돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

요약

이 논문은 단일 세포 및 핵의 염기서열 분석을 위한 gastrulating mouse embryos의 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 위한 파이프라인을 설정합니다.

초록

지난 10년 동안 단일 세포 접근법은 유전자 발현 역학, 세포 이질성 및 샘플 내 세포 상태를 연구하기 위한 황금 표준이 되었습니다. 단일 세포가 발전하기 전에는 초기 개발 과정에서 역동적인 세포 환경과 빠른 세포 전이를 포착하는 것이 불가능했습니다. 이 논문에서는 배아 E6.5일부터 E8일까지의 마우스 배아에 대해 단세포 및 핵 분석을 수행하도록 견고한 파이프라인을 설계했으며, 이는 위축작용의 시작 및 완료에 해당합니다. 위축(Gastrulation)은 기관 형성에 필수적인 세 가지 생식층, 즉 중배엽(mesoderm), 외배엽(ectoderm), 내배엽(endoderm)을 형성하는 발달 과정의 기본 과정입니다. 야생형 주위 배아에 적용되는 single-cell omics에 대한 광범위한 문헌을 이용할 수 있습니다. 그러나 돌연변이 배아에 대한 단세포 분석은 여전히 부족하며 FACS로 분류된 집단에 국한되는 경우가 많습니다. 이는 부분적으로 유전형 분석, 임신 시기 제한, 임신당 원하는 유전자형을 가진 배아의 수, 이 단계에서 배아당 세포 수의 필요성과 관련된 기술적 제약 때문입니다. 여기에서는 이러한 한계를 극복하기 위해 고안된 방법론을 제시합니다. 이 방법은 원하는 유전자형과 동기화된 임신 가능성을 높이기 위해 번식 및 시기별 임신 지침을 설정합니다. 당일 유전형 분석 프로토콜(3시간)과 결합된 배아 분리 과정의 최적화 단계를 통해 미세 방울 기반 단일 세포를 같은 날에 수행할 수 있어 세포의 높은 생존력과 강력한 결과를 보장할 수 있습니다. 이 방법에는 배아에서 최적의 핵 분리를 위한 지침이 추가로 포함됩니다. 따라서, 이러한 접근법은 위축(gastrulation) 단계에서 돌연변이 배아(mutant embryo)에 대한 단세포 접근법의 실현 가능성을 증가시킨다. 우리는 이 방법이 돌연변이가 위골의 세포 환경을 어떻게 형성하는지에 대한 분석을 용이하게 할 것으로 기대합니다.

서문

위축은 정상적인 발달에 필요한 기본적인 과정입니다. 이 빠르고 역동적인 과정은 만능 세포가 장기가 형성되는 방식을 정의하는 계통 특이적 전구체로 전환될 때 발생합니다. 수년 동안 gastrulation은 오랫동안 중배엽, 외배엽 및 내배엽의 세 가지 크게 균질 한 집단의 형성으로 정의되었습니다. 그러나, 고해상도 기술과 새로운 배아 줄기 세포 모델(embryonic stem cell model)^1,2은 초기 생식층^(germ layers)^3,4 사이에서 전례 없는 이질성(heterogeneity)을 밝혀내고 있다. 이것은 위스트룰라의 뚜렷한 세포 집단을 조절하는 메커니즘에 대해 밝혀져야 할 것이 훨씬 더 많다는 것을 시사합니다. 마우스 배아 발달은 gastrulation ^3,5 동안 초기 세포 운명 결정을 연구하는 가장 좋은 모델 중 하나였습니다. 생쥐의 위축은 배아 E6.5일에서 E8⁵까지 48시간 이내에 전체 위형성 과정이 발생하기 때문에 빠릅니다.

