Секвенирование РНК одиночных клеток мутантных цельных эмбрионов мыши: от эпибласта до конца гаструляции

Резюме

В этой статье описывается конвейер для высококачественных суспензий одиночных клеток и ядер гаструляционных эмбрионов мышей для секвенирования отдельных клеток и ядер.

Аннотация

За последнее десятилетие подходы с использованием одиночных клеток стали золотым стандартом для изучения динамики экспрессии генов, гетерогенности клеток и состояния клеток в образцах. До появления одиночных клеток возможность захвата динамического клеточного ландшафта и быстрых переходов клеток на ранних этапах развития была ограничена. В данной работе был разработан надежный конвейер для проведения анализа одиночных клеток и ядер эмбрионов мышей с эмбрионов с эмбрионального дня E6,5 по E8, что соответствует началу и завершению гаструляции. Гаструляция является фундаментальным процессом в процессе развития, в ходе которого образуются три зародышевых слоя: мезодерма, эктодерма и энтодерма, которые необходимы для органогенеза. Имеется обширная литература по омиксам одиночных клеток, применяемым к перигаструляционным эмбрионам дикого типа. Тем не менее, одноклеточный анализ мутантных эмбрионов все еще редок и часто ограничен популяциями, отсортированными с помощью FACS. Отчасти это связано с техническими ограничениями, связанными с необходимостью генотипирования, сроками беременности, количеством эмбрионов с желаемыми генотипами за одну беременность и количеством клеток на эмбрион на этих стадиях. В данной статье представлена методология, призванная преодолеть эти ограничения. Этот метод устанавливает рекомендации по разведению и срокам беременности для достижения более высокой вероятности синхронизированной беременности с желаемыми генотипами. Этапы оптимизации процесса выделения эмбрионов в сочетании с протоколом генотипирования в тот же день (3 ч) позволяют проводить одноклеточное исследование на основе микрокапель в тот же день, что обеспечивает высокую жизнеспособность клеток и надежные результаты. Этот метод также включает в себя рекомендации по оптимальному выделению ядер из эмбрионов. Таким образом, эти подходы повышают целесообразность одноклеточных подходов к мутантным эмбрионам на стадии гаструляции. Мы ожидаем, что этот метод облегчит анализ того, как мутации формируют клеточный ландшафт гаструлы.

Введение

Гаструляция является фундаментальным процессом, необходимым для нормального развития. Этот быстрый и динамичный процесс происходит, когда плюрипотентные клетки превращаются в предшественников, специфичных для линии, которые определяют формирование органов. В течение многих лет гаструляция долгое время определялась как формирование трех в значительной степени однородных популяций: мезодермы, эктодермы и энтодермы. Тем не менее, технологии с высоким разрешением и растущее число моделей эмбриональных стволовых клеток ^1,2 обнаруживают беспрецедентную гетерогенность среди ранних зародышевых слоев ^3,4. Это говорит о том, что еще многое предстоит выяснить о механизмах, регулирующих различные клеточные популяции гаструлы. Эмбриональное развитие мышей было одной из лучших моделей для изучения ранних решений о судьбе клеток во время гаструляции ^3,5. Гаструляция у мышей происходит быстро, так как весь процесс гаструляции происходит в течение 48 ч, от эмбрионального дня Е6,5 до Е855^.

