Secuenciación de ARN unicelular de embriones enteros de ratón mutantes: desde el epiblasto hasta el final de la gastrulación

Resumen

Este artículo establece una línea para suspensiones de células individuales y núcleos de alta calidad de embriones de ratón gastrulados para la secuenciación de células individuales y núcleos.

Resumen

Durante la última década, los enfoques unicelulares se han convertido en el estándar de oro para estudiar la dinámica de la expresión génica, la heterogeneidad celular y los estados celulares dentro de las muestras. Antes de los avances de una sola célula, la viabilidad de capturar el paisaje celular dinámico y las transiciones celulares rápidas durante el desarrollo temprano era limitada. En este trabajo, se diseñó una tubería robusta para realizar análisis de células individuales y núcleos en embriones de ratón desde el día embrionario E6.5 hasta E8, correspondiente al inicio y finalización de la gastrulación. La gastrulación es un proceso fundamental durante el desarrollo que establece las tres capas germinales: mesodermo, ectodermo y endodermo, que son esenciales para la organogénesis. Se dispone de una amplia bibliografía sobre ómicas unicelulares aplicadas a embriones perigastruladores de tipo salvaje. Sin embargo, el análisis de embriones mutantes de una sola célula sigue siendo escaso y, a menudo, se limita a poblaciones clasificadas por FACS. Esto se debe en parte a las limitaciones técnicas asociadas con la necesidad de genotipado, embarazos cronometrados, el recuento de embriones con genotipos deseados por embarazo y el número de células por embrión en estas etapas. Aquí, se presenta una metodología diseñada para superar estas limitaciones. Este método establece pautas de reproducción y embarazo cronometrado para lograr una mayor probabilidad de embarazos sincronizados con los genotipos deseados. Los pasos de optimización en el proceso de aislamiento embrionario, junto con un protocolo de genotipado en el mismo día (3 h), permiten realizar una sola célula basada en microgotas en el mismo día, lo que garantiza una alta viabilidad de las células y resultados sólidos. Este método incluye además pautas para el aislamiento óptimo de los núcleos de los embriones. Por lo tanto, estos enfoques aumentan la viabilidad de los enfoques unicelulares de embriones mutantes en la etapa de gastrulación. Anticipamos que este método facilitará el análisis de cómo las mutaciones dan forma al paisaje celular de la gástrula.

Introducción

La gastrulación es un proceso fundamental necesario para el desarrollo normal. Este proceso rápido y dinámico ocurre cuando las células pluripotentes se convierten en precursores específicos del linaje que definen cómo se forman los órganos. Durante años, la gastrulación se definió como la formación de tres poblaciones en gran medida homogéneas: mesodermo, ectodermo y endodermo. Sin embargo, las tecnologías de alta resolución y un número emergente de modelos de células madre embrionarias ^1,2 revelan una heterogeneidad sin precedentes entre las primeras capas germinales ^3,4. Esto sugiere que aún queda mucho por descubrir sobre los mecanismos que regulan las distintas poblaciones celulares de la gástrula. El desarrollo embrionario del ratón ha sido uno de los mejores modelos para estudiar las decisiones tempranas sobre el destino celular durante la gastrulación ^3,5. La gastrulación en ratones es rápida, ya que todo el proceso de gastrulación ocurre dentro de las 48 h, desde el día embrionario E6.5 hasta el E8⁵.

Los avances recientes en las tecnologías unicelulares han permitido un mapeo detallado del desarrollo embrionario de ratones de tipo salvaje, proporcionando una visión completa de los paisajes celulares y moleculares de los embriones durante la gastrulación 3,4,6,7,8. Sin embargo, el análisis de embriones mutantes en estas etapas es menos común y a menudo se limita a poblaciones clasificadas por FACS ^9,10. La escasa literatura refleja los desafíos técnicos asociados con la manipulación y preparación unicelular de embriones gastrulados que requieren genotipado. Capturar el proceso dinámico de la gastrulación puede plantear desafíos debido a su naturaleza rápida, especialmente para comprender los embriones mutantes. El momento y la sincronización de los embarazos son esenciales, ya que incluso las pequeñas diferencias entre los embarazos cronometrados pueden malinterpretarse como un fenotipo de desarrollo resultante del gen mutante. Esto se vuelve particularmente importante cuando el gen mutante influye en el proceso de gastrulación^13,14. En este estudio se establecen pautas para obtener embarazos sincronizados a través de la visualización de tapones vaginales (es decir, la masa de líquido seminal coagulado que se forma en la vagina de la hembra después del apareamiento). Además, se diseña una estrategia para obtener datos robustos de una sola célula de embriones mutantes con gastrulación de E6.5 a E8. Esta estrategia está concebida para superar las limitaciones asociadas al bajo número de embriones con el genotipo deseado por embarazo y a la disminución de la viabilidad provocada por la congelación-descongelación de embriones o células.

