Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione

Riepilogo

Questo articolo stabilisce una pipeline per sospensioni di singole cellule e nuclei di alta qualità di embrioni di topo gastrulanti per il sequenziamento di singole cellule e nuclei.

Abstract

Nell'ultimo decennio, gli approcci a singola cellula sono diventati il gold standard per lo studio della dinamica dell'espressione genica, dell'eterogeneità cellulare e degli stati cellulari all'interno dei campioni. Prima dell'avanzamento delle singole cellule, la possibilità di catturare il panorama cellulare dinamico e le rapide transizioni cellulari durante lo sviluppo iniziale era limitata. In questo articolo, è stata progettata una robusta pipeline per eseguire analisi di singole cellule e nuclei su embrioni di topo dal giorno embrionale E6.5 a E8, corrispondente all'inizio e al completamento della gastrulazione. La gastrulazione è un processo fondamentale durante lo sviluppo che stabilisce i tre strati germinali: mesoderma, ectoderma ed endoderma, che sono essenziali per l'organogenesi. È disponibile un'ampia letteratura sulle omiche a singola cellula applicate agli embrioni perigastrulanti wild-type. Tuttavia, l'analisi di embrioni mutanti su singole cellule è ancora scarsa e spesso limitata alle popolazioni selezionate con FACS. Ciò è in parte dovuto ai vincoli tecnici associati alla necessità di genotipizzazione, alle gravidanze programmate, al numero di embrioni con genotipi desiderati per gravidanza e al numero di cellule per embrione in queste fasi. Qui viene presentata una metodologia progettata per superare questi limiti. Questo metodo stabilisce linee guida per l'allevamento e la gravidanza a tempo per ottenere una maggiore possibilità di gravidanze sincronizzate con i genotipi desiderati. Le fasi di ottimizzazione del processo di isolamento dell'embrione, abbinate a un protocollo di genotipizzazione in giornata (3 ore), consentono di eseguire una singola cellula basata su microgoccioline nello stesso giorno, garantendo un'elevata vitalità delle cellule e risultati robusti. Questo metodo include inoltre linee guida per l'isolamento ottimale dei nuclei dagli embrioni. Pertanto, questi approcci aumentano la fattibilità di approcci a singola cellula di embrioni mutanti nella fase di gastrulazione. Prevediamo che questo metodo faciliterà l'analisi di come le mutazioni modellano il paesaggio cellulare della gastrula.

Introduzione

La gastrulazione è un processo fondamentale necessario per il normale sviluppo. Questo processo rapido e dinamico si verifica quando le cellule pluripotenti si trasformano in precursori specifici del lignaggio che definiscono il modo in cui si formano gli organi. Per anni, la gastrulazione è stata a lungo definita come la formazione di tre popolazioni in gran parte omogenee: mesoderma, ectoderma ed endoderma. Tuttavia, le tecnologie ad alta risoluzione e un numero emergente di modelli di cellule staminali embrionali ^1,2 rivelano un'eterogeneità senza precedenti tra gli strati germinali precoci ^3,4. Ciò suggerisce che resta ancora molto da scoprire sui meccanismi che regolano le distinte popolazioni cellulari della gastrula. Lo sviluppo embrionale del topo è stato uno dei migliori modelli per studiare le prime decisioni sul destino cellulare durante la gastrulazione ^3,5. La gastrulazione nei topi è rapida, poiché l'intero processo di gastrulazione avviene entro 48 ore, dal giorno embrionale E6.5 a E8⁵.