Последние достижения в области технологий одиночных клеток позволили детально составить карту развития эмбриона мыши дикого типа, обеспечив всесторонний обзор клеточных и молекулярных ландшафтов эмбрионов во время гаструляции 3,4,6,7,8. Однако анализ мутантных эмбрионов на этих стадиях встречается реже и часто ограничивается популяциями, отсортированными методом FACS ^9,10. Скудная литература отражает технические проблемы, связанные с манипуляциями и одноклеточным препарированием гаструляционных эмбрионов, требующих генотипирования. Захват динамического процесса гаструляции может быть сопряжен с трудностями из-за его быстрого характера, особенно для понимания мутантных эмбрионов. Сроки и синхронизация беременностей имеют важное значение, так как даже незначительные различия между сроками беременности могут быть неверно истолкованы как фенотип развития, возникающий в результате мутантного гена. Это становится особенно важным, когда мутантный ген влияет на процесс гаструляции^13,14. В данном исследовании установлены рекомендации по получению синхронизированной беременности за счет визуализации вагинальных пробок (т.е. массы свернувшейся семенной жидкости, образующейся во влагалище самки после спаривания). Кроме того, разработана стратегия для получения надежных данных об отдельных клетках мутантных гаструляционных эмбрионов от E6.5 до E8. Эта стратегия разработана для преодоления ограничений, связанных с низким количеством эмбрионов с желаемым генотипом за одну беременность и снижением жизнеспособности, вызванным замораживанием-размораживанием эмбрионов или клеток.

В этой статье описывается оптимизированная методология от установления временной беременности с помощью вагинальных пробок до окончательного секвенирования отдельных клеток/ядер. Этот метод объясняет, как увеличить количество синхронизированных беременностей для получения большего числа эмбрионов с желаемым генотипом, выделения клеток/ядер для улучшения жизнеспособности клеток и протокола генотипирования в тот же день. В данной рукописи также описан процесс выделения эмбрионов в различные моменты времени гаструляции. Методология помогает увеличить количество конечных жизнеспособных эмбриональных клеток/ядер для секвенирования, обеспечивая высокое качество данных секвенирования. Таким образом, этот метод откроет двери для одноклеточных исследований гаструляционных эмбрионов, требующих генотипирования.

протокол

Этот протокол и все описанные эксперименты на животных были официально одобрены и соответствуют институциональным руководящим принципам, установленным Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Университета Темпл, который следует международным рекомендациям Ассоциации по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными. Все описанные мыши находились на базовом штамме C57/BL6N. В этих исследованиях не наблюдалось никаких проблем со здоровьем животных.

1. Колония и сроки беременности

1. Засекайте время беременности с помощью визуализации вагинальной пробки. Полдень в день свечения считается E0.5.
2. Домашние мыши в клетках с подстилочным материалом, содержащим сколотую подстилку из твердых пород дерева и бумажный материал для гнездования.
   1. В каждой клетке есть мышиный чау, пресная вода и предмет для обогащения (например, материал для туннеля и гнезда). Отслеживайте и собирайте информацию о колонии ежедневно во время размножения.
   2. Запишите всю информацию, такую как возраст мыши, количество беременностей у самки мыши, количество заглушек, установленных самцом мыши, и стадия течки (рис. 2) у самок мышей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Самки, которые уже родили 1-2 раза, будут рожать больше помета в будущих беременностях.
3. Перед началом запланированной беременности поместите самца мыши одного в клетку за 1 неделю до размножения. В течение недели после начала размножения вводите в клетку не менее 1 самки на одного самца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от утвержденного протокола содержания животных, добавление 2-3 самок в клетку для разведения может быть разрешено, и это предпочтительно для увеличения генерации пробки.
4. Создайте как минимум 4 племенных трио (2 самки мыши на 1 самца), чтобы увеличить шансы на синхронную беременность в клетках (т.е. несколько пробок в один и тот же день). Это позволит увеличить количество эмбрионов, выделенных на одной и той же стадии развития.
5. Устраивают идеальную случку во второй половине дня или вечером до 5 часов вечера, а самок подсаживают в клетку самца или наоборот. Если размножение не происходит в течение 4-5 дней, рассмотрите возможность смены брачных партнеров через день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы не можете проверить наличие вагинальной пробки на следующее утро, разделите размножающуюся пару накануне вечером (т.е. в выходные/праздничные дни).
6. Проверяйте наличие вагинальных пробок каждый день ранним утром; Предпочтительно до 9 утра.
   1. Чтобы проверить наличие вагинальных пробок, осторожно поднимите самок мышей за основание хвоста и понаблюдайте за входом во влагалище. Ищите желеобразную массу белого или кремового цвета. Часто вагинальная пробка может быть очевидной, но если она неясна, возьмите пинцет и аккуратно прощупайте вход во влагалище. Рассмотрим только наиболее очевидные вилки для изоляции. Обратитесь к рисунку 2C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно проверять наличие вагинальных пробок как можно раньше утром, чтобы не пропустить потенциальную беременность. Пробки могут выпасть или раствориться через 12 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Даже если наблюдается пробка, это не гарантирует, что мышь женского пола будет беременна. Если наблюдается частичная пробка или ее отсутствие, но есть покраснение возле входа во влагалище у самок мышей, не рассматривайте этих самок для изоляции, так как вероятность того, что пробка прилипнет, меньше. Вероятность наступления беременности после спаривания варьирует у разных линий мышей и зависит от фазы эстрального цикла во время спаривания (рисунок 2).
7. После того, как будет замечена вагинальная пробка, запишите день. Полдень того же дня, когда наблюдается вагинальная пробка, считается Е0,5. Отделите самок мышей от клетки для разведения и изолируйте эмбрионы в зависимости от желаемой стадии гаструляции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод не обеспечивает точного времени для вязки. Обычно считается, что спаривание происходит около полуночи предыдущей ночи. Следовательно, считается, что эмбрионам полдня (E0,5) к полудню в день, когда наблюдается вагинальная пробка.