Este artículo describe una metodología optimizada desde el establecimiento de embarazos cronometrados a través de tapones vaginales hasta la secuenciación final de células/núcleos individuales. Este método explica cómo aumentar el número de embarazos sincronizados para obtener un mayor número de embriones con el genotipo deseado, aislamientos de células/núcleos para mejorar la viabilidad de las células y un protocolo de genotipado en el mismo día. Este manuscrito también describe el proceso de aislamiento embrionario en diferentes momentos de gastrulación. La metodología ayuda a aumentar el número de células/núcleos de embriones viables finales para la secuenciación, lo que garantiza datos de secuenciación de alta calidad. Por lo tanto, este método abrirá las puertas a estudios unicelulares de embriones gastrulados que requieran genotipado.

Protocolo

Este protocolo y todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados formalmente y de acuerdo con las pautas institucionales establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Temple, que sigue las pautas internacionales de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio. Todos los ratones descritos pertenecían a la cepa de fondo C57/BL6N. No se observaron problemas de salud animal en estos estudios.

1. Colonia de cría y embarazos cronometrados

1. Cronometrar los embarazos mediante la visualización de un tapón vaginal. El mediodía del día del enchufe se considera E0.5.
2. Ratones domésticos en jaulas con material de cama que contiene ropa de cama de madera dura astillada y material de anidación de papel.
   1. Cada jaula contiene comida para ratones, agua dulce y un elemento de enriquecimiento (por ejemplo, material de túnel y anidación). Rastree y recopile información de la colonia diariamente durante la reproducción cronometrada.
   2. Registre toda la información, como la edad del ratón, el número de embarazos que ha tenido una ratoneta hembra, el número de tapones colocados por un ratón macho y la etapa del celo (Figura 2) para los ratones hembra.
      NOTA: Las hembras que ya han dado a luz 1-2 veces darán a luz camadas más grandes en futuros embarazos.
3. Antes de comenzar los embarazos programados, aloje al ratón macho solo en una jaula 1 semana antes de la reproducción. Durante la semana de inicio de la cría, introduzca al menos 1 hembra por macho en la jaula.
   NOTA: Dependiendo del protocolo de animales aprobado, es posible que se permita agregar 2-3 hembras a una jaula de cría y se prefiere aumentar la generación de tapones.
4. Establezca al menos 4 tríos de cría (2 ratones hembra por 1 macho) para aumentar las posibilidades de embarazos sincronizados en las jaulas (es decir, varios enchufes en el mismo día). Esto aumentará el número de embriones aislados en la misma etapa de desarrollo.
5. Organice el apareamiento ideal por la tarde o por la noche antes de las 5 p.m., y las hembras se colocan en la jaula del macho o viceversa. Si la reproducción no ocurre en 4-5 días, considere cambiar de pareja cada dos días.
   NOTA: Si no puede verificar si hay un tapón vaginal a la mañana siguiente, separe a la pareja reproductora la noche anterior (es decir, fines de semana / días festivos).
6. Revise si hay tapones vaginales todos los días temprano en la mañana; antes de las 9 a.m. es preferible.
   1. Para comprobar si hay tapones vaginales, levanta suavemente a los ratones hembra por la base de la cola y observa la abertura vaginal. Busca una masa gelatinosa de color blanco o crema. A menudo, el tapón vaginal puede ser obvio, pero si no está claro, tome unas pinzas y palde suavemente la abertura vaginal. Considere solo los tapones más aparentes para el aislamiento. Consulte la Figura 2C.
      NOTA: Es fundamental verificar si hay tapones vaginales lo más temprano posible en la mañana para evitar perderse un posible embarazo. Los tapones pueden caerse o disolverse después de 12 h.
      NOTA: Incluso si se observa un tapón, no garantiza que la ratona hembra esté embarazada. Si se observa un tapón parcial o ningún tapón, pero hay enrojecimiento cerca de la abertura vaginal de los ratones hembra, no considere a estas hembras para el aislamiento, ya que hay menos posibilidades de que el tapón se pegue. La probabilidad de embarazo después del apareamiento varía entre las cepas de ratones y depende de la fase del ciclo estral durante el apareamiento (Figura 2).
7. Una vez que se observa un tapón vaginal, registre el día. El mediodía del mismo día en que se observa el tapón vaginal se considera E0,5. Separar los ratones hembra de la jaula de cría y aislar los embriones en función de la etapa de gastrulación deseada.
   NOTA: Este método no proporciona un momento preciso para el apareamiento. Convencionalmente, se supone que el apareamiento ocurre alrededor de la medianoche de la noche anterior. En consecuencia, se considera que los embriones tienen medio día de edad (E0,5) al mediodía del día en que se observa el tapón vaginal.

2. Aislamiento de embriones de ratón durante la gastrulación

1. Antes de comenzar el aislamiento del embrión, prepare todos los reactivos y equipos necesarios.
   1. Limpie el área a fondo con etanol al 70%. Asegúrese de que todas las herramientas de disección (pinzas y tijeras) estén lavadas y esterilizadas. Obtenga 5 mL estériles de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/10% de suero fetal bovino (FBS) y 20 mL de DPBS^-/- y colóquelos en hielo.
   2. Realice todos los aislamientos utilizando un microscopio estereoscópico con una etapa de luz transmitida y una cámara para ayudar con el fenotipado macroscópico del desarrollo.
2. Sacrificar a la madre de ratón embarazada y comenzar el aislamiento de inmediato.
   1. Coloque la madre embarazada en una cámara de CO₂ con el caudal de CO₂ ajustado para desplazar el 20% del volumen de la jaula por minuto. Vigile de cerca al ratón y confirme la muerte observando la ausencia de movimientos respiratorios.
   2. Mantenga el flujo de_CO2 durante 2 minutos adicionales después de la ausencia de movimientos respiratorios. Confirmar la eutanasia mediante la realización de una luxación cervical.
   3. Coloque a los ratones en una posición normal de pie sobre una superficie firme y plana. Luego, con el pulgar y el índice de una mano contra la parte posterior del cuello en la base del cráneo, empuje hacia adelante y hacia abajo mientras tira hacia atrás con la otra mano sosteniendo la base de la cola.
   4. Verifica la efectividad de la luxación sintiendo la separación de las vértebras cervicales. Cuando se corta la médula espinal, se palpará un espacio de 2-4 mm entre los cóndilos occipitales y la primera vértebra cervical.
      NOTA: No eutanasia a varias madres embarazadas a la vez, ya que la viabilidad celular se verá afectada. El isofluorano se puede utilizar como agente anestésico alternativo si lo aprueba el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) u organismo equivalente.
3. Coloque la madre embarazada boca arriba y esterilice el área cercana a la abertura vaginal con etanol.
   1. Con tijeras de disección y pinzas, levante el pliegue de la piel cerca de la abertura vaginal y haga una pequeña incisión en forma de V, revelando lentamente el útero de la madre embarazada (Figura 3 [flecha amarilla]).
   2. Disecciona el cuerno uterino de la madre embarazada sosteniendo un extremo con pinzas y cortando a lo largo de él, asegurándote de extirpar el cuello uterino. Coloque el cuerno uterino en una placa de Petri de 10 cm que contenga DPBS^-/- en hielo (Figura 3).
      NOTA: Dependiendo de la etapa de aislamiento del embrión, el útero se parecerá a sitios de implantación más pequeños o más grandes (es decir, 'perlas' en una cuerda).
4. Con tijeras de disección y pinzas, corte cada sitio de implantación ('perlas') que contenga las hinchazones deciduales en el interior y colóquelo en DPBS^-/- fresco en una placa de Petri de 6 cm sobre hielo (Figura 3).
   NOTA: Una madre embarazada promedio tendrá alrededor de 6-8 embriones implantados.
5. Tome un sitio de implantación y colóquelo en una nueva placa de Petri de 6 cm encima de la platina del microscopio estereoscópico y agregue 500 μL de DPBS^-/- encima. Ajuste el enfoque del microscopio y la fuente de luz (Figura 3).
   NOTA: Dependiendo del tamaño del sitio de implantación, la cantidad de DPBS puede variar; el objetivo es tener suficiente DPBS para que el sitio de implantación quede sumergido.
