edildikten sonra, embriyoyu ortaya çıkarmaya devam edin.
   1. Yaprak döken şişliğin anti-mezotrial ucunu bir çift forseps ile tutun ve diğer çiftle, mezometriyal uçtan (yani, genellikle yaprak döken şişliğin daha sivri ucu) yaprak döken şişliğin boyutunun yaklaşık 1/4'ü kadar yatay bir kesim yapın.
   2. Şimdi, her iki forseps ile, yaprak döken şişliğin anti-mezotrial ucundan yavaşça itin ve embriyo taze kesilmiş mezometriyal uçtan dışarı çıkacaktır (Şekil 3).
      NOT: Embriyoyu kıracağı için yaprak döken şişliği yırtmayın. Gerekirse, yaprak döken şişliğin mezometriyal ucu boyunca daha küçük kesikler yapın.
8. Embriyo ortaya çıktıktan sonra, bağlı olan ekstraembriyonik dokuları çıkarın.
   1. Parietal endodermal kese ve ektoplasental koni, açığa çıkarma işlemi sırasında embriyodan kendiliğinden çıkabilir, ancak değilse, bir çift forseps kullanın ve bunları ilişkili herhangi bir maternal kanla birlikte çıkarın. Daha sonra, iki forseps kullanarak, embriyoyu bir çiftle tutun ve diğer seti kullanarak viseral yumurta sarısı kesesini embriyodan yavaşça soyun.
   2. Bir P20 pipeti kullanarak, aynı gün genotipleme için kullanılacağından, tabaktan en fazla 10 μL DPBS^-/- içeren yumurta sarısı kesesini buz üzerinde 8 şeritli bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpüne yerleştirin.
      NOT: Yolk kesesi örneğinin gebe barajından alınan doku ile kontamine olmaması çok önemlidir. Kontaminasyon, embriyonun yanlış genotip atamasına yol açabilir.
9. Littermatların evrelemesinin benzer olduğundan emin olmak için yeni izole edilmiş embriyoların parlak alan resimlerini çekin. Bir P200 pipeti ile embriyoyu 50 μL DMEM /% 10 FBS ile yavaşça pipetleyin ve buz üzerinde 1.5 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Genotipler doğrulanana kadar embriyoların buz üzerinde kalmasına izin verin.
   NOT: Embriyolar belirgin bir bozulma olmadan 3-4 saat buz üzerinde tutuldu, ancak hücre canlılığında bir azalma olacağı için bu süreyi aşmayın. Embriyoları ve genotipleme tüplerini buna göre etiketleyin. Embriyolar arasındaki brüt fenotipik farklılıkları tanımlamak ve açıklamak için parlak alan görüntüleri almak teşvik edilir.
10. Kalan tüm yaprak döken şişlikler için bu adımları tekrarlayın. Önceki izolasyonlardan kontaminasyon olmamasını sağlamak için tüm diseksiyon aletlerini temizleyin ve her izolasyon için yeni plastikler kullanın.
    NOT: Diseksiyon prosedürlerinin, implantasyon yerinin hamile barajından alındığı andan itibaren 1 saat ile sınırlı olduğundan emin olun.
11. Aynı gün genotipleme adımına geçmeden önce embriyoları bir sonraki hamile barajdan (birden fazla senkronize gebelik tespit edilmişse) izole etmeye devam edin.

