Secuenciación de ARN unicelular de embriones enteros de ratón mutantes: desde el epiblasto hasta el final de la gastrulación

Resumen

Este artículo establece una línea para suspensiones de células individuales y núcleos de alta calidad de embriones de ratón gastrulados para la secuenciación de células individuales y núcleos.

Resumen

Durante la última década, los enfoques unicelulares se han convertido en el estándar de oro para estudiar la dinámica de la expresión génica, la heterogeneidad celular y los estados celulares dentro de las muestras. Antes de los avances de una sola célula, la viabilidad de capturar el paisaje celular dinámico y las transiciones celulares rápidas durante el desarrollo temprano era limitada. En este trabajo, se diseñó una tubería robusta para realizar análisis de células individuales y núcleos en embriones de ratón desde el día embrionario E6.5 hasta E8, correspondiente al inicio y finalización de la gastrulación. La gastrulación es un proceso fundamental durante el desarrollo que establece las tres capas germinales: mesodermo, ectodermo y endodermo, que son esenciales para la organogénesis. Se dispone de una amplia bibliografía sobre ómicas unicelulares aplicadas a embriones perigastruladores de tipo salvaje. Sin embargo, el análisis de embriones mutantes de una sola célula sigue siendo escaso y, a menudo, se limita a poblaciones clasificadas por FACS. Esto se debe en parte a las limitaciones técnicas asociadas con la necesidad de genotipado, embarazos cronometrados, el recuento de embriones con genotipos deseados por embarazo y el número de células por embrión en estas etapas. Aquí, se presenta una metodología diseñada para superar estas limitaciones. Este método establece pautas de reproducción y embarazo cronometrado para lograr una mayor probabilidad de embarazos sincronizados con los genotipos deseados. Los pasos de optimización en el proceso de aislamiento embrionario, junto con un protocolo de genotipado en el mismo día (3 h), permiten realizar una sola célula basada en microgotas en el mismo día, lo que garantiza una alta viabilidad de las células y resultados sólidos. Este método incluye además pautas para el aislamiento óptimo de los núcleos de los embriones. Por lo tanto, estos enfoques aumentan la viabilidad de los enfoques unicelulares de embriones mutantes en la etapa de gastrulación. Anticipamos que este método facilitará el análisis de cómo las mutaciones dan forma al paisaje celular de la gástrula.

Introducción

La gastrulación es un proceso fundamental necesario para el desarrollo normal. Este proceso rápido y dinámico ocurre cuando las células pluripotentes se convierten en precursores específicos del linaje que definen cómo se forman los órganos. Durante años, la gastrulación se definió como la formación de tres poblaciones en gran medida homogéneas: mesodermo, ectodermo y endodermo. Sin embargo, las tecnologías de alta resolución y un número emergente de modelos de células madre embrionarias ^1,2 revelan una heterogeneidad sin precedentes entre las primeras capas germinales ^3,4.

Protocolo

Este protocolo y todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados formalmente y de acuerdo con las pautas institucionales establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Temple, que sigue las pautas internacionales de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio. Todos los ratones descritos pertenecían a la cepa de fondo C57/BL6N. No se observaron problemas de salud animal en estos estudios.

1. Colonia de cría y embarazos cronometrados

1. Cronometrar los embarazos mediante la visualización de un tapón vaginal. El mediod....

Discusión

En este artículo se presenta una sólida cartera de productos para la obtención de suspensiones de células individuales y núcleos de alta calidad a partir de embriones de ratón gastrulados, diseñada específicamente para facilitar los estudios sobre los mecanismos de especificación del destino celular en el desarrollo temprano. Este método aborda una brecha crucial en el campo de la gastrulación al optimizar el análisis de embriones que requieren genotipos, como el sexo o los genes somáticos. Mediante la utili.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000