6. Con pinzas de disección de punta fina, retire el músculo uterino del sitio de implantación. Sujete el sitio de implantación con un juego de pinzas en una mano e inserte lentamente otro par de pinzas con la otra mano en el extremo del sitio de implantación cortado desde el asta uterina, revelando lentamente la hinchazón de la decidua (Figura 3).
   NOTA: No tire ni tire demasiado fuerte de la superficie uterina, ya que puede provocar la ruptura de la hinchazón decidual o incluso la lisis del embrión.
7. Una vez aislada la hinchazón decidual, se procede a revelar el embrión.
   1. Sostenga el extremo anti-mesomtrial, de la hinchazón decidual, con un par de pinzas y, con el otro par, haga lentamente un corte horizontal de aproximadamente 1/4 del tamaño de la hinchazón decidual desde el extremo mesometrial, es decir, a menudo el extremo más puntiagudo de la hinchazón decidual).
   2. Ahora, con ambas pinzas, empuje lentamente desde el extremo anti-mesometrial de la hinchazón decidual, y el embrión saldrá del extremo del mesometrial recién cortado (Figura 3).
      NOTA: No desgarre la hinchazón decidual, ya que esto romperá el embrión. Si es necesario, haga cortes más pequeños a lo largo del extremo mesomtrial, de la hinchazón decidual.
8. Una vez que se revela el embrión, se extraen los tejidos extraembrionarios adheridos.
   1. El saco endodérmico parietal y el cono ectoplacentario pueden desprenderse espontáneamente del embrión durante el proceso de revelación, pero si no, use un par de pinzas y retírelas junto con la sangre materna asociada. Luego, con dos pinzas, sujete el embrión con un par y retire lentamente el saco vitelino visceral del embrión con el otro juego.
   2. Con una pipeta P20, coloque el saco vitelino con no más de 10 μL de DPBS^-/- de la placa en un tubo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de 8 tiras sobre hielo, ya que se utilizará para el genotipado el mismo día.
      NOTA: Es fundamental que la muestra del saco vitelino no esté contaminada con tejido de la madre embarazada. La contaminación puede llevar a una asignación incorrecta del genotipo del embrión.
9. Tome fotografías de campo claro de los embriones recién aislados para asegurarse de que la estadificación de los compañeros de camada sea similar. Con una pipeta P200, pipetee lentamente el embrión con 50 μL de DMEM/10% FBS y colóquelo en un tubo de 1,5 mL sobre hielo. Deje que los embriones permanezcan en hielo hasta que se hayan confirmado los genotipos.
   NOTA: Los embriones se mantuvieron en hielo durante 3-4 h sin degradación evidente, pero no excedan este tiempo, ya que se producirá una disminución de la viabilidad celular. Etiquete los embriones y los tubos de genotipado en consecuencia. Se recomienda tomar imágenes de campo claro para identificar y anotar las diferencias fenotípicas macroscópicas entre los embriones.
10. Repita estos pasos para todas las hinchazones deciduales restantes. Limpie todas las herramientas de disección y use plásticos nuevos para cada aislamiento para garantizar que no haya contaminación de aislamientos anteriores.
    NOTA: Asegúrese de que los procedimientos de disección se limiten a 1 h desde el momento de la recolección del sitio de implantación de la madre embarazada.
11. Proceda a aislar los embriones de la siguiente madre embarazada (si se identificaron múltiples embarazos sincronizados) antes de pasar al paso de genotipado el mismo día.