3. Aynı gün genotipleme (Şekil 4)

1. Her bir viseral yumurta sarısı kesesini 8 şeritli bir PCR tüpünde sindirin. Bir P20 pipeti kullanarak, her bir yumurta yolu kesesi örneğine 19.3 μL PCR şablonu DNA lizis tamponu ve 0.7 μL 0.2 μg/mL Proteinaz K ekleyin.
2. Numuneyi 10 saniye boyunca vorteksleyin ve 10 saniye boyunca 1.000 x g'da bir şerit adaptörlü mini santrifüj kullanarak numuneleri tüpün dibine yerleştirmek için aşağı döndürün. 8 şeritli PCR tüpünü 45 dakika boyunca 85 °C'lik bir ısı bloğuna yerleştirin ve her 5 dakikada bir 5 saniye girdap yapın.
   NOT: Hücre lizizini 45 dakikada en üst düzeye çıkarmak için sindirirken numuneleri vortekslemek önemlidir.
3. 45 dakika sonra, tüp şeridini 10 saniye boyunca 1.000 x g'da bir şerit adaptörlü bir mini santrifüj kullanarak döndürün ve istenen genetik tanımlama için PCR ile devam edin. Referans olarak, bir Cre-lox sistemi için örnek bir protokol sağlanmıştır. Aşağıda, Cre genotiplemesi için PCR koşullarına bir örnek verilmiştir. Hedeflenen Cre bölgesinin 5' ve 3' bölgelerini güçlendirmek için astarlar tasarlayın.
4. Cre genotiplemesi için PCR reaksiyonunu gerçekleştirmek için, 10 μL Taq DNA polimeraz karışımı, 0.5 μL 0.5 μM ileri Cre primeri, 0.5 μL 0.5 μM ters Cre primeri, 5 μL PCR sertifikalı su ve 4 μL yolk kesesi genomik DNA.
   NOT: Fare kuyruğu genotiplemesi için optimize edilmiş bir protokol kullanıyorsanız, daha temiz sonuçlar için tipik olarak kullanılan DNA miktarının iki katını ekleyin.
5. PCR ana karışımı yapıldıktan sonra, PCR termal döngü amplifikasyon programını çalıştırın. Cre genotipleme için döngü şu şekildedir: (1) 3 dakika boyunca 95 °C, (2) 30 saniye boyunca 95 °C, (3) 30 saniye boyunca 55 °C, (4) 30 saniye boyunca 72 °C, 34 döngü için tekrarlanan adım 2-4, (5) 10 dakika boyunca 72 °C, (6) 4 °C tutun. Genotipleme sonuçları çıkarmak için PCR ürünlerini %1'lik bir agaroz jel üzerinde çalıştırın.
   NOT: Genetik tanımlama için birden fazla PCR gerekiyorsa, zamanlamayı optimize etmek için PCR reaksiyonlarını aynı anda çalıştırın. İşlemi hızlandırmak için, agaroz jeli deney günü bir gün önceden hazırlayın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın. Net genotipleri olmayan hiçbir örneği dikkate almayın. Numuneler için hem genotipi hem de gelişim aşamasını dikkate alın, çünkü littermatlar gastrulasyonun farklı aşamalarında olabilir ve potansiyel olarak sonuçları çarpıtabilir. LoxP alellerinin genotiplemesi yapılırken, jelde beklenen PCR bantları, kullanılan Cre-sürücüsüne bağlı olarak değişebilir. Örneğin, Cre sürücüsü viseral yumurta sarısı kesesinde eksprese edilirse, Loxp bandı, Cre-negatif (Cre-) ile karşılaştırıldığında, Cre-pozitif (Cre+) embriyolarda kaymış görünecektir. Bununla birlikte, Cre viseral yolk kesesinde eksprese edilmezse, Loxp bandının boyutu Cre+ ve Cre- embriyolarında aynı boyutta olacaktır (yani, Loxp alelleri yolk kesesi soyunda floklanmayacaktır). Bir Cre + aleli ve iki Loxp aleli taşıyan bir embriyo, koşullu bir KO embriyosu olarak kabul edilir. Bununla birlikte, floklanmış genin silinmesini doğrulamak için, ya genotipleme protokolünü tekrarlayarak ya da floklanmış genin mRNA seviyelerinin qPCR analizi ile Cre sürücüsünü eksprese eden hücreler üzerinde genin nakavtının doğrulanması önerilir (Şekil 4D, E).
6. Kalan sindirilmiş yumurta sarısı kesesi örneklerini uzun süreli saklama için -20 °C dondurucuda saklayın.