I recenti progressi nelle tecnologie a singola cellula hanno permesso una mappatura dettagliata dello sviluppo embrionale di topo wild-type, fornendo una panoramica completa dei paesaggi cellulari e molecolari degli embrioni durante la gastrulazione 3,4,6,7,8. Tuttavia, l'analisi degli embrioni mutanti in queste fasi è meno comune e spesso limitata alle popolazioni selezionate FACS ^9,10. La scarsa letteratura riflette le sfide tecniche associate alla manipolazione e alla preparazione di singole cellule di embrioni gastrulanti che richiedono la genotipizzazione. Catturare il processo dinamico di gastrulazione può rappresentare una sfida a causa della sua natura rapida, soprattutto per la comprensione degli embrioni mutanti. La tempistica e la sincronizzazione delle gravidanze sono essenziali, poiché anche lievi differenze tra le gravidanze programmate possono essere interpretate erroneamente come un fenotipo di sviluppo derivante dal gene mutante. Ciò diventa particolarmente importante quando il gene mutante influenza il processo di gastrulazione ^13,14. In questo studio, vengono stabilite le linee guida per ottenere gravidanze sincronizzate attraverso la visualizzazione dei tappi vaginali (cioè la massa di liquido seminale coagulato formata nella vagina della femmina dopo l'accoppiamento). Inoltre, è stata progettata una strategia per ottenere dati solidi su singole cellule da embrioni gastrulanti mutanti da E6.5 a E8. Questa strategia è stata ideata per superare i vincoli associati al basso numero di embrioni con il genotipo desiderato per gravidanza e alla diminuzione della vitalità causata dal congelamento-scongelamento di embrioni o cellule.

Questo articolo descrive una metodologia ottimizzata dall'instaurazione di gravidanze temporizzate tramite tappi vaginali al sequenziamento finale di singole cellule/nuclei. Questo metodo spiega come aumentare il numero di gravidanze sincronizzate per ottenere un numero maggiore di embrioni con il genotipo desiderato, isolamenti di cellule/nuclei per migliorare la vitalità delle cellule e un protocollo di genotipizzazione in giornata. Questo manoscritto descrive anche il processo di isolamento dell'embrione in diversi punti temporali della gastrulazione. La metodologia aiuta ad aumentare il numero di cellule/nuclei embrionali vitali finali per il sequenziamento, garantendo dati di sequenziamento di alta qualità. Pertanto, questo metodo aprirà le porte a studi su singole cellule di embrioni gastrulanti che richiedono la genotipizzazione.

Protocollo

Questo protocollo e tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati formalmente approvati e in conformità con le linee guida istituzionali stabilite dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Temple University, che segue le linee guida internazionali dell'Associazione per la Valutazione e l'Accreditamento della Cura degli Animali da Laboratorio. Tutti i topi descritti erano sul ceppo di fondo C57/BL6N. In questi studi non sono stati osservati problemi di salute animale.

