突变全小鼠胚胎的单细胞 RNA 测序：从上胚层到原肠胚形成结束

摘要

本文建立了用于单细胞和细胞核测序的高质量原肠胚单细胞和细胞核悬液的管道。

摘要

在过去十年中，单细胞方法已成为研究样本中基因表达动力学、细胞异质性和细胞状态的金标准。在单细胞发展之前，在早期发育过程中捕捉动态细胞景观和快速细胞转变的可行性是有限的。在本文中，设计了一个强大的管道，用于对从胚胎第 E6.5 天到 E8 的小鼠胚胎进行单细胞和细胞核分析，对应于原肠胚形成的开始和完成。原肠胚形成是发育过程中的一个基本过程，它建立了三个生发层：中胚层、外胚层和内胚层，它们对器官发生至关重要。关于应用于野生型腹膜胚胎的单细胞组学的大量文献。然而，突变胚胎的单细胞分析仍然很少，并且通常仅限于 FACS 分选的群体。这部分是由于与基因分型需求、定时怀孕、每次怀孕具有所需基因型的胚胎数量以及这些阶段每个胚胎的细胞数量相关的技术限制。在这里，提出了一种旨在克服这些限制的方法。这种方法建立了育种和定时怀孕指南，以实现与所需基因型同步怀孕的更高机会。胚胎分离过程中的优化步骤与当天基因分型方案 （3 h） 相结合，允许在同一天进行基于微滴的单细胞检测，确保细胞的高活力和可靠的结果。该方法还包括从胚胎中最佳细胞核分离的指南。因此，这些方法增加了原肠胚形成阶段突变胚胎单细胞方法的可行性。我们预计这种方法将有助于分析突变如何塑造原肠胚的细胞景观。

引言

胃肠胚形成是正常发育所需的基本过程。当多能细胞转变为定义器官形成方式的谱系特异性前体时，就会发生这种快速而动态的过程。多年来，原肠胚形成长期以来被定义为三个基本同质的群体的形成：中胚层、外胚层和内胚层。然而，高分辨率技术和大量新兴的胚胎干细胞模型 ^1,2 揭示了早期胚层之间前所未有的异质性 ^3,4。这表明关于调节原肠不同细胞群的机制还有更多有待揭示。小鼠胚胎发育一直是研究原肠胚形成过程中早期细胞命运决策的最佳模型之一 ^3,5。小鼠的原肠胚形成是迅速的，因为原肠胚形成的整个过程发生在 48 小时内，从胚胎第 E6.5 天到 E8⁵。

单细胞技术的最新进展使野生型小鼠胚胎发育的详细图谱成为可能，提供了原肠胚形成过程中胚胎细胞和分子景观的全面概述 ^3,4,6,7,8

研究方案

该协议和所描述的所有动物实验均已正式批准，并符合天普大学机构动物护理和使用委员会制定的机构指南，该委员会遵循实验动物护理评估和认证协会国际指南。所有描述的小鼠均在 C57/BL6N 背景菌株上。在这些研究中未观察到动物健康问题。

1. 繁殖群和定时怀孕

1. 通过阴道栓的可视化来安排怀孕时间。插头当天的中午被认为是 E0.5。
2. 笼子里的家鼠，床上用品材料含有碎裂的硬木床上用品和纸巢材料。
   1. 每个笼子都包含老鼠食物、淡水和富集物品（例如，隧道和筑巢材料）。在定时繁殖期间每天跟踪和收集蜂群信息。
   2. 记录所有信息，例如小鼠的年龄、雌性小鼠的怀孕次数、雄性小鼠放置的插头数量以及雌性小鼠的发情阶段（图 2）。
      注意：已经生育 1-2 次的雌性将在未来的怀孕中产下更大的窝产仔数。
3. 在开始定时怀孕之前，在繁殖前 1 周将雄性小鼠单独关在笼子里。在繁殖开始的一周内，在笼子里为每只雄性引入至少 1 只雌性。
   注意：根据批准的动物方案，可能允许在繁殖笼中添加 2-3 只雌性，并且最好增加栓子的产生。
4. 设置至少 4 个繁殖三人组（2 只雌性小鼠对 1 只雄性），以增加跨笼同步怀孕的机会（即同一天多个插头）。这将增加在同一发育阶段分离的胚胎数量。
5. ....

讨论

本文提出了一种从原肠胚中获得高质量单细胞和细胞核悬浮液的稳健管道，专门用于促进早期发育中细胞命运规范机制的研究。该方法通过优化需要基因型（例如性别或体细胞基因）的胚胎的分析，解决了原肠胚形成领域的关键空白。通过利用基因突变小鼠模型并在全小鼠胚胎上采用高分辨率单细胞测序，该管道可以进一步增强对早期小鼠原肠菌基因表达谱的理解。该方法证明了通过 Cre 重组酶?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000