2. Выделение эмбрионов мышей при гаструляции

1. Перед началом изоляции эмбрионов подготовьте все необходимые реагенты и оборудование.
   1. Тщательно очистите участок 70% этанолом. Убедитесь, что все инструменты для вскрытия (щипцы и ножницы) вымыты и стерилизованы. Примите стерильные 5 мл модифицированной среды Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)/10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 20 мл DPBS^-/- и положите на лед.
   2. Выполняйте все выделения с помощью стереомикроскопа с проходящим световым столиком и камерой для помощи в общем фенотипировании развития.
2. Усыпьте беременную мышиную мать и немедленно начните изоляцию.
   1. Поместите плотину в камеру CO₂ с регулировкой расхода CO₂ таким образом, чтобы вытеснить 20 % объема клетки в минуту. Внимательно следите за мышью и подтверждайте смерть, наблюдая за отсутствием дыхательных движений.
   2. Поддерживайте поток_СО2 еще 2 минуты после отсутствия дыхательных движений. Подтвердите эвтаназию путем выполнения вывиха шейки матки.
   3. Расположите мышей в нормальном стоячем положении на твердой ровной поверхности. Затем, упираясь большим и указательным пальцами одной руки в заднюю часть шеи у основания черепа, толкайте вперед и вниз, одновременно тяну назад, удерживая другой рукой основание хвоста.
   4. Убедитесь в эффективности вывиха, прощупав отделение шейных позвонков. При разрыве спинного мозга между затылочными мыщелками и первым шейным позвонком прощупывается пространство размером 2-4 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не усыпляйте несколько беременных самок одновременно, так как это повлияет на жизнеспособность клеток. Изофторан может быть использован в качестве альтернативного анестетика, если он одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) или эквивалентным органом.
3. Положите беременную дамбу на спину и простерилизуйте область возле входа во влагалище с помощью этанола.
   1. С помощью диссекционных ножниц и пинцета приподнимите кожную складку возле входа во влагалище и сделайте небольшой V-образный надрез, медленно обнажая матку беременной матери (рисунок 3 [желтая стрелка]).
   2. Рассеките маточный рог беременной самки, придерживая один его конец пинцетом и разрезая вдоль него, обязательно удаляя шейку матки. Поместите маточный рог в 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую DPBS^-/- на льду (рис. 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от стадии изоляции эмбриона, матка будет напоминать меньшие или большие места имплантации (т.е. «жемчужины» на нитке).
4. С помощью диссекционных ножниц и пинцета разрежьте каждую точку имплантации («жемчужины»), содержащую децидуальные отеки внутри, и поместите в свежую DPBS^-/- в чашку Петри диаметром 6 см на льду (Рисунок 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем беременная мать имеет около 6-8 имплантированных эмбрионов.
5. Возьмите одну площадку для имплантации и поместите ее на новую чашку Петри диаметром 6 см в верхней части предметного столика стереомикроскопа и добавьте на нее 500 μL DPBS^-/- . Отрегулируйте фокусировку микроскопа и источника света (рисунок 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера места имплантации количество DPBS может варьироваться; цель состоит в том, чтобы DPBS было достаточно для погружения в воду места имплантации.