4. Embriyoların hücre ayrışması ve hücre canlılığı

1. Genotipler onaylandıktan sonra, bir P200 pipeti alın ve 50 μL DMEM /% 10 FBS pipetleyin. Aynı genotipe sahip embriyoları 1.5 mL'lik yeni bir tüpe koyun ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.
   NOT: Grup başına en az 5 embriyo (E7-E7.5) veya 3 (E7.75-E8) yoksa deneye devam etmeyin, çünkü hücre sayısı ve canlılığı büyük ölçüde azalacaktır.
2. Embriyolar genotiplere göre toplandıktan sonra, tüpün dibine yerleşmelerine izin verin. Havuzlanan embriyoları 50 μL DPBS^-/- ekleyerek yıkayın, ardından embriyoları tüpten çıkarmadan mümkün olduğunca fazla DPBS^-/- çıkarmadan önce embriyoların oturmasını bekleyin. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
   NOT: 1.5 mL'lik tüpü bir ışık kaynağına veya bir pencereye doğru tutmak, tüpün dibine yerleşen embriyoları görmeyi kolaylaştıracaktır.
3. Havuzlanan embriyolara 100 μL tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca bir ısı bloğunda inkübe edin. Hücrelerin ayrışmasına yardımcı olmak için her 30 saniyede bir 1,5 mL'lik tüpleri hafifçe vurun.
   NOT: Hücrelere zarar verdiği için tripsinizasyon işlemi sırasında girdap veya pipet kullanmayın. 5'ten fazla embriyo (E7-E7.5) veya 3 embriyo (E7.75-E8) toplanırsa, eşdeğer miktarda tripsin (1 embriyo başına ~ 20 μL) içeren başka bir tüpte tripsin sindirimi gerçekleştirin. Embriyo başına ~ 20 μL tripsin (E6.5-E7.5), embriyo başına 35 μL (E7.75) ve embriyo için 40 μL (E8) kullanın.
4. 5 dakika sonra, tripsini 300 μL DMEM /% 10 FBS ile nötralize edin. Havuzlanan embriyoları oda sıcaklığında (RT) 4 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, tüm numuneler için küçük bir pelet görünecektir. Peletleri 40 μL DMEM/%10 FBS'de yeniden süspanse edin ve buzun üzerine yerleştirin.
   NOT: Peletin boyutu, toplanan embriyo sayısına bağlı olarak değişecektir. Peletin görünmemesi mümkündür, ancak bir sonraki adıma geçin. Tripsini nötralize etmek için gereken DMEM /% 10 FBS miktarı, eklenen tripsin miktarına bağlı olacaktır. Tripsin miktarına DMEM miktarının 3 katını /% 10 ekleyin.
5. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak yeniden askıya alınan hücrelerin konsantrasyonunu (40 μL) belirleyin. 5 μL hücreyi 5 μL tripan mavisi ile 1.5 mL'lik yeni bir tüpte karıştırın. Pipet iyice karıştırın ve hücre sayısını ve hücre canlılığını belirlemek için bir slayta pipetleyin. Optimal hücre konsantrasyonu 700-1200 hücre/μL'dir ve hücre canlılığı %90 veya daha yüksektir.
   NOT: Konsantrasyon 200 hücre/μL'den düşükse ve canlılık %50'den düşükse deneye devam etmeyin. Hücre konsantrasyonu çok yüksekse, hücre süspansiyonunu seyreltin ve hücreleri tekrar sayın. Hücre kümeleri gözlenirse, tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için bir hücre süzgeci kullanın.
6. Mikroakışkan bir çip kullanarak tek hücreli bölümlemeye devam edin ve mikroakışkan çip üreticilerinin¹¹ protokolünü izleyin.

5. Çekirdek izolasyonu fare embriyoları (E8'den itibaren daha büyük embriyonik zaman noktaları için seçenek)

1. Tablo 1'de belirtilen taze lizis ve yıkama tamponlarını hazırlayın ve bunları buzun üzerine yerleştirin.
   NOT: Çekirdek izolasyonu, taze veya donmuş numuneler üzerinde gerçekleştirilebilir. Numuneler donmuşsa, buz üzerinde 2-5 dakika çözülmelerine izin verin.
2. Deneye başlamadan önce, tüm genotipleri onaylayın ve sadece net genotiplere sahip embriyoları bir araya getirin.
3. Bir P200 pipeti kullanarak, mutant grup başına en az 3 embriyo hedefleyerek 1.5 mL'lik bir tüpte toplanan embriyolara 50 μL çekirdek lizis tamponu ekleyin. Numunelerin lizis tamponu ile 5 dakika buz üzerinde oturmasına izin verin ve her 30 saniyede bir girdap yapın.
4. 5 dakikalık inkübasyondan sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Bir P200 pipeti kullanarak, süpernatanı çıkarın ve peleti 50 μL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Yeniden askıya alındıktan sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin.
5. Süpernatanı çıkarın ve 40 μL DPBS^-/- içinde yeniden süspanse edin. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. 5 μL çekirdeği 5 μL tripan mavisi ile 1.5 mL'lik yeni bir tüpte karıştırın. Karışımı iyice pipetleyin ve hücre sayısını ve canlılığını belirlemek için bir slayt üzerine yükleyin.
   NOT: Nükleer zar tripan mavisi geçirgendir; Bu nedenle, izole edilmiş çekirdek boyası tripan mavisi için pozitiftir. Otomatik bir hücre sayacında, izole edilmiş çekirdeklerin yüzdesini tahmin etmek için ölü hücrelerin yüzdesi kullanılır (Şekil 5A).
6. Sağlam çekirdeklerin yüzdesi %90'dan büyükse (yani çekirdeklerin en az %90'ı tripan mavisi ile boyanmış ve yuvarlak bir şekil ve kabarık bir görünüm sergiliyorsa; Şekil 5B, C'ye bakın), bir mikroakışkan çip kullanmaya devam edin ve mikroakışkan çip üreticilerinin protokolünü takip edin¹¹.