최근 단세포 기술의 발전으로 야생형 마우스 배아 발달에 대한 상세한 매핑이 가능해졌으며, 이는 위축작용 중 배아의 세포 및 분자 환경에 대한 포괄적인 개요를 제공합니다 3,4,6,7,8. 그러나, 이 단계에서 돌연변이 배아에 대한 분석은 덜 일반적이며, 종종 FACS에 의해 분류된 집단에 국한된다 ^9,10. 희소한 문헌은 유전형 분석이 필요한 gastrulating embryos의 조작 및 단일 세포 준비와 관련된 기술적 문제를 반영합니다. 위축의 역동적인 과정을 포착하는 것은 특히 돌연변이 배아를 이해하는 데 있어 빠른 특성으로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 임신 시기와 동기화는 매우 중요한데, 임신 시기가 정해진 임신 간의 조금만 차이 나도 돌연변이 유전자에서 비롯된 발달 표현형으로 잘못 해석될 수 있기 때문입니다. 이것은 돌연변이 유전자가 위형성 과정에 영향을 미칠 때 특히 중요해진다^13,14. 이 연구에서는 질 마개(즉, 짝짓기 후 암컷의 질에서 형성된 응고된 정액의 질량)의 시각화를 통해 동기화된 임신을 얻기 위한 지침을 수립합니다. 또한, E6.5에서 E8까지의 돌연변이 배아로부터 강력한 단세포 데이터를 얻기 위한 전략이 고안되었습니다. 이 전략은 임신당 원하는 유전자형을 가진 배아의 수가 적고 배아 또는 세포의 동결-해동으로 인한 생존력 감소와 관련된 제약을 극복하기 위해 고안되었습니다.

이 논문은 질 플러그를 통한 시간 제한 임신의 확립부터 단일 세포/핵의 최종 시퀀싱에 이르기까지 최적화된 방법론을 설명합니다. 이 방법은 원하는 유전자형을 가진 더 많은 수의 배아를 얻기 위해 동기화된 임신 수를 늘리는 방법, 세포의 생존력을 개선하기 위한 세포/핵 분리 및 당일 유전형 분석 프로토콜을 설명하는 방법을 설명합니다. 이 원고는 또한 다양한 위축 시점에서의 배아 분리 과정을 설명합니다. 이 방법론은 염기서열분석을 위한 최종 생존 가능한 배아 세포/핵의 수를 증가시켜 고품질 염기서열분석 데이터를 보장하는 데 도움이 됩니다. 따라서 이 방법은 유전형 분석이 필요한 배아의 단세포 연구의 문을 열 것입니다.

프로토콜

이 프로토콜과 설명된 모든 동물 실험은 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) 국제 지침을 따르는 템플 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Temple University Institutional Animal Care and Use Committee)에서 제정한 기관 지침에 따라 공식적으로 승인되었습니다. 기술된 모든 마우스는 C57/BL6N 배경 균주에 있었다. 이 연구에서 동물의 건강에 대한 우려는 관찰되지 않았다.

1. 번식 식민지와 시간 제한 임신

1. 질 플러그의 시각화로 임신 시간을 정하십시오. 플러그 당일 정오는 E0.5로 간주됩니다.
2. 부서진 나무 침구와 종이 둥지 재료가 포함된 침구 재료가 있는 우리에 있는 집 쥐.
   1. 각 케이지에는 쥐 차우, 담수 및 농축 항목(예: 터널 및 둥지 재료)이 들어 있습니다. 시간 제한 번식 동안 매일 군집 정보를 추적하고 수집합니다.
   2. 쥐의 나이, 암컷 쥐의 임신 횟수, 수컷 쥐가 삽입한 플러그의 수, 암컷 쥐의 발정 단계(그림 2)와 같은 모든 정보를 기록합니다.
      참고: 이미 1-2번 출산한 암컷은 향후 임신에서 더 큰 새끼를 낳을 것입니다.
3. 시간 제한 임신을 시작하기 전에 번식 1주일 전에 수컷 쥐를 케이지에 혼자 수용하십시오. 번식이 시작되는 주간에는 수컷 한 마리당 최소 1마리의 암컷을 케이지에 도입합니다.
   알림: 승인된 동물 프로토콜에 따라 번식 케이지에 2-3마리의 암컷을 추가하는 것이 허용될 수 있으며 플러그 생성을 늘리는 것이 좋습니다.
4. 최소 4개의 번식 트리오(암컷 쥐 2마리 대 수컷 1마리)를 설정하여 케이지 전체에서 동기화된 임신 가능성을 높입니다(즉, 같은 날에 여러 플러그). 이것은 동일한 발달 단계에서 분리된 배아의 수를 증가시킬 것입니다.
5. 오후 5시 이전에 오후나 저녁에 이상적인 짝짓기를 준비하고 암컷은 수컷의 케이지에 넣거나 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 4-5일 내에 번식이 이루어지지 않으면 이틀에 한 번씩 짝짓기 파트너를 바꾸는 것을 고려하십시오.
   참고: 다음 날 아침에 질 플러그를 확인할 수 없는 경우, 전날 밤(예: 주말/공휴일)에 번식 쌍을 분리하십시오.
6. 매일 이른 아침에 질 마개를 확인하십시오. 오전 9시 이전이 선호됩니다.
   1. 질 마개가 있는지 확인하려면 암컷 쥐의 꼬리 바닥을 부드럽게 들어 올리고 질 입구를 관찰하십시오. 흰색 또는 크림색의 젤라틴 덩어리를 찾으십시오. 종종 질 마개가 뚜렷할 수 있지만 불분명한 경우 핀셋을 사용하여 질 입구를 부드럽게 조사하십시오. 절연을 위해 더 명백한 플러그만 고려하십시오. 그림 2C를 참조하십시오.
      참고: 잠재적인 임신을 놓치지 않도록 가능한 한 일찍 아침 일찍 질 마개를 확인하는 것이 중요합니다. 플러그는 12시간 후에 떨어지거나 녹을 수 있습니다.
      알림: 플러그가 관찰되더라도 암컷 쥐가 임신할 것이라는 보장은 없습니다. 부분적으로 플러그가 관찰되거나 전혀 관찰되지 않지만 암컷 마우스의 질 입구 근처에 발적이 있는 경우 플러그가 붙을 가능성이 적으므로 이러한 암컷을 격리로 간주하지 마십시오. 교미 후 임신 가능성은 쥐 균주에 따라 다르며 교미 중 발정 주기의 단계에 따라 다릅니다(그림 2).
7. 질 플러그가 관찰되면 하루를 기록하십시오. 질 마개가 관찰된 같은 날 정오는 E0.5로 간주됩니다. 번식 케이지에서 암컷 마우스를 분리하고 원하는 위형성 단계에 따라 배아를 분리합니다.
   참고: 이 방법은 짝짓기를 위한 정확한 타이밍을 제공하지 않습니다. 일반적으로 짝짓기는 전날 밤 자정 경에 발생하는 것으로 가정합니다. 결과적으로, 배아는 질 마개가 관찰된 날 정오까지 반나절(E0.5)이 된 것으로 간주됩니다.

2. 위축(gastrulation) 중 마우스 배아의 분리

1. 배아 분리를 시작하기 전에 필요한 모든 시약과 장비를 준비하십시오.
   1. 70% 에탄올로 해당 부위를 철저히 청소하십시오. 모든 해부 도구(집게 및 가위)가 세척되고 멸균되었는지 확인하십시오. 멸균 5mL의 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)/10% 소 태아 혈청(FBS) 및 20mL DPBS^-/- 를 구하여 얼음에 넣습니다.
   2. 총체적 발달 표현형을 돕기 위해 투과광 스테이지와 카메라가 있는 실체현미경을 사용하여 모든 분리를 수행합니다.
2. 임신한 쥐댐을 안락사시키고 즉시 격리를 시작한다.
   1. 분당 케이지 부피의 20%를 변위하도록 조정된 CO₂ 유속과 함께 임신 댐을 CO₂ 챔버에 놓습니다. 쥐를 면밀히 관찰하고 호흡 움직임이 없는 것을 관찰하여 죽음을 확인합니다.
   2. 호흡 움직임이 없는 후 추가로 2분 동안 CO₂ 흐름을 유지합니다. 자궁 경부 탈구를 수행하여 안락사를 확인합니다.
   3. 단단하고 평평한 표면에 정상적인 서있는 자세로 마우스를 배치하십시오. 그런 다음 한 손의 엄지와 첫 번째 손가락을 두개골 기저부의 목 뒤쪽에 대고 앞뒤로 밀면서 다른 손으로 꼬리 받침대를 잡고 뒤로 당깁니다.
   4. 경추의 분리를 느껴 탈구의 효과를 확인합니다. 척수가 절단되면 후두과두와 첫 번째 경추 사이에 2-4mm의 공간이 만져집니다.
      참고: 세포 생존력에 영향을 미치므로 한 번에 여러 개의 임신한 댐을 안락사시키지 마십시오. 이소플루오란은 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 또는 이에 상응하는 기관에서 승인한 경우 대체 마취제로 사용할 수 있습니다.
3. 임신한 댐을 등에 대고 질 입구 근처를 에탄올로 소독합니다.
   1. 해부 가위와 핀셋을 사용하여 질 입구 근처의 피부 주름을 들어 올리고 작은 V 자형으로 절단하여 임신 댐의 자궁을 천천히 드러냅니다(그림 3 [노란색 화살표]).
   2. 임신한 자궁 뿔의 한쪽 끝을 핀셋으로 잡고 따라 잘라 자궁 경부를 제거하십시오. 얼음 위에 DPBS^-/- 가 들어 있는 10cm 페트리 접시에 자궁 뿔을 넣습니다(그림 3).
      참고: 배아 분리 단계에 따라 자궁은 더 작거나 더 큰 착상 부위(즉, 끈에 있는 '진주')와 유사합니다.
4. 해부 가위와 핀셋을 사용하여 내부의 부종이 있는 각 이식 부위('진주')를 자르고 얼음 위에 6cm 페트리 접시에 신선한 DPBS^-/- 에 넣습니다(그림 3).
   참고: 평균적으로 임신한 댐에는 약 6-8개의 배아가 이식됩니다.
5. 하나의 이식 부위를 가져와서 실체현미경 스테이지 위에 있는 새로운 6cm 페트리 접시에 놓고 그 위에 500μL의 DPBS^-/- 를 추가합니다. 현미경과 광원의 초점을 조정합니다(그림 3).
   알림: 이식 부위의 크기에 따라 DPBS의 양이 달라질 수 있습니다. 목표는 이식 부위가 물에 잠길 수 있을 만큼 충분한 DPBS를 확보하는 것입니다.
6. 끝이 가는 박리 핀셋을 사용하여 착상 부위에서 자궁 근육을 제거합니다. 한 손에 핀셋 한 세트를 들고 착상 부위를 누르고 다른 손으로 다른 한 쌍의 겸자를 자궁 뿔에서 잘라낸 착상 부위 끝에 천천히 삽입하여 십막골 부종을 천천히 드러냅니다(그림 3).
   알림: 자궁 표면을 너무 세게 당기거나 잡아당기면 자궁 부종이 파열되거나 배아가 용해될 수 있습니다.
7. 좌엽 부종이 분리된 후 배아를 공개합니다.
   1. 한 쌍의 겸자로 경막 종윤의 항 중성 부종을 잡고 다른 쌍으로 중막 종단에서 경막 종윤의 약 1/4 크기(즉, 종종 경막 종윤의 더 뾰족한 끝)를 수평으로 절단합니다.
   2. 이제 양쪽 겸자를 사용하여 두엽 부종의 anti-mesometrial 끝에서 천천히 밀어내면 배아가 갓 절단된 mesometrial 끝에서 튀어나옵니다(그림 3).
      알림: 배아가 깨질 수 있으므로 부풀어 오른 부분을 찢지 마십시오. 필요한 경우 경부 팽윤의 중간 끝을 따라 더 작게 자릅니다.
8. 배아가 드러나면 부착된 배아 외 조직을 제거합니다.
   1. 두정엽 내배엽 주머니와 외태반 원뿔은 폭로 과정에서 배아에서 자발적으로 떨어질 수 있지만, 그렇지 않은 경우 한 쌍의 겸자를 사용하여 관련 모체와 함께 제거하십시오. 그런 다음 두 개의 집게를 사용하여 한 쌍으로 배아를 누르고 다른 쌍을 사용하여 배아에서 내장 난황낭을 천천히 벗겨냅니다.
   2. P20 피펫을 사용하여 접시에서 DPBS^-/- 가 10μL 이하인 난황낭을 얼음 위의 8스트립 중합효소 연쇄 반응(PCR) 튜브에 넣으면 당일 유전형 분석에 사용됩니다.
      참고: 난황낭 샘플이 임신한 댐의 조직으로 오염되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 오염은 배아의 잘못된 유전자형 할당으로 이어질 수 있습니다.
9. 갓 분리된 배아의 밝은 필드 사진을 찍어 새끼의 병기가 비슷한지 확인합니다. P200 피펫을 사용하여 50μL의 DMEM/10% FBS로 배아를 천천히 피펫팅하고 얼음 위의 1.5mL 튜브에 넣습니다. 유전자형이 확인될 때까지 배아를 얼음 위에 두십시오.
   참고: 배아는 명백한 분해 없이 3-4시간 동안 얼음 위에 보관되었지만, 세포 생존율의 감소가 발생할 수 있으므로 이 시간을 초과하지 마십시오. 그에 따라 배아와 유전형 분석 튜브에 라벨을 붙입니다. 명시야 이미지를 촬영하는 것은 배아 간의 총체적인 표현형 차이를 식별하고 주석을 달기 위해 권장됩니다.
10. 남아 있는 모든 좌엽 부종에 대해 이 단계를 반복합니다. 모든 분리 도구를 청소하고 모든 분리에 새 플라스틱을 사용하여 이전 분리로 인한 오염이 없도록 합니다.
    알림: 해부 절차는 임신한 댐에서 이식 부위를 채취하는 순간부터 1시간으로 제한되어야 합니다.
11. 당일 유전형 분석 단계로 이동하기 전에 다음 임신 댐에서 배아를 분리합니다(여러 개의 동기화된 임신이 확인된 경우).

3. 당일 유전형 분석(그림 4)

1. 각 내장 난황낭을 8-strip PCR 튜브에서 분해합니다. P20 피펫을 사용하여 19.3μL의 PCR 템플릿 DNA 용해 완충액과 0.7μL의 0.2μg/mL Proteinase K를 각 난황낭 샘플에 추가합니다.
2. 10초 동안 샘플을 소용돌이치게 하고 10초 동안 1,000 x g 에서 스트립 어댑터가 있는 미니 원심분리기를 사용하여 샘플을 튜브 바닥에 배치하기 위해 회전합니다. 8-스트립 PCR 튜브를 85°C 열 블록에 45분 동안 넣고 5분마다 5초 동안 와류를 넣습니다.
   참고: 45분 내에 세포 용해를 최대화하기 위해 분해하는 동안 샘플을 소용돌이치게 하는 것이 중요합니다.
3. 45분 후 스트립 어댑터가 있는 미니 원심분리기를 사용하여 1,000 x g 에서 10초 동안 튜브 스트립을 회전시키고 원하는 유전자 식별을 위해 PCR을 진행합니다. 참고로, Cre-lox 시스템에 대한 샘플 프로토콜이 제공됩니다. 다음은 Cre 유전형 분석을 위한 PCR 조건의 예입니다. 표적 Cre 부위의 5' 및 3' 영역을 증폭하기 위한 프라이머를 설계합니다.
4. Cre 유전형 분석을 위한 PCR 반응을 수행하려면 10μL의 Taq DNA 중합효소 혼합물, 0.5μL의 0.5μL 순방향 Cre 프라이머, 0.5μL의 0.5μM 역Cre 프라이머, 5μL의 PCR 인증 물 및 4μL의 난황낭 게놈 DNA를 포함하는 각 난황낭에 대해 8-strip PCR 튜브당 PCR 마스터 믹스를 준비합니다.
   참고: 쥐 꼬리 유전형 분석에 최적화된 프로토콜을 사용하는 경우 더 깨끗한 결과를 위해 일반적으로 사용되는 DNA 양의 두 배를 추가하십시오.
5. PCR 마스터 믹스가 만들어지면 PCR 열 주기 증폭 프로그램을 실행합니다. Cre 유전형 분석의 경우 주기는 (1) 3분 동안 95°C, (2) 30초 동안 95°C, (3) 30초 동안 55°C, (4) 30초 동안 72°C, 34주기 동안 2-4단계 반복, (5) 10분 동안 72°C, (6) 4°C 유지입니다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 실행하여 유전형 분석 결론을 도출합니다.
   참고: 유전자 식별을 위해 둘 이상의 PCR이 필요한 경우 PCR 반응을 동시에 실행하여 타이밍을 최적화하십시오. 프로세스를 신속하게 진행하려면 실험 당일 하루 전에 아가로스 겔을 준비하고 4°C에서 밤새 보관합니다. 명확한 유전자형이 없는 샘플은 고려하지 마십시오. 샘플에 대해 유전자형과 발달 단계를 모두 고려해야 하는데, 새끼 배설물이 서로 다른 위형성 단계에 있을 수 있고 잠재적으로 결과를 왜곡할 수 있기 때문입니다. LoxP 대립유전자의 유전형 분석을 수행할 때 겔에서 예상되는 PCR 밴드는 사용된 Cre-driver에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, Cre 드라이버가 내장 난황낭에서 발현되는 경우, Loxp 띠는 Cre-음성(Cre-)에 비해 Cre-양성(Cre+) 배아에서 이동된 것처럼 보입니다. 그러나, Cre가 내장 난황낭에서 발현되지 않는 경우, Loxp 띠의 크기는 Cre+ 및 Cre- 배아에서 동일한 크기가 될 것입니다(즉, Loxp 대립유전자는 난황낭 계통에서 플록스화되지 않을 것입니다). 하나의 Cre+ 대립유전자와 2개의 Loxp 대립유전자를 가진 배아는 조건부 KO 배아로 간주됩니다. 그러나 플록시드 유전자의 결실을 확인하기 위해서는 유전형 분석 프로토콜을 반복하거나 플록시드 유전자의 mRNA 수준의 qPCR 분석을 통해 Cre 드라이버를 발현하는 세포에서 유전자의 knockout을 확인하는 것이 좋습니다(그림 4D, E).
6. 남은 분해된 난황낭 샘플은 장기 보관을 위해 -20°C 냉동고에 보관합니다.

