Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird eine Pipeline für hochwertige Einzelzell- und Zellkernsuspensionen von gastrulierenden Mausembryonen für die Sequenzierung von Einzelzellen und Zellkernen etabliert.

Zusammenfassung

In den letzten zehn Jahren haben sich Einzelzellansätze zum Goldstandard für die Untersuchung der Genexpressionsdynamik, der Zellheterogenität und des Zellzustands in Proben entwickelt. Vor der Weiterentwicklung von Einzelzellen war die Machbarkeit, die dynamische zelluläre Landschaft und schnelle Zellübergänge während der frühen Entwicklung zu erfassen, begrenzt. In dieser Arbeit wurde eine robuste Pipeline entwickelt, um Einzelzell- und Zellkernanalysen an Mausembryonen vom Embryonaltag E6,5 bis E8 durchzuführen, was dem Beginn und Abschluss der Gastrulation entspricht. Die Gastrulation ist ein grundlegender Prozess während der Entwicklung, bei dem die drei Keimblätter Mesoderm, Ektoderm und Endoderm etabliert werden, die für die Organogenese unerlässlich sind. Es gibt umfangreiche Literatur über Einzelzell-Omics, die auf perigastrulierende Wildtyp-Embryonen angewendet werden. Die Einzelzellanalyse mutierter Embryonen ist jedoch noch selten und oft auf FACS-sortierte Populationen beschränkt. Dies ist zum Teil auf die technischen Einschränkungen zurückzuführen, die mit der Notwendigkeit einer Genotypisierung, zeitlich begrenzten Schwangerschaften, der Anzahl der Embryonen mit den gewünschten Genotypen pro Schwangerschaft und der Anzahl der Zellen pro Embryo in diesen Stadien verbunden sind. Hier wird eine Methodik vorgestellt, die darauf ausgelegt ist, diese Einschränkungen zu überwinden. Diese Methode legt Zucht- und zeitlich begrenzte Trächtigkeitsrichtlinien fest, um eine höhere Chance auf synchronisierte Schwangerschaften mit den gewünschten Genotypen zu erreichen. Optimierungsschritte bei der Isolierung des Embryos in Verbindung mit einem Genotypisierungsprotokoll am selben Tag (3 Stunden) ermöglichen die Durchführung von Mikrotröpfchen-basierten Einzelzellen am selben Tag, wodurch die hohe Lebensfähigkeit der Zellen und robuste Ergebnisse gewährleistet werden. Diese Methode enthält auch Richtlinien für optimale Zellkernisolierungen aus Embryonen. Somit erhöhen diese Ansätze die Machbarkeit von Einzelzellansätzen von mutierten Embryonen im Gastrulationsstadium. Wir gehen davon aus, dass diese Methode die Analyse erleichtern wird, wie Mutationen die zelluläre Landschaft der Gastrula prägen.

Einleitung

Die Gastrulation ist ein grundlegender Prozess, der für die normale Entwicklung erforderlich ist. Dieser schnelle und dynamische Prozess tritt auf, wenn pluripotente Zellen in linienspezifische Vorläufer übergehen, die die Organbildung definieren. Jahrelang wurde Gastrulation lange Zeit als die Bildung von drei weitgehend homogenen Populationen definiert: Mesoderm, Ektoderm und Endoderm. Hochauflösende Technologien und eine neue Anzahl embryonaler Stammzellmodelle ^1,2 offenbaren jedoch eine noch nie dagewesene Heterogenität unter den frühen Keimblättern ^3,4.^....

Protokoll

Dieses Protokoll und alle beschriebenen Tierversuche wurden formell genehmigt und entsprechen den institutionellen Richtlinien, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Temple University festgelegt wurden, das den internationalen Richtlinien der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care folgt. Alle beschriebenen Mäuse befanden sich im Hintergrundstamm C57/BL6N. In diesen Studien wurden keine Bedenken hinsichtlich der Tiergesundheit festgestellt.

1. Brutkolonie und zeitlich begrenzte Schwangerschaften

1. Planen Sie die Schwangerschaften durch die Visualisierung eines Vaginal....

Diskussion

In dieser Arbeit wird eine robuste Pipeline zur Gewinnung hochwertiger Einzelzell- und Zellkernsuspensionen aus gastrulierenden Mausembryonen vorgestellt, die speziell entwickelt wurde, um Studien zu den Mechanismen der Zellschicksalsspezifikation in der frühen Entwicklung zu erleichtern. Diese Methode schließt eine entscheidende Lücke im Bereich der Gastrulation, indem sie die Analyse von Embryonen optimiert, die Genotypen wie Geschlecht oder somatische Gene erfordern. Durch die Verwendung genetischer Mutations-Mausm.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000