1. Colonia riproduttiva e gravidanze a tempo

1. Cronometrare le gravidanze con la visualizzazione di un tappo vaginale. Il mezzogiorno del giorno della spina è considerato E0.5.
2. Topi domestici in gabbie con materiale da lettiera contenente lettiera in legno duro scheggiato e materiale di nidificazione in carta.
   1. Ogni gabbia contiene cibo per topi, acqua dolce e un elemento di arricchimento (ad esempio, tunnel e materiale per la nidificazione). Traccia e raccogli informazioni sulla colonia ogni giorno durante la riproduzione a tempo.
   2. Registra tutte le informazioni come l'età del topo, il numero di gravidanze che una femmina di topo ha avuto, il numero di spine posizionate da un topo maschio e lo stadio di estrale (Figura 2) per le femmine di topo.
      NOTA: Le femmine che hanno già partorito 1-2 volte partoriranno cucciolate di dimensioni maggiori nelle gravidanze future.
3. Prima di iniziare le gravidanze programmate, ospita il topo maschio da solo in una gabbia 1 settimana prima della riproduzione. Durante la settimana di inizio della riproduzione, introdurre almeno 1 femmina per maschio nella gabbia.
   NOTA: A seconda del protocollo animale approvato, l'aggiunta di 2-3 femmine in una gabbia da riproduzione può essere consentita ed è preferibile per aumentare la generazione di tappi.
4. Imposta almeno 4 terzetti riproduttori (2 topi femmine per 1 maschio) per aumentare le possibilità di gravidanze sincronizzate tra le gabbie (ovvero, più spine nello stesso giorno). Ciò aumenterà il numero di embrioni isolati nella stessa fase di sviluppo.
5. Organizza l'accoppiamento ideale nel pomeriggio o la sera prima delle 17:00 e le femmine vengono messe nella gabbia del maschio o viceversa. Se la riproduzione non avviene entro 4-5 giorni, prendi in considerazione la possibilità di cambiare i partner di accoppiamento a giorni alterni.
   NOTA: Se non è possibile verificare la presenza di un tappo vaginale la mattina seguente, separare la coppia riproduttiva la sera prima (ad esempio, fine settimana/festività).
6. Controllare la presenza di tappi vaginali ogni giorno al mattino presto; prima delle 9 del mattino è preferibile.
   1. Per verificare la presenza di tappi vaginali, sollevare delicatamente le topine femmina per la base della coda e osservare l'apertura vaginale. Cerca una massa gelatinosa bianca o color crema. Spesso, il tappo vaginale può essere evidente, ma se non è chiaro, prendi una pinzetta e sonda delicatamente l'apertura vaginale. Considera solo le spine più evidenti per l'isolamento. Fare riferimento alla Figura 2C.
      NOTA: È fondamentale verificare la presenza di tappi vaginali il prima possibile al mattino per evitare di perdere una potenziale gravidanza. I tappi possono cadere o dissolversi dopo 12 ore.
      NOTA: Anche se si osserva una spina, non garantisce che la femmina di topo sarà incinta. Se si osserva un tappo parziale o assente ma c'è arrossamento vicino all'apertura vaginale delle topie femmine, non considerare queste femmine per l'isolamento poiché c'è una probabilità meno probabile che il tappo si attacchi. La probabilità di gravidanza dopo l'accoppiamento varia tra i ceppi di topo e dipende dalla fase del ciclo estrale durante l'accoppiamento (Figura 2).
7. Una volta osservato un tappo vaginale, registrare il giorno. Il mezzogiorno dello stesso giorno in cui si osserva il tappo vaginale è considerato E0,5. Separare le femmine di topo dalla gabbia di riproduzione e isolare gli embrioni a seconda dello stadio di gastrulazione desiderato.
   NOTA: Questo metodo non fornisce tempi precisi per l'accoppiamento. Convenzionalmente, si presume che l'accoppiamento avvenga intorno alla mezzanotte della notte precedente. Di conseguenza, gli embrioni sono considerati di mezza giornata (E0,5) a mezzogiorno del giorno in cui si osserva il tappo vaginale.

