Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
В этой статье описывается конвейер для высококачественных суспензий одиночных клеток и ядер гаструляционных эмбрионов мышей для секвенирования отдельных клеток и ядер.
За последнее десятилетие подходы с использованием одиночных клеток стали золотым стандартом для изучения динамики экспрессии генов, гетерогенности клеток и состояния клеток в образцах. До появления одиночных клеток возможность захвата динамического клеточного ландшафта и быстрых переходов клеток на ранних этапах развития была ограничена. В данной работе был разработан надежный конвейер для проведения анализа одиночных клеток и ядер эмбрионов мышей с эмбрионов с эмбрионального дня E6,5 по E8, что соответствует началу и завершению гаструляции. Гаструляция является фундаментальным процессом в процессе развития, в ходе которого образуются три зародышевых слоя: мезодерма, эктодерма и энтодерма, которые необходимы для органогенеза. Имеется обширная литература по омиксам одиночных клеток, применяемым к перигаструляционным эмбрионам дикого типа. Тем не менее, одноклеточный анализ мутантных эмбрионов все еще редок и часто ограничен популяциями, отсортированными с помощью FACS. Отчасти это связано с техническими ограничениями, связанными с необходимостью генотипирования, сроками беременности, количеством эмбрионов с желаемыми генотипами за одну беременность и количеством клеток на эмбрион на этих стадиях. В данной статье представлена методология, призванная преодолеть эти ограничения. Этот метод устанавливает рекомендации по разведению и срокам беременности для достижения более высокой вероятности синхронизированной беременности с желаемыми генотипами. Этапы оптимизации процесса выделения эмбрионов в сочетании с протоколом генотипирования в тот же день (3 ч) позволяют проводить одноклеточное исследование на основе микрокапель в тот же день, что обеспечивает высокую жизнеспособность клеток и надежные результаты. Этот метод также включает в себя рекомендации по оптимальному выделению ядер из эмбрионов. Таким образом, эти подходы повышают целесообразность одноклеточных подходов к мутантным эмбрионам на стадии гаструляции. Мы ожидаем, что этот метод облегчит анализ того, как мутации формируют клеточный ландшафт гаструлы.
Гаструляция является фундаментальным процессом, необходимым для нормального развития. Этот быстрый и динамичный процесс происходит, когда плюрипотентные клетки превращаются в предшественников, специфичных для линии, которые определяют формирование органов. В течение многих лет гаструляция долгое время определялась как формирование трех в значительной степени однородных популяций: мезодермы, эктодермы и энтодермы. Тем не менее, технологии с высоким разрешением и растущее число моделей эмбриональных стволовых клеток 1,2 обнаруживают беспрецедентную гетерогенность среди ранних зародышевых слоев 3,4
Этот протокол и все описанные эксперименты на животных были официально одобрены и соответствуют институциональным руководящим принципам, установленным Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Университета Темпл, который следует международным рекомендациям Ассоциации по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными. Все описанные мыши находились на базовом штамме C57/BL6N. В этих исследованиях не наблюдалось никаких проблем со здоровьем животных.
1. Колония и сроки беременности
Методология, разработанная в данной статье, специально предназначена для улучшения подготовки образцов эмбрионов для омиксов одиночных клеток от E6.5 до E8. Этот надежный конвейер состоит из пяти основных этапов: синхронизированная беременность, выделение эмбрионов, генотипирование в т.......
В данной работе представлен надежный конвейер для получения высококачественных суспензий одиночных клеток и ядер из гаструляционных эмбрионов мышей, специально разработанный для облегчения исследований механизмов спецификации клеточной судьбы на ранних стадиях развития. Этот мето.......
Авторам нечего раскрывать.
Мы выражаем признательность Ядру геномики в Онкологическом центре Фокс Чейз и сотрудникам лаборатории доктора Джонатана Веттайна Заку Грею, Мэдисон Хонер и Бенджамину Ферману за техническую поддержку экспериментов по секвенированию. Мы выражаем признательность членам лаборатории доктору Эстарасу и Алексу Моррису, аспиранту, которые внесли свой вклад в первоначальный анализ исследований одиночных клеток. Эта работа финансируется за счет грантов NIH R01HD106969 и R56HL163146 Conchi Estaras. Кроме того, Элизабет Абрахам получила грант на обучение T32 5T32HL091804-12.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 cm Petri dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
1000 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 23-430 | |
20 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 24-404 | |
300 µL Reach Barrier Tip | Genesee Scientific | 24-415 | |
37 µm Reversible Strainer, small | Stem Cell | 27215 | |
6 cm Petri dish | Genesee Scientific | 25-260 | |
8-strip PCR tubes | Genesee Scientific | 27-125U | |
Agarose | Apex Bioresearch Product | 20-102 | |
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath | Genesee | 31-437 | |
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge | Genesee | 33-759R | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Chromium Controller | 10X | PN-1000127 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X | PN-1000269 | |
Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX2000 | |
Countess Cell Couning Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
Digitonin | ThermoFisher Scientific | BN2006 | |
DirectPCR yolk sac | Viagen | 201-Y | |
Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | |
DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x) | CORNING | 10-013-CV | |
Dulbecco's PBS | GenClone | 25-508 | |
Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
Ethanol | Koptec | V1401 | |
EVOS M7000 Imaging System | Invitrogen | AMF7000 | |
Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
GoTaq G2 Green Master Mix | Promega | M7823 | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
MgCl2 | ThermoFisher Scientific | AC223211000 | |
MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | |
NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3 | Illumina | 20046811 | |
NextSeq2000 | Illumina | ||
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope | Nikon | ||
Nondiedt P40 | Sigma-Aldrich | 74385 | |
Nuclease-free Water | GenClone | 25-511 | |
Optical Tube 8x Strip (401428) | Agilent | 401428 | |
Optical Tube Cap 8x Strip (401425) | Agilent | 401425 | |
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit | Genesee | 31-511 | |
Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits | Invitrogen | Q32851 | |
Qubit Flex 3 | Invitrogen | ||
RNase inhibitor | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Tape Station Loading tips | Agilent | 5067-5598 | |
Tapestation 4150 | Agilent | G2992AA | |
Tris-HCL (Ph7) | Quality Biological | 351-007-101 | |
Trypan Blue Stain 0.4% | Theromo Fisher Scientific | T10282 | |
Tryple Express | Gibco | 12604-021 | |
Tween-20 | Bio-Rad | 1662404 | |
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter | IKA | 3617000 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены