変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

要約

この論文は、原腸陥入マウス胚の単一細胞および核のシーケンシングのための高品質の単一細胞および核懸濁液のパイプラインを確立します。

要約

過去10年間で、シングルセルアプローチは、遺伝子発現ダイナミクス、細胞の不均一性、およびサンプル内の細胞状態を研究するためのゴールドスタンダードになりました。シングルセルが進歩する前は、発生初期に動的な細胞状況と急速な細胞遷移を捉える可能性は限られていました。この論文では、原腸陥入の開始と完了に対応する、胚のE6.5日目からE8までのマウス胚の単一細胞および核分析を実行するための堅牢なパイプラインを設計しました。胃腸形成は、器官形成に不可欠な中胚葉、外胚葉、内胚葉の3つの胚葉を確立する発達中の基本的なプロセスです。野生型の腹陥陥胚に適用されたシングルセルオミクスに関する広範な文献が入手可能です。しかし、変異胚のシングルセル解析はまだ少なく、多くの場合、FACSで選別された集団に限定されています。これは、ジェノタイピングの必要性、時限妊娠、妊娠ごとに目的の遺伝子型を持つ胚の数、およびこれらの段階での胚あたりの細胞数に関連する技術的な制約に一部起因しています。ここでは、これらの制限を克服するために設計された方法論を示します。この方法は、望ましい遺伝子型との同期妊娠の可能性を高めるために、繁殖と時限妊娠のガイドラインを確立します。胚単離プロセスの最適化ステップと同日ジェノタイピングプロトコル(3時間)を組み合わせることで、微小液滴ベースのシングルセルを同日に実施することができ、細胞の高い生存率と堅牢な結果が保証されます。この方法には、胚からの最適な核単離のためのガイドラインがさらに含まれています。したがって、これらのアプローチは、原腸陥入期における変異胚のシングルセルアプローチの実現可能性を高めます。この方法により、突然変異が原腸の細胞ランドスケープをどのように形成するかの解析が容易になると期待しています。

概要

生殖は、正常な発達に必要な基本的なプロセスです。この急速でダイナミックなプロセスは、多能性細胞が臓器の形成方法を定義する系統特異的な前駆体に移行するときに発生します。長年にわたり、原腸陥入は、中胚葉、外胚葉、内胚葉の3つの大部分が均質な集団の形成と定義されてきました。しかし、高解像度技術と新たな数の胚性幹細胞モデル^1,2により、初期の胚細胞層^3,4の間に前例のない不均一性が明らかになりました。このことは、原腸の異なる細胞集団を調節するメカニズムについては、まだ解明されていないことがたくさんあることを示唆しています。マウスの胚発生は、原腸陥入中の初期の細胞運命決定を研究するための最良のモデルの1つです^3,5。マウスの胃腸陥入は急速で、原腸陥入の全過程は胚の日E6.5からE8⁵までの48時間以内に起こります。

近年のシングルセル技術の進歩により、野生型マウスの胚発生の詳細なマッピングが可能になり、原腸陥入中の胚の細胞および分子ランドスケープの包括的な概観が得られました

プロトコル

このプロトコルおよび記載されているすべての動物実験は、正式に承認され、テンプル大学施設動物管理・使用委員会によって確立された施設ガイドラインに従っており、これはAssociation for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Careの国際ガイドラインに従っています。記載されているすべてのマウスは、C57/BL6Nバックグラウンド系統を使用していました。これらの研究では、動物の健康に関する懸念は観察されませんでした。

1.繁殖コロニーと時限妊娠

1. 膣栓の視覚化により、妊娠の時間を計ります。プラグの日の正午はE0.5と見なされます。
2. 欠けた広葉樹の寝具と紙の巣材を含む寝具材料を備えたケージ内のイエネズミ。
   1. 各ケージには、ネズミの餌、淡水、濃縮物(トンネルや巣材など)が含まれています。時間指定の繁殖中に毎日コロニー情報を追跡し、収集します。
   2. マウスの年齢、メスのマウスの妊娠数、オスのマウスが挿入したプラグの数、メスのマウスの発情期(図2)など、すべての情報を記録します。
      注:すでに1〜2回出産した女性は、将来の妊娠でより大きな同腹児サイズを提供します。
3. 時限妊娠を開始する前に、繁殖の1週間前に雄のマウ....

結果

この論文で設計された方法論は、E6.5からE8までのシングルセルオミクス用の胚サンプルの調製を強化することを特に意図しています。この堅牢なパイプラインは、同期した妊娠、胚の分離、即日ジェノタイピング、細胞解離、細胞生存率の評価という5つの主要なステップで構成されています(図1A)。提示されたデータはE7からE7.5までの時点に焦点を当てていますが、手?.......

ディスカッション

この論文では、原腸陥入マウス胚から高品質の単一細胞および核懸濁液を得るための堅牢なパイプラインが紹介されており、特に初期発生における細胞運命の特異性メカニズムの研究を促進するために設計されています。この方法は、性別や体細胞遺伝子などの遺伝子型を必要とする胚の解析を最適化することにより、原腸陥入の分野における重大なギャップに対処します。このパイプライ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000