Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье описывается конвейер для высококачественных суспензий одиночных клеток и ядер гаструляционных эмбрионов мышей для секвенирования отдельных клеток и ядер.

Аннотация

За последнее десятилетие подходы с использованием одиночных клеток стали золотым стандартом для изучения динамики экспрессии генов, гетерогенности клеток и состояния клеток в образцах. До появления одиночных клеток возможность захвата динамического клеточного ландшафта и быстрых переходов клеток на ранних этапах развития была ограничена. В данной работе был разработан надежный конвейер для проведения анализа одиночных клеток и ядер эмбрионов мышей с эмбрионов с эмбрионального дня E6,5 по E8, что соответствует началу и завершению гаструляции. Гаструляция является фундаментальным процессом в процессе развития, в ходе которого образуются три зародышевых слоя: мезодерма, эктодерма и энтодерма, которые необходимы для органогенеза. Имеется обширная литература по омиксам одиночных клеток, применяемым к перигаструляционным эмбрионам дикого типа. Тем не менее, одноклеточный анализ мутантных эмбрионов все еще редок и часто ограничен популяциями, отсортированными с помощью FACS. Отчасти это связано с техническими ограничениями, связанными с необходимостью генотипирования, сроками беременности, количеством эмбрионов с желаемыми генотипами за одну беременность и количеством клеток на эмбрион на этих стадиях. В данной статье представлена методология, призванная преодолеть эти ограничения. Этот метод устанавливает рекомендации по разведению и срокам беременности для достижения более высокой вероятности синхронизированной беременности с желаемыми генотипами. Этапы оптимизации процесса выделения эмбрионов в сочетании с протоколом генотипирования в тот же день (3 ч) позволяют проводить одноклеточное исследование на основе микрокапель в тот же день, что обеспечивает высокую жизнеспособность клеток и надежные результаты. Этот метод также включает в себя рекомендации по оптимальному выделению ядер из эмбрионов. Таким образом, эти подходы повышают целесообразность одноклеточных подходов к мутантным эмбрионам на стадии гаструляции. Мы ожидаем, что этот метод облегчит анализ того, как мутации формируют клеточный ландшафт гаструлы.

Введение

Гаструляция является фундаментальным процессом, необходимым для нормального развития. Этот быстрый и динамичный процесс происходит, когда плюрипотентные клетки превращаются в предшественников, специфичных для линии, которые определяют формирование органов. В течение многих лет гаструляция долгое время определялась как формирование трех в значительной степени однородных популяций: мезодермы, эктодермы и энтодермы. Тем не менее, технологии с высоким разрешением и растущее число моделей эмбриональных стволовых клеток 1,2 обнаруживают беспрецедентную гетерогенность среди ранних зародышевых слоев 3,4

протокол

Этот протокол и все описанные эксперименты на животных были официально одобрены и соответствуют институциональным руководящим принципам, установленным Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Университета Темпл, который следует международным рекомендациям Ассоциации по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными. Все описанные мыши находились на базовом штамме C57/BL6N. В этих исследованиях не наблюдалось никаких проблем со здоровьем животных.

1. Колония и сроки беременности

  1. Засекайте время беременности с помощью визуализации вагинальной пробки. Полдень в день свечения счита....

Результаты

Методология, разработанная в данной статье, специально предназначена для улучшения подготовки образцов эмбрионов для омиксов одиночных клеток от E6.5 до E8. Этот надежный конвейер состоит из пяти основных этапов: синхронизированная беременность, выделение эмбрионов, генотипирование в т.......

Обсуждение

В данной работе представлен надежный конвейер для получения высококачественных суспензий одиночных клеток и ядер из гаструляционных эмбрионов мышей, специально разработанный для облегчения исследований механизмов спецификации клеточной судьбы на ранних стадиях развития. Этот мето.......

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы выражаем признательность Ядру геномики в Онкологическом центре Фокс Чейз и сотрудникам лаборатории доктора Джонатана Веттайна Заку Грею, Мэдисон Хонер и Бенджамину Ферману за техническую поддержку экспериментов по секвенированию. Мы выражаем признательность членам лаборатории доктору Эстарасу и Алексу Моррису, аспиранту, которые внесли свой вклад в первоначальный анализ исследований одиночных клеток. Эта работа финансируется за счет грантов NIH R01HD106969 и R56HL163146 Conchi Estaras. Кроме того, Элизабет Абрахам получила грант на обучение T32 5T32HL091804-12.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm Petri dishGenesee Scientific25-202
1000 µL Reach Barrier TipGenesee Scientific23-430
20 µL Reach Barrier TipGenesee Scientific24-404
300 µL Reach Barrier TipGenesee Scientific24-415
37 µm Reversible Strainer, smallStem Cell27215
6 cm Petri dishGenesee Scientific25-260
8-strip PCR tubesGenesee Scientific27-125U
AgaroseApex Bioresearch Product20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry BathGenesee31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated MicrocentrifugeGenesee33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153
Chromium Controller10XPN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.110XPN-1000269
Countess 3 Automated Cell CounterInvitrogenAMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber SlidesInvitrogenC10283
D1000 ReagentsAgilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
DigitoninThermoFisher ScientificBN2006
DirectPCR yolk sacViagen201-Y
Dithiothreitol (DTT)ThermoFisher ScientificR0861
DNA LoBind Tube 1.5 mLEppendorf22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)CORNING10-013-CV
Dulbecco's PBSGenClone25-508
Dumont #5 Fine ForcepsFine Science Tools11254-20
Dumont #5SF ForcepsFine Science Tools11252-00
EthanolKoptecV1401
EVOS M7000 Imaging SystemInvitrogenAMF7000
Fine Scissors - SharpFine Science Tools14060-11
GoTaq G2 Green Master MixPromegaM7823
Graefe ForcepsFine Science Tools11049-10
MgCl2ThermoFisher ScientificAC223211000
MiniAmp Thermal CyclerApplied BiosystemsA37834
NaClFisher ChemicalS271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3Illumina20046811
NextSeq2000Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo MicroscopeNikon
Nondiedt P40Sigma-Aldrich74385
Nuclease-free WaterGenClone25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)Agilent401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)Agilent401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/UnitGenesee31-511
Proteinase KSigma-AldrichP6556
Qubit dsDNA Quantification Assay KitsInvitrogenQ32851
Qubit Flex 3Invitrogen
RNase inhibitorFisher Scientific12-141-368
Standard Pattern ForcepsFine Science Tools11000-12
Tape Station Loading tipsAgilent5067-5598
Tapestation 4150AgilentG2992AA
Tris-HCL (Ph7)Quality Biological351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%Theromo Fisher ScientificT10282
Tryple ExpressGibco12604-021
Tween-20Bio-Rad1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapterIKA3617000

Ссылки

  1. Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering. Dev Biol. 488, 35-46 (2022).
  2. Kim, Y., Kim, I., Shin, K.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

FACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены