Секвенирование РНК одиночных клеток мутантных цельных эмбрионов мыши: от эпибласта до конца гаструляции

Резюме

В этой статье описывается конвейер для высококачественных суспензий одиночных клеток и ядер гаструляционных эмбрионов мышей для секвенирования отдельных клеток и ядер.

Аннотация

За последнее десятилетие подходы с использованием одиночных клеток стали золотым стандартом для изучения динамики экспрессии генов, гетерогенности клеток и состояния клеток в образцах. До появления одиночных клеток возможность захвата динамического клеточного ландшафта и быстрых переходов клеток на ранних этапах развития была ограничена. В данной работе был разработан надежный конвейер для проведения анализа одиночных клеток и ядер эмбрионов мышей с эмбрионов с эмбрионального дня E6,5 по E8, что соответствует началу и завершению гаструляции. Гаструляция является фундаментальным процессом в процессе развития, в ходе которого образуются три зародышевых слоя: мезодерма, эктодерма и энтодерма, которые необходимы для органогенеза. Имеется обширная литература по омиксам одиночных клеток, применяемым к перигаструляционным эмбрионам дикого типа. Тем не менее, одноклеточный анализ мутантных эмбрионов все еще редок и часто ограничен популяциями, отсортированными с помощью FACS. Отчасти это связано с техническими ограничениями, связанными с необходимостью генотипирования, сроками беременности, количеством эмбрионов с желаемыми генотипами за одну беременность и количеством клеток на эмбрион на этих стадиях. В данной статье представлена методология, призванная преодолеть эти ограничения. Этот метод устанавливает рекомендации по разведению и срокам беременности для достижения более высокой вероятности синхронизированной беременности с желаемыми генотипами. Этапы оптимизации процесса выделения эмбрионов в сочетании с протоколом генотипирования в тот же день (3 ч) позволяют проводить одноклеточное исследование на основе микрокапель в тот же день, что обеспечивает высокую жизнеспособность клеток и надежные результаты. Этот метод также включает в себя рекомендации по оптимальному выделению ядер из эмбрионов. Таким образом, эти подходы повышают целесообразность одноклеточных подходов к мутантным эмбрионам на стадии гаструляции. Мы ожидаем, что этот метод облегчит анализ того, как мутации формируют клеточный ландшафт гаструлы.

Введение

Гаструляция является фундаментальным процессом, необходимым для нормального развития. Этот быстрый и динамичный процесс происходит, когда плюрипотентные клетки превращаются в предшественников, специфичных для линии, которые определяют формирование органов. В течение многих лет гаструляция долгое время определялась как формирование трех в значительной степени однородных популяций: мезодермы, эктодермы и энтодермы. Тем не менее, технологии с высоким разрешением и растущее число моделей эмбриональных стволовых клеток ^1,2 обнаруживают беспрецедентную гетерогенность среди ранних зародышевых слоев ^3,4

протокол

Этот протокол и все описанные эксперименты на животных были официально одобрены и соответствуют институциональным руководящим принципам, установленным Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Университета Темпл, который следует международным рекомендациям Ассоциации по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными. Все описанные мыши находились на базовом штамме C57/BL6N. В этих исследованиях не наблюдалось никаких проблем со здоровьем животных.

1. Колония и сроки беременности

1. Засекайте время беременности с помощью визуализации вагинальной пробки. Полдень в день свечения счита....

Результаты

Методология, разработанная в данной статье, специально предназначена для улучшения подготовки образцов эмбрионов для омиксов одиночных клеток от E6.5 до E8. Этот надежный конвейер состоит из пяти основных этапов: синхронизированная беременность, выделение эмбрионов, генотипирование в т.......

Обсуждение

В данной работе представлен надежный конвейер для получения высококачественных суспензий одиночных клеток и ядер из гаструляционных эмбрионов мышей, специально разработанный для облегчения исследований механизмов спецификации клеточной судьбы на ранних стадиях развития. Этот мето.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000