6. С помощью рассекающего пинцета с тонким наконечником удалите мышцу матки из места имплантации. Удерживайте место имплантации одним комплектом пинцета в одной руке и медленно введите другую пару щипцов другой рукой в конец места имплантации, вырезанный из маточного рога, медленно обнажая отек децидуальной кости (рисунок 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не тяните и не тяните слишком сильно за поверхность матки, так как это может привести к разрыву децидуального отека или даже лизису эмбриона.
7. После того, как децидуальный отек будет изолирован, приступайте к вскрытию эмбриона.
   1. Удерживайте антимезометрический конец децидуального отека одной парой щипцов, а другой парой медленно сделайте горизонтальный надрез примерно на 1/4 размера децидуального отека от мезометрического конца (т.е. часто более заостренного конца децидуального отека).
   2. Теперь с помощью обоих щипцов медленно надавите на антимезометральный конец децидуального отека, и эмбрион выскочит из только что вырезанного мезометрического конца (Рисунок 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не разрывайте децидуальный отек, так как это приведет к разрушению эмбриона. При необходимости сделайте небольшие надрезы вдоль мезометрического конца децидуального отека.
8. Как только эмбрион будет раскрыт, удалите все прикрепленные к нему внеэмбриональные ткани.
   1. Теменный эндодермальный мешок и эктоплацентарный колбочек могут самопроизвольно отделиться от эмбриона во время процесса раскрытия, но если нет, используйте пару щипцов и удалите их вместе с любой связанной материнской кровью. Затем с помощью двух щипцов зажмите эмбрион одной парой и медленно отклейте висцеральный желточный мешок от эмбриона с помощью другого набора.
   2. С помощью пипетки P20 поместите желточный мешок с не более чем 10 мкл DPBS^-/- из чашки в 8-полосковую пробирку полимеразной цепной реакции (ПЦР) на льду, так как она будет использоваться для генотипирования в тот же день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы образец желточного мешка не был загрязнен тканью беременной самки. Контаминация может привести к неправильному присвоению генотипа эмбриона.
9. Сделайте яркие полевые снимки только что выделенных эмбрионов, чтобы убедиться, что стадия однопометников одинакова. С помощью пипетки P200 медленно нанесите на эмбрион 50 мкл DMEM/10% FBS и поместите его в пробирку объемом 1,5 мл на льду. Пусть эмбрионы остаются на льду до тех пор, пока не подтвердятся генотипы.
   Примечание: Эмбрионы выдерживали на льду в течение 3-4 ч без явной деградации, но не превышайте это время, так как произойдет снижение жизнеспособности клеток. Пометьте эмбрионы и пробирки для генотипирования соответствующим образом. Рекомендуется делать снимки яркого поля для выявления и аннотирования грубых фенотипических различий между эмбрионами.
10. Повторите эти действия для всех оставшихся децидуальных отеков. Очистите все инструменты для вскрытия и используйте новый пластик для каждой изоляции, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения от предыдущих выделений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что процедуры диссекции ограничены 1 часом с момента забора места имплантации из беременной матери.
11. Приступайте к выделению эмбрионов от следующей беременной матери (если была выявлена многоплодная синхронизированная беременность) перед переходом к этапу генотипирования в тот же день.

3. Генотипирование в тот же день (Рисунок 4)

1. Переварите каждый висцеральный желточный мешок в 8-полосной ПЦР-пробирке. С помощью пипетки P20 добавьте 19,3 мкл буфера для лизиса ДНК ПЦР-матрицы и 0,7 мкл 0,2 мкг/мл протеиназы К в каждый образец желточного мешка.
2. Сделайте образец вихревым слоем в течение 10 с и вращайте вниз, чтобы поместить образцы на дно пробирки с помощью мини-центрифуги с адаптером для полоски при давлении 1 000 x g в течение 10 с. Поместите 8-полосную ПЦР-пробирку в термоблок с температурой 85 °C на 45 минут и делайте вихрь в течение 5 секунд каждые 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать вихревые образцы во время разложения, чтобы максимизировать лизис клеток за 45 минут.
3. Через 45 минут раскрутите полоску пробирки с помощью миницентрифуги с адаптером полоски при давлении 1000 x g в течение 10 с и приступайте к ПЦР для желаемой генетической идентификации. Для справки приведен пример протокола для системы Cre-lox. Ниже приведен пример условий ПЦР для генотипирования Cre. Разрабатывайте грунтовки для усиления 5' и 3' областей целевого участка Cre.
4. Для проведения ПЦР-реакции для генотипирования Cre готовят мастер-смесь ПЦР на 8-полосную ПЦР-пробирку для каждого желточного мешка, содержащего 10 мкл смеси Taq ДНК-полимеразы, 0,5 мкл 0,5 мкМ прямого Cre праймера, 0,5 мкл 0,5 мкМ обратного Cre праймера, 5 мкл ПЦР-сертифицированной воды и 4 мкл геномной ДНК желточного мешка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании протокола, оптимизированного для генотипирования хвоста мыши, добавьте в два раза больше ДНК, чем обычно используется для получения более чистых результатов.
5. После того, как мастер-смесь для ПЦР будет готова, запустите программу амплификации термического цикла ПЦР. Для генотипирования Cre цикл выглядит следующим образом: (1) 95 °C в течение 3 мин, (2) 95 °C в течение 30 с, (3) 55 °C в течение 30 с, (4) 72 °C в течение 30 с, повторение шага 2-4 в течение 34 циклов, (5) 72 °C в течение 10 мин, (6) удержание при 4 °C. Запустите продукты ПЦР на 1% агарозном геле, чтобы сделать выводы по генотипированию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если для генетической идентификации необходимо более одной ПЦР, запускайте реакции ПЦР одновременно для оптимизации времени. Чтобы ускорить процесс, приготовьте агарозный гель за день до начала эксперимента и храните его при температуре 4 °C в течение ночи. Не стоит рассматривать любые образцы без четких генотипов. При выборе образцов учитывайте как генотип, так и стадию развития, так как однопометники могут находиться на разных стадиях гаструляции и потенциально искажать результаты. При выполнении генотипирования аллелей LoxP ожидаемые в геле полосы ПЦР могут варьироваться в зависимости от используемого Cre-драйвера. Например, если драйвер Cre экспрессируется в висцеральном желточном мешке, полоса Loxp будет казаться смещенной у Cre-положительных (Cre+) эмбрионов по сравнению с Cre-отрицательными (Cre-). Однако, если Cre не экспрессируется в висцеральном желточном мешке, размер полосы Loxp будет одинаковым у Cre+ и Cre- эмбрионов (т.е. аллели Loxp не будут флоксированы в линии желточного мешка). Эмбрион, несущий один аллель Cre+ и два аллеля Loxp, считается условным эмбрионом KO. Однако для подтверждения делеции флоксированного гена рекомендуется провести подтверждение нокаута гена на клетках, экспрессирующих драйвер Cre, либо путем повторения протокола генотипирования, либо с помощью количественного ПЦР-анализа уровней мРНК флоксированного гена (рис. 4D, E).
6. Храните оставшиеся переваренные образцы желточного мешка в морозильной камере при температуре -20 °C для длительного хранения.