6. Tek hücreli bölümleme (cDNA amplifikasyonu ve kütüphane yapımı dahil)

1. En optimum sonuçlar için mikroakışkan çip üreticisinin protokolünü¹¹ takip ederek tek hücreli RNA dizileme protokolüne hemen devam edin. Hedef hücre kurtarmayı 6000 hücre veya daha büyük olarak ayarlayın.

7. Sıralama

1. Kitaplıklar oluşturulduktan sonra, otomatik bir elektroforez analizörü kullanarak numunelerin parça boyutu dağılımını ve konsantrasyonlarını ölçün.
   NOT: Optimum parça boyutu dağılımları 300-1000 bp arasındadır.
2. Numuneler sıralayıcıya yüklenmeye hazırdır. Farklı örneklerdeki kitaplıkları bir araya getirin. Havuzlanmış kitaplıkların son yükleme konsantrasyonu, toplam 24 μL'lik bir hacimde 750 pM'dir. Havuzlanan kitaplıkları, sıralama üreticisinin protokolünü¹² izleyerek reaktif kartuşuna yükleyin.
3. Önceden monte edilmiş akış hücresine ve kartuşa yüklenen kütüphaneleri, çift uçlu, çift indeksleme ile istenen sıralama derinliğine göre sıralayın. Mikroakışkan çip üreticileri tarafından özetlenen protokole bağlı kalan sıralama okumaları aşağıdaki gibidir:¹¹: Okuma 1: 28 döngü, i7 İndeksi: 10 döngü, i5 İndeksi: 10 döngü ve Okuma 2: 90 döngü. Dizilemenin tamamlanmasının ardından veriler biyoinformatik analize tabi tutulur.
4. Kalite kontrollerini gerçekleştirmek için biyoinformatik yöntemleri kullanır. Bu, dizilenmiş hücrelerin sayısının, hücre başına okumaların ve hücre başına eşlenen gen sayısının değerlendirilmesini içerir.
   NOT: En iyi sonuçlar için, sıralanan hücrelerin sayısı hedeflenen hücrelerin en az %80'idir. Hücre başına okuma sayısının en az 30.000 olması ve tespit edilen gen sayısının 3000'den yüksek olması önerilir (fare örnekleri için).

Sonuçlar

Bu yazıda tasarlanan metodoloji, özellikle E6.5'ten E8'e kadar tek hücreli omikler için embriyo örneklerinin hazırlanmasını geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu sağlam boru hattı beş ana adımdan oluşur: senkronize zamanlanmış gebelikler, embriyo izolasyonları, aynı gün genotipleme, hücre ayrışması ve hücre canlılığının değerlendirilmesi (Şekil 1A). Sunulan veriler E7'den E7.5'e kadar olan zaman noktalarına odaklanırken, prosedürde küçük değişikliklerle (pr...

Tartışmalar

Bu yazıda, gastrulasyon yapan fare embriyolarından yüksek kaliteli tek hücreli ve çekirdek süspansiyonları elde etmek için, erken gelişimde hücre kaderi spesifikasyon mekanizmaları üzerine çalışmaları kolaylaştırmak için özel olarak tasarlanmış sağlam bir boru hattı sunulmaktadır. Bu yöntem, cinsiyet veya somatik genler gibi genotipler gerektiren embriyoların analizini optimize ederek gastrulasyon alanındaki çok önemli bir boşluğu giderir. Genetik mutasyon fare modellerini kullanarak ve t?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000