3. Genotipado en el mismo día (Figura 4)

1. Digiera cada saco vitelino visceral en un tubo de PCR de 8 tiras. Con una pipeta P20, añada 19,3 μL de tampón de lisis de ADN molde de PCR y 0,7 μL de 0,2 μg/mL de proteinasa K a cada muestra de saco vitelino.
2. Agite la muestra en vórtice durante 10 s y gírela hacia abajo para colocar las muestras en el fondo del tubo utilizando una mini centrífuga con un adaptador de tira a 1.000 x g durante 10 s. Coloque el tubo de PCR de 8 tiras en un bloque térmico a 85 °C durante 45 min y en vórtice durante 5 s cada 5 min.
   NOTA: Es importante verter las muestras durante la digestión para maximizar la lisis celular en 45 min.
3. Después de 45 minutos, centrifugar la tira del tubo con una mini centrífuga con un adaptador de tira a 1.000 x g durante 10 s, y proceda con la PCR para la identificación genética deseada. Como referencia, se proporciona un protocolo de muestra para un sistema Cre-lox. A continuación se muestra un ejemplo de las condiciones de PCR para el genotipado de Cre. Diseñe cebadores para amplificar las regiones de 5' y 3' del sitio de Cre objetivo.
4. Para realizar la reacción de PCR para el genotipado de Cre, prepare una mezcla maestra de PCR por tubo de PCR de 8 tiras para cada saco vitelino que contenga 10 μL de mezcla de ADN polimerasa Taq, 0,5 μL de cebador de Cre avanzado de 0,5 μM, 0,5 μL de cebador de Cre inverso de 0,5 μM, 5 μL de agua certificada por PCR y 4 μL de ADN genómico del saco vitelino.
   NOTA: Si utiliza un protocolo optimizado para el genotipado de la cola de ratón, añada el doble de la cantidad de ADN que se utiliza normalmente para obtener resultados más limpios.
5. Una vez que se haya hecho la mezcla maestra de PCR, ejecute el programa de amplificación del ciclo térmico de PCR. Para el genotipado de Cre, el ciclo es el siguiente: (1) 95 °C durante 3 min, (2) 95 °C durante 30 s, (3) 55 °C durante 30 s, (4) 72 °C durante 30 s, paso repetido 2-4 durante 34 ciclos, (5) 72 °C durante 10 min, (6) retención de 4 °C. Ejecute los productos de PCR en un gel de agarosa al 1% para extraer conclusiones de genotipado.
   NOTA: Si se necesita más de una PCR para la identificación genética, ejecute las reacciones de PCR simultáneamente para optimizar el tiempo. Para acelerar el proceso, prepare el gel de agarosa con un día de anticipación el día del experimento y guárdelo a 4 °C durante la noche. No considere ninguna muestra sin genotipos claros. Tenga en cuenta tanto el genotipo como la etapa de desarrollo para las muestras, ya que los compañeros de camada podrían estar en diferentes etapas de gastrulación y potencialmente sesgar los resultados. Al realizar el genotipado de los alelos LoxP, las bandas de PCR esperadas en el gel pueden variar en función del controlador Cre utilizado. Por ejemplo, si el impulsor de Cre se expresa en el saco vitelino visceral, la banda de Loxp aparecerá desplazada en los embriones Cre-positivos (Cre+), en comparación con los Cre-negativos (Cre-). Sin embargo, si el Cre no se expresa en el saco vitelino visceral, el tamaño de la banda de Loxp será del mismo tamaño en los embriones Cre+ y Cre- (es decir, los alelos de Loxp no se floxarán en el linaje del saco vitelino). Un embrión portador de un alelo Cre+ y dos alelos Loxp se considera un embrión KO condicional. Sin embargo, para confirmar la deleción del gen floxed, se recomienda realizar una confirmación del knockout del gen en las células que expresan el driver Cre, ya sea repitiendo el protocolo de genotipado o mediante análisis de qPCR de los niveles de ARNm del gen floxado (Figura 4D, E).
6. Almacene las muestras restantes de saco vitelino digerido en el congelador a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo.