4. Клеточная диссоциация эмбрионов и жизнеспособность клеток

1. После подтверждения генотипов возьмите пипетку P200 и пипетку 50 мкл DMEM/10% FBS. Объедините эмбрионы с одинаковым генотипом в новую пробирку объемом 1,5 мл и поместите пробирку на лед.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не продолжайте эксперимент, если в группе нет по крайней мере 5 эмбрионов (E7-E7.5) или 3 (E7.75-E8), так как количество клеток и жизнеспособность значительно уменьшатся.
2. После того, как эмбрионы были объединены на основе генотипов, дайте им осесть на дно пробирки. Промойте объединенные эмбрионы, добавив 50 μL ^DPBS-/-, затем подождите, пока эмбрионы осядут, прежде чем удалять как можно больше DPBS^-/- без извлечения эмбрионов из пробирки. Повторите этот шаг дважды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если поднести пробирку объемом 1,5 мл к источнику света или к окну, будет легче увидеть, как эмбрионы оседают на дно пробирки.
3. Добавьте 100 мкл трипсина к объединенным эмбрионам и инкубируйте при температуре 37 °C в тепловом блоке в течение 5 минут. Осторожно переворачивайте пробирки объемом 1,5 мл каждые 30 секунд, чтобы помочь клеткам диссоциировать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте вихрь или пипетку во время процесса трипсинизации, так как это повреждает клетки. Если в пул объединено более 5 эмбрионов (Е7-Е7,5) или 3 эмбрионов (Е7,75-Е8), проведите расщепление трипсина в другой пробирке с эквивалентным количеством трипсина (~20 мкл на 1 эмбрион). Используйте ~20 μL трипсина на эмбрион (E6.5-E7.5), 35 μL на эмбрион (E7.75) и 40 μL на эмбрион (E8).
4. Через 5 мин нейтрализовать трипсин 300 мкл DMEM/10% FBS. Центрифугируйте объединенные эмбрионы при 100 x g в течение 4 минут при комнатной температуре (RT). После центрифугирования для всех образцов появится небольшая гранула. Повторно суспендируйте гранулы в 40 μл DMEM/10% FBS и поместите их на лед.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер гранулы будет варьироваться в зависимости от количества объединенных эмбрионов. Вполне возможно, что гранула не видна, но перейдите к следующему шагу. Количество DMEM/10% FBS, необходимое для нейтрализации трипсина, будет зависеть от количества добавленного трипсина. Добавьте в 3 раза больше DMEM/10% к количеству трипсина.
5. Определите концентрацию ресуспендированных клеток (40 мкл) с помощью автоматического счетчика клеток. Смешайте 5 мкл клеток с 5 мкл трипанового синего в новой пробирке объемом 1,5 мл. Тщательно перемешайте пипетку и нанесите пипетку на предметное стекло, чтобы определить количество и жизнеспособность клеток. Оптимальная концентрация клеток составляет 700-1200 клеток/мкл, а жизнеспособность клеток составляет 90% и выше.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если концентрация ниже 200 клеток/мкл и жизнеспособность ниже 50%, не продолжайте эксперимент. Если концентрация клеток слишком высока, разбавьте клеточную суспензию и снова пересчитайте клетки. Если наблюдаются скопления клеток, используйте клеточное ситечко, чтобы обеспечить одноклеточную суспензию.
6. Перейдите к разделению одиночных клеток с помощью микрофлюидного чипа и следуйте протоколу производителей микрофлюидных чипов¹¹.