2. Isolamento di embrioni di topo durante la gastrulazione

1. Prima di iniziare l'isolamento dell'embrione, preparare tutti i reagenti e le attrezzature necessarie.
   1. Pulisci accuratamente l'area con etanolo al 70%. Assicurarsi che tutti gli strumenti di dissezione (pinze e forbici) siano lavati e sterilizzati. Procurare 5 ml sterili di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/10% di siero fetale bovino (FBS) e 20 ml di DPBS^-/- e mettere su ghiaccio.
   2. Eseguire tutti gli isolamenti utilizzando uno stereomicroscopio con un tavolino a luce trasmessa e una telecamera per assistere con la fenotipizzazione dello sviluppo macroscopico.
2. Sopprimere la madre del topo incinta e iniziare immediatamente l'isolamento.
   1. Posizionare la madre gravida in una camera di CO₂ con la portata di CO₂ regolata per spostare il 20% del volume della gabbia al minuto. Monitora attentamente il topo e conferma la morte osservando l'assenza di movimenti respiratori.
   2. Mantenere il flusso di CO₂ per altri 2 minuti dopo l'assenza di movimenti respiratori. Confermare l'eutanasia eseguendo una lussazione cervicale.
   3. Posizionare i mouse in una normale posizione eretta su una superficie solida e piana. Quindi, con il pollice e l'indice di una mano contro la parte posteriore del collo alla base del cranio, spingere avanti e verso il basso mentre si tira indietro con l'altra mano che tiene la base della coda.
   4. Verificare l'efficacia della lussazione sentendo la separazione delle vertebre cervicali. Quando il midollo spinale viene reciso, uno spazio di 2-4 mm sarà palpabile tra i condili occipitali e la prima vertebra cervicale.
      NOTA: Non sopprimere più madri gravide contemporaneamente, poiché la vitalità cellulare ne risentirà. L'isofluorano può essere utilizzato come agente anestetico alternativo se approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) o da un organismo equivalente.
3. Posiziona la madre incinta sul dorso e sterilizza l'area vicino all'apertura vaginale con etanolo.
   1. Usando le forbici da dissezione e le pinzette, solleva la piega cutanea vicino all'apertura vaginale e fai un piccolo taglio a forma di V, rivelando lentamente l'utero della madre incinta (Figura 3 [freccia gialla]).
   2. Seziona il corno uterino della madre incinta tenendone un'estremità con una pinzetta e tagliandolo, assicurandoti di rimuovere la cervice. Posizionare il corno uterino in una capsula di Petri di 10 cm contenente DPBS^-/- con ghiaccio (Figura 3).
      NOTA: A seconda della fase di isolamento dell'embrione, l'utero assomiglierà a siti di impianto più piccoli o più grandi (cioè "perle" su un filo).
4. Con le forbici da dissezione e le pinzette, tagliare ogni sito di impianto ("perle") contenente i rigonfiamenti deciduali all'interno e metterlo in DPBS fresco^-/- in una capsula di Petri di 6 cm su ghiaccio (Figura 3).
   NOTA: Una madre incinta media avrà circa 6-8 embrioni impiantati.
5. Prendere un sito di impianto e posizionarlo su una nuova piastra di Petri da 6 cm sopra il tavolino dello stereomicroscopio e aggiungere 500 μL di DPBS^-/- su di esso. Regolare la messa a fuoco del microscopio e la sorgente luminosa (Figura 3).
   NOTA: A seconda delle dimensioni del sito di impianto, la quantità di DPBS può variare; l'obiettivo è quello di avere abbastanza DPBS da sommergere il sito di impianto.