4. 배아의 세포 해리와 세포 생존력

1. 유전자형이 확인되면 P200 피펫과 50 μL의 DMEM/10% FBS 피펫팅을 사용합니다. 동일한 유전자형을 가진 배아를 새로운 1.5mL 튜브에 풀링하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
   참고: 그룹당 배아가 5개 이상(E7-E7.5) 또는 3개(E7.75-E8) 이상인 경우 세포 수와 생존력이 크게 감소하므로 실험을 진행하지 마십시오.
2. 유전자형에 따라 배아를 합친 후 배아가 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 50μL의 DPBS^-/-를 첨가하여 합쳐진 배아를 세척한 다음 배아가 가라앉을 때까지 기다렸다가 튜브에서 배아를 제거하지 않고 가능한 한 많은 DPBS^-/- 를 제거합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
   참고: 1.5mL 튜브를 광원이나 창문 쪽으로 들고 있으면 배아가 튜브 바닥에 가라앉는 것을 더 쉽게 볼 수 있습니다.
3. 합폐된 배아에 100μL의 트립신을 추가하고 37°C에서 열 블록에서 5분 동안 배양합니다. 30초마다 1.5mL 튜브를 부드럽게 튕겨 세포가 해리되도록 합니다.
   알림: 트립신화 과정에서 와류나 피펫을 사용하면 세포가 손상될 수 있으므로 사용하지 마십시오. 5개 이상의 배아(E7-E7.5) 또는 3개의 배아(E7.75-E8)가 합쳐진 경우 동일한 양의 트립신(배아 1개당 ~20μL)이 있는 다른 튜브에서 트립신 분해를 수행합니다. 배아당 ~20μL의 트립신(E6.5-E7.5), 배아당 35μL(E7.75), 배아(E8)에 40μL를 사용합니다.
4. 5분 후 300μL의 DMEM/10% FBS로 트립신을 중화합니다. 합친 배아를 실온(RT)에서 4분 동안 100 x g 으로 원심분리합니다. 원심분리 후 모든 샘플에 대해 작은 펠릿이 나타납니다. 펠릿을 40μL의 DMEM/10% FBS에 재현탁시키고 얼음 위에 놓습니다.
   참고: 펠릿의 크기는 풀링된 배아의 수에 따라 달라집니다. 펠릿이 보이지 않을 수 있지만 다음 단계를 진행하십시오. 트립신을 중화하는 데 필요한 DMEM/10% FBS의 양은 첨가된 트립신의 양에 따라 다릅니다. 트립신 양에 DMEM/10%의 3배를 추가합니다.
5. 자동 세포 카운터를 사용하여 재현탁 세포(40 μL)의 농도를 측정합니다. 새 1.5mL 튜브에서 5μL의 세포와 5μL의 트리판 블루를 혼합합니다. 피펫을 철저히 혼합하고 슬라이드에 피펫팅하여 세포 수와 세포 생존율을 측정합니다. 세포의 최적 농도는 700-1200 cells/μL이며 세포 생존율은 90% 이상입니다.
   참고: 농도가 200 cells/μL 미만이고 생존율이 50% 미만인 경우 실험을 계속하지 마십시오. 세포 농도가 너무 높으면 세포 현탁액을 희석하고 세포를 다시 계수하십시오. 세포 덩어리가 관찰되면 세포 여과기를 사용하여 단일 세포 현탁액을 확인하십시오.
6. 미세유체 칩을 사용하여 단일 셀 분할을 진행하고 미세유체 칩 제조업체¹¹의 프로토콜을 따릅니다.

5. 핵 분리 마우스 배아(E8 이후의 더 큰 배아 시점에 대한 옵션)

1. 신선한 용해물을 준비하고 표 1에 요약된 완충액을 세척하고 얼음 위에 놓습니다.
   참고: 핵 분리는 신선 또는 냉동 샘플에서 수행할 수 있습니다. 샘플이 얼면 얼음에서 2-5분 동안 해동합니다.
2. 실험을 시작하기 전에 모든 유전자형을 확인하고 명확한 유전자형을 가진 배아만 풀링합니다.
3. P200 피펫을 사용하여 돌연변이 그룹당 최소 3개의 배아를 목표로 1.5mL 튜브의 통합 배아에 50μL의 핵 용해 완충액을 추가합니다. 용해 완충액을 사용하여 샘플을 얼음 위에 5분 동안 놓고 30초마다 소용돌이를 일으킵니다.
4. 배양 5분 후 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. P200 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 펠릿을 50μL의 세척 버퍼에 재현탁시킵니다. 다시 현탁한 후에는 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
5. 상층액을 제거하고 40μL의 DPBS^-/-에 재현탁합니다. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 새로운 1.5mL 튜브에 5μL의 핵과 5μL의 트리판 블루를 혼합합니다. 혼합물을 철저히 피펫팅하고 슬라이드에 로드하여 세포 수와 생존율을 측정합니다.
   알림: 핵막은 trypan blue까지 투과성이 있습니다. 따라서 분리된 핵 염색은 트리판 블루에 대해 양성입니다. 자동화된 세포 계수기에서 죽은 세포의 비율은 분리된 핵의 비율을 추정하는 데 사용됩니다(그림 5A).
6. 온전한 핵의 비율이 90%를 초과하는 경우(핵의 최소 90%가 트리판 블루로 염색되고 둥근 모양과 탁한 측면을 나타낸다는 것을 의미, 그림 5B, C 참조), 미세유체 칩을 사용하고 미세유체 칩 제조업체¹¹의 프로토콜을 따릅니다.