4. Disociación celular de embriones y viabilidad celular

1. Una vez confirmados los genotipos, tomar una pipeta P200 y pipetear 50 μL de DMEM/10% FBS. Agrupe los embriones con el mismo genotipo en un nuevo tubo de 1,5 ml y coloque el tubo en hielo.
   NOTA: No continúe con el experimento si no hay al menos 5 embriones por grupo (E7-E7.5) o 3 (E7.75-E8), ya que el recuento de células y la viabilidad disminuirán enormemente.
2. Después de que los embriones se hayan agrupado en función de los genotipos, permita que se asienten en el fondo del tubo. Lave los embriones agrupados agregando 50 μL de DPBS-^/-, luego espere a que los embriones se asienten antes de eliminar la mayor cantidad posible de DPBS-^/- sin extraer los embriones del tubo. Repita este paso dos veces.
   NOTA: Sostener el tubo de 1,5 ml cerca de una fuente de luz o hacia una ventana hará que sea más fácil ver los embriones asentándose en el fondo del tubo.
3. Añadir 100 μL de tripsina a los embriones agrupados e incubar a 37 °C en un bloque de calor durante 5 min. Agite suavemente los tubos de 1,5 ml cada 30 segundos para ayudar a que las células se disocien.
   NOTA: No utilice un vórtice o una pipeta durante el proceso de tripsinización, ya que daña las células. Si se agrupan más de 5 embriones (E7-E7.5) o 3 embriones (E7.75-E8), realice la digestión con tripsina en otro tubo con una cantidad equivalente de tripsina (~20 μL por 1 embrión). Utilice ~20 μL de tripsina por embrión (E6.5-E7.5), 35 μL por embrión (E7.75) y 40 μL para el embrión (E8).
4. Después de 5 minutos, neutralice la tripsina con 300 μL de DMEM/10% FBS. Centrifugar los embriones agrupados a 100 x g durante 4 min a temperatura ambiente (RT). Después de la centrifugación, aparecerá un pequeño gránulo para todas las muestras. Vuelva a suspender los gránulos en 40 μL de DMEM/10% FBS y colóquelos en hielo.
   NOTA: El tamaño del pellet variará en función del número de embriones agrupados. Es posible que el pellet no sea visible, pero continúe con el siguiente paso. La cantidad de DMEM/10% FBS necesaria para neutralizar la tripsina dependerá de la cantidad de tripsina añadida. Añadir 3 veces la cantidad de DMEM/10% a la cantidad de tripsina.
5. Determine la concentración de las células resuspendidas (40 μL) utilizando un contador de células automatizado. Mezcle 5 μL de células con 5 μL de azul de tripán en un tubo nuevo de 1,5 mL. Pipetee la mezcla bien y pipetee en un portaobjetos para determinar el número de células y la viabilidad de las células. La concentración óptima de células es de 700-1200 células/μL, y la viabilidad celular es del 90% o superior.
   NOTA: Si la concentración es inferior a 200 células/μL y la viabilidad es inferior al 50%, no continúe con el experimento. Si la concentración celular es demasiado alta, diluya la suspensión celular y vuelva a contar las células. Si se observan grupos de células, use un colador de células para asegurar una suspensión de una sola célula.
6. Proceda a la partición de una sola celda utilizando un chip microfluídico y siga el protocolo de los fabricantes de chips microfluídicos¹¹.