6. Utilizzando una pinzetta per dissezione a punta fine, rimuovere il muscolo uterino dal sito di impianto. Tenere premuto il sito di impianto con una serie di pinzette in una mano e inserire lentamente un altro paio di pinze con l'altra mano nell'estremità del sito di impianto tagliato dal corno uterino, rivelando lentamente il gonfiore della decidua (Figura 3).
   NOTA: Non tirare o tirare troppo forte sulla superficie uterina, poiché può portare alla rottura del gonfiore deciduale o addirittura alla lisi dell'embrione.
7. Dopo che il gonfiore deciduale è stato isolato, procedere a rivelare l'embrione.
   1. Tenere l'estremità anti-mesometrial del rigonfiamento deciduale con un paio di pinze e, con l'altro paio, praticare lentamente un taglio orizzontale di circa 1/4 della dimensione del rigonfiamento deciduale dall'estremità mesometrial (cioè, spesso l'estremità più appuntita del rigonfiamento deciduale).
   2. Ora, con entrambe le pinze, spingi lentamente dall'estremità anti-mesometrial del gonfiore deciduale e l'embrione uscirà dall'estremità mesometrial appena tagliata (Figura 3).
      NOTA: Non strappare il gonfiore deciduale, poiché ciò spezzerebbe l'embrione. Se necessario, fare tagli più piccoli lungo l'estremità mesometrial del rigonfiamento deciduale.
8. Una volta che l'embrione è stato rivelato, rimuovere tutti i tessuti extraembrionali attaccati.
   1. Il sacco endodermico parietale e il cono ectoplacentare potrebbero staccarsi spontaneamente dall'embrione durante il processo di rivelazione, ma in caso contrario, utilizzare un paio di pinze e rimuoverle insieme a qualsiasi sangue materno associato. Quindi, usando due pinze, tieni premuto l'embrione con un paio e stacca lentamente il sacco vitellino viscerale dall'embrione usando l'altro set.
   2. Utilizzando una pipetta P20, posizionare il sacco vitellino con non più di 10 μl di DPBS^-/- dalla piastra in una provetta a 8 strisce di reazione a catena della polimerasi (PCR) su ghiaccio, poiché questa verrà utilizzata per la genotipizzazione in giornata.
      NOTA: È fondamentale che il campione del sacco vitellino non sia contaminato dal tessuto della madre gravida. La contaminazione può portare a un'errata assegnazione del genotipo dell'embrione.
9. Scatta foto in campo chiaro degli embrioni appena isolati per assicurarti che la stadiazione dei compagni di cucciolata sia simile. Con una pipetta P200, pipettare lentamente l'embrione con 50 μL di DMEM/10% FBS e metterlo in una provetta da 1,5 mL con ghiaccio. Lascia che gli embrioni rimangano in ghiaccio fino a quando i genotipi non sono stati confermati.
   NOTA: Gli embrioni sono stati tenuti in ghiaccio per 3-4 ore senza degradazione evidente, ma non hanno superato questo tempo, poiché si verificherà una diminuzione della vitalità cellulare. Etichettare gli embrioni e le provette di genotipizzazione di conseguenza. L'acquisizione di immagini in campo chiaro è incoraggiata per identificare e annotare le differenze fenotipiche grossolane tra gli embrioni.
10. Ripetere questi passaggi per tutti i rigonfiamenti deciduali rimanenti. Pulire tutti gli strumenti di dissezione e utilizzare nuove plastiche per ogni isolamento per garantire l'assenza di contaminazione da isolamenti precedenti.
    NOTA: Assicurarsi che le procedure di dissezione siano limitate a 1 ora dal momento della raccolta del sito di impianto dalla madre gravida.
11. Procedere all'isolamento degli embrioni dalla madre gravida successiva (se sono state identificate più gravidanze sincronizzate) prima di passare alla fase di genotipizzazione dello stesso giorno.

