Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird eine Pipeline für hochwertige Einzelzell- und Zellkernsuspensionen von gastrulierenden Mausembryonen für die Sequenzierung von Einzelzellen und Zellkernen etabliert.

Zusammenfassung

In den letzten zehn Jahren haben sich Einzelzellansätze zum Goldstandard für die Untersuchung der Genexpressionsdynamik, der Zellheterogenität und des Zellzustands in Proben entwickelt. Vor der Weiterentwicklung von Einzelzellen war die Machbarkeit, die dynamische zelluläre Landschaft und schnelle Zellübergänge während der frühen Entwicklung zu erfassen, begrenzt. In dieser Arbeit wurde eine robuste Pipeline entwickelt, um Einzelzell- und Zellkernanalysen an Mausembryonen vom Embryonaltag E6,5 bis E8 durchzuführen, was dem Beginn und Abschluss der Gastrulation entspricht. Die Gastrulation ist ein grundlegender Prozess während der Entwicklung, bei dem die drei Keimblätter Mesoderm, Ektoderm und Endoderm etabliert werden, die für die Organogenese unerlässlich sind. Es gibt umfangreiche Literatur über Einzelzell-Omics, die auf perigastrulierende Wildtyp-Embryonen angewendet werden. Die Einzelzellanalyse mutierter Embryonen ist jedoch noch selten und oft auf FACS-sortierte Populationen beschränkt. Dies ist zum Teil auf die technischen Einschränkungen zurückzuführen, die mit der Notwendigkeit einer Genotypisierung, zeitlich begrenzten Schwangerschaften, der Anzahl der Embryonen mit den gewünschten Genotypen pro Schwangerschaft und der Anzahl der Zellen pro Embryo in diesen Stadien verbunden sind. Hier wird eine Methodik vorgestellt, die darauf ausgelegt ist, diese Einschränkungen zu überwinden. Diese Methode legt Zucht- und zeitlich begrenzte Trächtigkeitsrichtlinien fest, um eine höhere Chance auf synchronisierte Schwangerschaften mit den gewünschten Genotypen zu erreichen. Optimierungsschritte bei der Isolierung des Embryos in Verbindung mit einem Genotypisierungsprotokoll am selben Tag (3 Stunden) ermöglichen die Durchführung von Mikrotröpfchen-basierten Einzelzellen am selben Tag, wodurch die hohe Lebensfähigkeit der Zellen und robuste Ergebnisse gewährleistet werden. Diese Methode enthält auch Richtlinien für optimale Zellkernisolierungen aus Embryonen. Somit erhöhen diese Ansätze die Machbarkeit von Einzelzellansätzen von mutierten Embryonen im Gastrulationsstadium. Wir gehen davon aus, dass diese Methode die Analyse erleichtern wird, wie Mutationen die zelluläre Landschaft der Gastrula prägen.

Einleitung

Die Gastrulation ist ein grundlegender Prozess, der für die normale Entwicklung erforderlich ist. Dieser schnelle und dynamische Prozess tritt auf, wenn pluripotente Zellen in linienspezifische Vorläufer übergehen, die die Organbildung definieren. Jahrelang wurde Gastrulation lange Zeit als die Bildung von drei weitgehend homogenen Populationen definiert: Mesoderm, Ektoderm und Endoderm. Hochauflösende Technologien und eine neue Anzahl embryonaler Stammzellmodelle ^1,2 offenbaren jedoch eine noch nie dagewesene Heterogenität unter den frühen Keimblättern ^3,4. Dies deutet darauf hin, dass über die Mechanismen, die die unterschiedlichen Zellpopulationen der Gastrula regulieren, noch viel mehr geklärt werden muss. Die Embryonalentwicklung von Mäusen war eines der besten Modelle, um frühe Entscheidungen über das Schicksal von Zellen während der Gastrulation^{zu untersuchen 3,5}. Die Gastrulation bei Mäusen ist schnell, da der gesamte Prozess der Gastrulation innerhalb von 48 Stunden vom Embryonaltag E6.5 bis E8⁵ stattfindet.