5. Выделение ядер мышиных эмбрионов (опция для более крупных эмбриональных временных точек, начиная с E8)

1. Приготовьте свежие буферы для лизиса и промывки, описанные в таблице 1, и поместите их на лед.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение ядер может быть выполнено на свежих или замороженных образцах. Если образцы заморожены, дайте им оттаять в течение 2-5 минут на льду.
2. Перед началом эксперимента подтвердите все генотипы и объедините только эмбрионы с четкими генотипами.
3. С помощью пипетки P200 добавьте 50 мкл буфера для лизиса ядер к объединенным эмбрионам в пробирке объемом 1,5 мл, стремясь получить минимум 3 эмбриона на одну мутантную группу. Дайте образцам посидеть на льду с буфером для лизиса в течение 5 минут и делайте вихрь каждые 30 секунд.
4. После 5 минут инкубации центрифугировать при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C. С помощью пипетки P200 удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 50 мкл промывочного буфера. После повторного взвешивания центрифугируйте при давлении 500 x g в течение 5 минут при 4 °C.
5. Удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте в 40 мкл DPBS^-/-. Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек. Смешайте 5 мкл ядер с 5 мкл трипанового синего в новой пробирке объемом 1,5 мл. Тщательно пипетируйте смесь и загрузите ее на предметное стекло, чтобы определить количество клеток и жизнеспособность.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ядерная мембрана проницаема для трипанового синего; Таким образом, окрашивание выделенных ядер положительно на трипановый синий. В автоматизированном счетчике клеток процент мертвых клеток используется для оценки процента изолированных ядер (рисунок 5A).
6. Если процент интактных ядер превышает 90% (это означает, что по меньшей мере 90% ядер окрашены трипановым синим цветом и имеют округлую форму и выпуклый вид; см. фиг.5В, В), приступайте к использованию микрофлюидного чипа и следуйте протоколу производителей микрофлюидных чипов¹¹.

6. Секционирование одиночных клеток (включая амплификацию кДНК и построение библиотек)

1. Для получения наиболее оптимальных результатов немедленно приступайте к протоколу секвенирования РНК одиночных клеток в соответствии с протоколом¹¹ производителя микрофлюидных чипов. Установите целевое значение восстановления клеток на уровне 6000 клеток или больше.

7. Секвенирование

1. После создания библиотек измерьте распределение фрагментов по размерам и концентрации образцов с помощью автоматизированного анализатора электрофореза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное распределение размеров фрагментов составляет от 300 до 1000.н.
2. Сэмплы готовы к загрузке в секвенсор. Объединяйте библиотеки из разных образцов в пул. Конечная концентрация загрузки объединенных библиотек составляет 750 пМ в общем объеме 24 мкл. Загрузите объединенные библиотеки в картридж с реагентами, следуя протоколу производителя секвенирования¹².
3. Секвенируйте библиотеки, загруженные в предварительно собранную проточную ячейку и картридж, в соответствии с желаемой глубиной секвенирования с помощью двойной индексации на парном конце. Последовательность чтения в соответствии с протоколом, изложенным производителями микрофлюидных чипов, выглядит следующим образом:¹¹: чтение 1: 28 циклов, индекс i7: 10 циклов, индекс i5: 10 циклов и чтение 2: 90 циклов. После завершения секвенирования данные проходят биоинформатический анализ.
4. Используйте методы биоинформатики для проведения контроля качества. Это включает в себя оценку количества секвенированных клеток, прочтений на клетку и количества генов, картированных на клетку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов количество секвенированных клеток должно составлять не менее 80% от числа целевых клеток. Рекомендуется, чтобы количество прочтений на клетку составляло не менее 30 000, а количество обнаруженных генов превышало 3000 (для образцов мышей).

Результаты

Методология, разработанная в данной статье, специально предназначена для улучшения подготовки образцов эмбрионов для омиксов одиночных клеток от E6.5 до E8. Этот надежный конвейер состоит из пяти основных этапов: синхронизированная беременность, выделение эмбрионов, генотипирование в т...

Обсуждение

В данной работе представлен надежный конвейер для получения высококачественных суспензий одиночных клеток и ядер из гаструляционных эмбрионов мышей, специально разработанный для облегчения исследований механизмов спецификации клеточной судьбы на ранних стадиях развития. Этот мето...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000