3. Genotipizzazione in giornata (Figura 4)

1. Digerire ogni sacco vitellino viscerale in una provetta PCR a 8 strisce. Utilizzando una pipetta P20, aggiungere 19,3 μL di tampone di lisi del DNA del modello PCR e 0,7 μL di 0,2 μg/mL di proteinasi K a ciascun campione del sacco vitellino.
2. Agitare il campione per 10 s e farlo girare verso il basso per posizionare i campioni sul fondo della provetta utilizzando una mini centrifuga con un adattatore a striscia a 1.000 x g per 10 s. Posizionare la provetta per PCR a 8 strisce in un blocco termico a 85 °C per 45 minuti e agitare per 5 s ogni 5 minuti.
   NOTA: È importante agitare i campioni durante la digestione per massimizzare la lisi cellulare in 45 minuti.
3. Dopo 45 minuti, centrifugare la striscia della provetta verso il basso utilizzando una mini centrifuga con un adattatore per strisce a 1.000 x g per 10 s e procedere con la PCR per l'identificazione genetica desiderata. Come riferimento, viene fornito un protocollo di esempio per un sistema Cre-lox. Di seguito è riportato un esempio di condizioni PCR per la genotipizzazione Cre. Primer di progettazione per amplificare le regioni 5' e 3' del sito Cre mirato.
4. Per eseguire la reazione PCR per la genotipizzazione di Cre, preparare una master mix PCR per provetta PCR a 8 strisce per ogni sacco vitellino contenente 10 μl di miscela di DNA polimerasi Taq, 0,5 μl di primer Cre diretto 0,5 μM, 0,5 μl di primer Cre inverso 0,5 μM, 5 μl di acqua certificata PCR e 4 μl di DNA genomico del sacco vitellino.
   NOTA: Se si utilizza un protocollo ottimizzato per la genotipizzazione della coda di topo, aggiungere il doppio della quantità di DNA che viene tipicamente utilizzata per ottenere risultati più puliti.
5. Una volta realizzata la miscela master PCR, eseguire il programma di amplificazione del ciclo termico PCR. Per la genotipizzazione Cre, il ciclo è il seguente: (1) 95 °C per 3 min, (2) 95 °C per 30 s, (3) 55 °C per 30 s, (4) 72 °C per 30 s, passaggio ripetuto 2-4 per 34 cicli, (5) 72 °C per 10 min, (6) 4 °C hold. Esegui i prodotti PCR su un gel di agarosio all'1% per trarre conclusioni sulla genotipizzazione.
   NOTA: Se è necessaria più di una PCR per l'identificazione genetica, eseguire le reazioni PCR contemporaneamente per ottimizzare i tempi. Per accelerare il processo, preparare il gel di agarosio con un giorno di anticipo il giorno dell'esperimento e conservarlo a 4 °C per una notte. Non considerare campioni senza genotipi chiari. Prendere in considerazione sia il genotipo che lo stadio di sviluppo per i campioni, poiché i compagni di cucciolata potrebbero trovarsi in diversi stadi di gastrulazione e potenzialmente distorcere i risultati. Quando si esegue la genotipizzazione degli alleli LoxP, le bande PCR attese nel gel possono variare a seconda del Cre-driver utilizzato. Ad esempio, se il driver Cre è espresso nel sacco vitellino viscerale, la banda Loxp apparirà spostata negli embrioni Cre-positivi (Cre+), rispetto al Cre-negativo (Cre-). Tuttavia, se il Cre non è espresso nel sacco vitellino viscerale, la dimensione della banda di Loxp sarà la stessa negli embrioni Cre+ e Cre- (cioè, gli alleli di Loxp non saranno fusi nella linea del sacco vitellino). Un embrione portatore di un allele Cre+ e due alleli Loxp è considerato un embrione KO condizionale. Tuttavia, per confermare la delezione del gene floxed, si raccomanda di eseguire una conferma del knockout del gene sulle cellule che esprimono il driver Cre, ripetendo il protocollo di genotipizzazione o mediante analisi qPCR dei livelli di mRNA del gene floxed (Figura 4D, E).
6. Conservare i campioni rimanenti del sacco vitellino digerito nel congelatore a -20 °C per una conservazione a lungo termine.