5. Aislamiento de núcleos embriones de ratón (opción para puntos de tiempo embrionarios más grandes a partir de E8)

1. Prepare tampones de lisis y lavado nuevos descritos en la Tabla 1 y colóquelos en hielo.
   NOTA: El aislamiento de núcleos se puede realizar en muestras frescas o congeladas. Si las muestras están congeladas, deje que se descongelen durante 2-5 minutos en hielo.
2. Antes de comenzar el experimento, confirme todos los genotipos y agrupe solo los embriones con genotipos claros.
3. Con una pipeta P200, añada 50 μL de tampón de lisis nucleial a los embriones agrupados en un tubo de 1,5 mL, con el objetivo de obtener un mínimo de 3 embriones por grupo mutante. Deje que las muestras se asienten en hielo con tampón de lisis durante 5 min y en vórtice cada 30 s.
4. Después de 5 min de incubación, centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Con una pipeta P200, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 50 μL de tampón de lavado. Una vez resuspendido, centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
5. Retirar el sobrenadante y volver a suspender en 40 μL de DPBS^-/-. Cuente las celdas usando un contador de celdas automatizado. Mezcle 5 μL de núcleos con 5 μL de azul de tripán en un tubo nuevo de 1,5 mL. Pipetee la mezcla a fondo y cárguela en un portaobjetos para determinar el número de células y la viabilidad.
   NOTA: La membrana nuclear es permeable al azul tripán; Por lo tanto, la tinción de núcleos aislados es positiva para azul de tripano. En un contador de células automatizado, el porcentaje de células muertas se utiliza para estimar el porcentaje de núcleos aislados (Figura 5A).
6. Si el porcentaje de núcleos intactos es superior al 90% (lo que significa que al menos el 90% de los núcleos están teñidos con azul de tripán y exhiben una forma redondeada y un aspecto turgente; consulte la Figura 5B, C), proceda a utilizar un chip microfluídico y siga el protocolo^{de los fabricantes} de chips microfluídicos.

6. Partición de una sola célula (incluida la amplificación de ADNc y la construcción de bibliotecas)

1. Proceda inmediatamente con el protocolo de secuenciación de ARN de una sola célula siguiendo el protocolo¹¹ del fabricante del chip microfluídico para obtener los resultados más óptimos. Establezca la recuperación de celdas de destino en 6000 celdas o más.

7. Secuenciación

1. Una vez construidas las bibliotecas, mida la distribución del tamaño de los fragmentos y las concentraciones de las muestras con un analizador de electroforesis automatizado.
   NOTA: Las distribuciones óptimas de tamaño de fragmento están entre 300 y 1000 pb.
2. Las muestras están listas para ser cargadas en el secuenciador. Agrupe bibliotecas de diferentes muestras juntas. La concentración de carga final de las bibliotecas agrupadas es de 750 pM en un volumen total de 24 μL. Cargue las bibliotecas agrupadas en el cartucho de reactivo, siguiendo el protocolo del fabricante de secuenciación¹².
3. Secuenciar las bibliotecas cargadas en la celda de flujo preensamblada y el cartucho de acuerdo con la profundidad de secuenciación deseada con indexación doble de extremo de par. Las lecturas de secuenciación adheridas al protocolo descrito por los fabricantes de chips microfluídicos son las siguientes:^Lectura 1: 28 ciclos, Índice i7: 10 ciclos, Índice i5: 10 ciclos y Lectura 2: 90 ciclos. Una vez finalizada la secuenciación, los datos se someten a un análisis bioinformático.
4. Utilizar métodos bioinformáticos para realizar controles de calidad. Esto incluye evaluar el número de células secuenciadas, las lecturas por célula y el número de genes mapeados por célula.
   NOTA: Para obtener resultados óptimos, el número de células secuenciadas es de al menos el 80% de las células objetivo. Se recomienda que el número de lecturas por célula sea de al menos 30.000 y que el número de genes detectados sea superior a 3000 (para muestras de ratón).

Resultados

La metodología diseñada en este trabajo está específicamente destinada a mejorar la preparación de muestras de embriones para ómicas unicelulares desde E6.5 hasta E8. Esta sólida cartera consta de cinco pasos principales: embarazos cronometrados sincronizados, aislamientos de embriones, genotipado en el mismo día, disociación celular y evaluación de la viabilidad celular (Figura 1A). Si bien los datos presentados se centran en los puntos temporales de E7 a E7.5, se pueden aplicar a...

Discusión

En este artículo se presenta una sólida cartera de productos para la obtención de suspensiones de células individuales y núcleos de alta calidad a partir de embriones de ratón gastrulados, diseñada específicamente para facilitar los estudios sobre los mecanismos de especificación del destino celular en el desarrollo temprano. Este método aborda una brecha crucial en el campo de la gastrulación al optimizar el análisis de embriones que requieren genotipos, como el sexo o los genes somáticos. Mediante la utili...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000