6. 단일 세포 분할(cDNA 증폭 및 라이브러리 구축 포함)

1. 최적의 결과를 위해 미세유체 칩 제조업체의 프로토콜¹¹ 에 따라 단일 세포 RNA 염기서열 분석 프로토콜을 즉시 진행하십시오. 대상 셀 복구를 6000 셀 이상으로 설정합니다.

7. 시퀀싱

1. 라이브러리를 구축한 후에는 자동 전기영동 분석기를 사용하여 시료의 단편 크기 분포 및 농도를 측정합니다.
   참고: 최적의 단편 크기 분포는 300-1000bp 사이입니다.
2. 샘플을 시퀀서에 로드할 준비가 되었습니다. 서로 다른 샘플의 라이브러리를 함께 풀링합니다. pooled library의 최종 로딩 농도는 총 24 μL의 부피에서 750 pM입니다. 염기서열분석 제조업체의 프로토콜¹²에 따라 pooled library를 시약 카트리지에 로드합니다.
3. pair-end, dual indexing을 통해 원하는 염기서열분석 깊이에 따라 사전 조립된 flow cell과 cartridge에 로드된 라이브러리를 시퀀싱합니다. 미세유체 칩 제조업체가 설명한 프로토콜을 준수하는 시퀀싱 판독은¹¹: 읽기 1: 28 사이클, i7 인덱스: 10 사이클, i5 인덱스: 10 사이클 및 읽기 2: 90 사이클입니다. 염기서열 분석이 완료된 후 데이터는 생물정보학 분석을 거칩니다.
4. 생물정보학 방법을 사용하여 품질 관리를 수행합니다. 여기에는 염기서열 세포의 수, 세포당 판독 수, 세포당 매핑된 유전자 수 평가가 포함됩니다.
   참고: 최적의 결과를 위해 염기서열 분석된 세포의 수는 표적 세포의 80% 이상이어야 합니다. 세포당 판독 횟수는 30,000개 이상이고 검출된 유전자 수는 3000개 이상(마우스 샘플의 경우)인 것이 좋습니다.

결과

이 논문에서 고안된 방법론은 E6.5에서 E8까지의 단세포 오믹스를 위한 배아 샘플의 준비를 향상시키기 위해 특별히 고안되었습니다. 이 강력한 파이프라인은 동기화된 시간 임신, 배아 분리, 당일 유전형 분석, 세포 해리 및 세포 생존력 평가의 5가지 주요 단계로 구성됩니다(그림 1A). 제시된 데이터는 E7에서 E7.5까지의 시점에 초점을 맞추고 있지만, 절차에서 약간의 변형을 ?...

토론

이 논문에서는 gastrulating mouse embryos에서 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 얻기 위한 강력한 파이프라인을 제시하며, 특히 초기 개발에서 cell-fate 사양 메커니즘에 대한 연구를 용이하게 하도록 설계되었습니다. 이 방법은 성별 또는 체세포 유전자와 같은 유전자형이 필요한 배아의 분석을 최적화하여 위형성 분야의 중요한 격차를 해결합니다. 이 파이프라인은 유전적 돌연변이 마우스 모델을 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000