4. Dissociazione cellulare degli embrioni e vitalità cellulare

1. Una volta confermati i genotipi, prelevare una pipetta P200 e pipettare 50 μL di DMEM/10% FBS. Raggruppare gli embrioni con lo stesso genotipo in una nuova provetta da 1,5 ml e posizionare la provetta sul ghiaccio.
   NOTA: Non procedere con l'esperimento se non ci sono almeno 5 embrioni per gruppo (E7-E7.5) o 3 (E7.75-E8), poiché la conta cellulare e la vitalità diminuiranno enormemente.
2. Dopo che gli embrioni sono stati raggruppati in base ai genotipi, lasciarli depositare sul fondo della provetta. Lavare gli embrioni aggregati aggiungendo 50 μL di DPBS^-/-, quindi attendere che gli embrioni si stabilizzino prima di rimuovere la maggior quantità possibile di DPBS^-/- senza rimuovere gli embrioni dalla provetta. Ripetere questo passaggio due volte.
   NOTA: Tenendo la provetta da 1,5 mL vicino a una fonte di luce o verso una finestra, sarà più facile vedere gli embrioni che si depositano sul fondo della provetta.
3. Aggiungere 100 μL di tripsina agli embrioni raggruppati e incubare a 37 °C in un blocco termico per 5 minuti. Muovere delicatamente le provette da 1,5 ml ogni 30 s per aiutare le cellule a dissociarsi.
   NOTA: Non utilizzare un vortice o una pipetta durante il processo di tripsinizzazione, poiché danneggia le cellule. Se vengono raggruppati più di 5 embrioni (E7-E7.5) o 3 embrioni (E7.75-E8), eseguire la digestione della tripsina in un'altra provetta con una quantità equivalente di tripsina (~20 μL per 1 embrione). Utilizzare ~20 μL di tripsina per embrione (E6.5-E7.5), 35 μL per embrione (E7.75) e 40 μL per embrione (E8).
4. Dopo 5 minuti, neutralizzare la tripsina con 300 μL di DMEM/10% FBS. Centrifugare gli embrioni aggregati a 100 x g per 4 minuti a temperatura ambiente (RT). Dopo la centrifugazione, apparirà un piccolo pellet per tutti i campioni. Risospendere i pellet in 40 μL di DMEM/10% FBS e metterli sul ghiaccio.
   NOTA: La dimensione del pellet varierà a seconda del numero di embrioni aggregati. È possibile che il pellet non sia visibile ma procedere con il passaggio successivo. La quantità di DMEM/10% FBS necessaria per neutralizzare la tripsina dipenderà dalla quantità di tripsina aggiunta. Aggiungere 3 volte la quantità di DMEM/10% alla quantità di tripsina.
5. Determinare la concentrazione delle cellule risospese (40 μL) utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Miscelare 5 μL di cellule con 5 μL di blu di tripano in una nuova provetta da 1,5 mL. Pipettare, mescolare accuratamente e pipettare su un vetrino per determinare il numero e la vitalità cellulare. La concentrazione ottimale di cellule è di 700-1200 cellule/μL e la vitalità cellulare è del 90% o superiore.
   NOTA: Se la concentrazione è inferiore a 200 cellule/μL e la vitalità è inferiore al 50%, non continuare l'esperimento. Se la concentrazione cellulare è troppo alta, diluire la sospensione cellulare e contare nuovamente le cellule. Se si osservano grumi cellulari, utilizzare un filtro cellulare per garantire una sospensione a cellula singola.
6. Procedere al partizionamento a cella singola utilizzando un chip microfluidico e seguire il protocollo dei produttori di chip microfluidici¹¹.

5. Isolamento dei nuclei di embrioni di topo (opzione per punti temporali embrionali più grandi da E8 in poi)

1. Preparare la lisi fresca e i tamponi di lavaggio descritti nella Tabella 1 e metterli sul ghiaccio.
   NOTA: L'isolamento dei nuclei può essere eseguito su campioni freschi o congelati. Se i campioni sono congelati, lasciarli scongelare per 2-5 minuti con ghiaccio.
2. Prima di iniziare l'esperimento, confermare tutti i genotipi e raggruppare solo gli embrioni con genotipi chiari.
3. Utilizzando una pipetta P200, aggiungere 50 μL di tampone di lisi nucleica agli embrioni raggruppati in una provetta da 1,5 mL, con l'obiettivo di ottenere un minimo di 3 embrioni per gruppo mutante. Lasciare riposare i campioni sul ghiaccio con il tampone di lisi per 5 minuti e vorticare ogni 30 s.
4. Dopo 5 minuti di incubazione, centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Utilizzando una pipetta P200, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 50 μl di tampone di lavaggio. Una volta risospeso, centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C.
5. Rimuovere il surnatante e risospendere in 40 μL di DPBS^-/-. Conta le celle utilizzando un contatore di celle automatizzato. Mescolare 5 μL di nuclei con 5 μL di blu di tripano in una nuova provetta da 1,5 mL. Pipettare accuratamente la miscela e caricarla su un vetrino per determinare il numero di cellule e la vitalità.
   NOTA: La membrana nucleare è permeabile al blu di tripano; Pertanto, la colorazione dei nuclei isolati è positiva per il blu di tripano. In un contatore automatico di cellule, la percentuale di cellule morte viene utilizzata per stimare la percentuale di nuclei isolati (Figura 5A).
6. Se la percentuale di nuclei intatti è superiore al 90% (il che significa che almeno il 90% dei nuclei sono colorati con blu di tripano e presentano una forma arrotondata e un aspetto turgido; fare riferimento alla Figura 5B, C), procedere con l'utilizzo di un chip microfluidico e seguire il protocollo dei produttori di chip microfluidici¹¹.

6. Partizionamento di singole cellule (inclusa l'amplificazione del cDNA e la costruzione di librerie)

1. Procedere immediatamente con il protocollo di sequenziamento dell'RNA a singola cellula seguendo il protocollo¹¹ del produttore del chip microfluidico per ottenere i risultati più ottimali. Impostare il recupero delle cellule di destinazione su 6000 celle o superiore.

7. Sequenziamento

1. Dopo aver costruito le librerie, misurare la distribuzione delle dimensioni dei frammenti e le concentrazioni dei campioni utilizzando un analizzatore automatico di elettroforesi.
   NOTA: Le distribuzioni ottimali delle dimensioni dei frammenti sono comprese tra 300 e 1000 bp.
2. I campioni sono pronti per essere caricati nel sequencer. Pool di librerie da campioni diversi. La concentrazione di carico finale delle librerie raggruppate è di 750 pM in un volume totale di 24 μL. Caricare le librerie raggruppate nella cartuccia del reagente, seguendo il protocollo¹² del produttore del sequenziamento.
3. Sequenzia le librerie caricate nella cella di flusso e nella cartuccia preassemblate in base alla profondità di sequenziamento desiderata con doppia indicizzazione pair-end. Le letture di sequenziamento aderenti al protocollo delineato dai produttori di chip microfluidici sono le seguenti:¹¹: Lettura 1: 28 cicli, Indice i7: 10 cicli, Indice i5: 10 cicli e Lettura 2: 90 cicli. Dopo il completamento del sequenziamento, i dati vengono sottoposti ad analisi bioinformatiche.
4. Utilizzare metodi bioinformatici per eseguire controlli di qualità. Ciò include la valutazione del numero di cellule sequenziate, delle letture per cellula e del numero di geni mappati per cellula.
   NOTA: Per risultati ottimali, il numero di cellule sequenziate è almeno l'80% delle cellule bersaglio. Si raccomanda che il numero di letture per cellula sia di almeno 30.000 e che il numero di geni rilevati sia superiore a 3000 (per i campioni di topo).

Risultati

La metodologia progettata in questo articolo è specificamente destinata a migliorare la preparazione di campioni di embrioni per l'omica a singola cellula da E6.5 a E8. Questa solida pipeline è composta da cinque fasi principali: gravidanze sincronizzate a tempo, isolamento degli embrioni, genotipizzazione in giornata, dissociazione cellulare e valutazione della vitalità cellulare (Figura 1A). Mentre i dati presentati si concentrano su punti temporali da E7 a E7.5, possono essere applicat...

Discussione

In questo articolo viene presentata una robusta pipeline per ottenere sospensioni di singole cellule e nuclei di alta qualità da embrioni di topo gastrulanti, specificamente progettata per facilitare gli studi sui meccanismi di specificazione del destino cellulare nelle prime fasi di sviluppo. Questo metodo affronta una lacuna cruciale nel campo della gastrulazione ottimizzando l'analisi degli embrioni che richiedono genotipi, come il sesso o i geni somatici. Utilizzando modelli murini di mutazione genetica e impiegando...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000