Jüngste Fortschritte in der Einzelzelltechnologie haben eine detaillierte Kartierung der Embryonalentwicklung von Wildtyp-Mäusen ermöglicht und einen umfassenden Überblick über die zellulären und molekularen Landschaften von Embryonen während der Gastrulation gegeben 3,4,6,7,8. Die Analyse mutierter Embryonen in diesen Stadien ist jedoch weniger verbreitet und oft auf FACS-sortierte Populationen beschränkt ^9,10. Die spärliche Literatur spiegelt die technischen Herausforderungen wider, die mit der Manipulation und Einzelzellpräparation von gastrulierenden Embryonen verbunden sind, die eine Genotypisierung erfordern. Die Erfassung des dynamischen Prozesses der Gastrulation kann aufgrund seiner Schnelligkeit eine Herausforderung darstellen, insbesondere für das Verständnis mutierter Embryonen. Der Zeitpunkt und die Synchronisation von Schwangerschaften sind von entscheidender Bedeutung, da bereits geringe Unterschiede zwischen zeitlich begrenzten Schwangerschaften als Entwicklungsphänotyp fehlinterpretiert werden können, der aus dem mutierten Gen resultiert. Dies ist besonders wichtig, wenn das mutierte Gen den Prozess der Gastrulation beeinflusst^13,14. In dieser Studie werden Richtlinien aufgestellt, um synchronisierte Schwangerschaften durch Visualisierung von Vaginalplugs (d.h. der Masse der geronnenen Samenflüssigkeit, die sich nach der Paarung in der Vagina des Weibchens bildet) zu erhalten. Darüber hinaus wird eine Strategie entwickelt, um robuste Einzelzelldaten von mutierten gastrulierenden Embryonen von E6.5 bis E8 zu erhalten. Diese Strategie wurde entwickelt, um die Einschränkungen zu überwinden, die mit der geringen Anzahl von Embryonen mit dem gewünschten Genotyp pro Schwangerschaft und der Abnahme der Lebensfähigkeit durch das Einfrieren und Auftauen von Embryonen oder Zellen verbunden sind.

In dieser Arbeit wird eine optimierte Methodik von der Etablierung zeitgesteuerter Schwangerschaften über Vaginalplugs bis hin zur abschließenden Sequenzierung einzelner Zellen/Zellkerne beschrieben. Diese Methode erklärt, wie die Anzahl der synchronisierten Schwangerschaften erhöht werden kann, um eine höhere Anzahl von Embryonen mit dem gewünschten Genotyp zu erhalten, Zell-/Zellkernisolierungen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern, und ein Genotypisierungsprotokoll am selben Tag. Dieses Manuskript beschreibt auch den Prozess der Embryoisolierung zu verschiedenen Gastrulationszeitpunkten. Die Methodik trägt dazu bei, die Anzahl der endgültigen lebensfähigen embryonalen Zellen/Zellkerne für die Sequenzierung zu erhöhen und so qualitativ hochwertige Sequenzierungsdaten zu gewährleisten. Daher wird diese Methode die Türen für Einzelzellstudien an gastrulierenden Embryonen öffnen, die eine Genotypisierung erfordern.

Protokoll

Dieses Protokoll und alle beschriebenen Tierversuche wurden formell genehmigt und entsprechen den institutionellen Richtlinien, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Temple University festgelegt wurden, das den internationalen Richtlinien der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care folgt. Alle beschriebenen Mäuse befanden sich im Hintergrundstamm C57/BL6N. In diesen Studien wurden keine Bedenken hinsichtlich der Tiergesundheit festgestellt.

1. Brutkolonie und zeitlich begrenzte Schwangerschaften

1. Planen Sie die Schwangerschaften durch die Visualisierung eines Vaginalplugs. Der Mittag des Tages des Steckers gilt als E0,5.
2. Hausmäuse in Käfigen mit Einstreumaterial, das abgeplatzte Hartholzeinstreu und Nistmaterial aus Papier enthält.
   1. Jeder Käfig enthält Mäusefutter, frisches Wasser und ein Anreicherungsobjekt (z. B. Tunnel- und Nistmaterial). Verfolgen und sammeln Sie täglich Kolonieinformationen während der zeitgesteuerten Brut.
   2. Protokollieren Sie alle Informationen wie das Alter der Maus, die Anzahl der Schwangerschaften einer weiblichen Maus, die Anzahl der von einer männlichen Maus platzierten Plugs und das Stadium der Brunst (Abbildung 2) bei weiblichen Mäusen.
      HINWEIS: Hündinnen, die bereits 1-2 Mal geboren haben, werden bei zukünftigen Schwangerschaften größere Würfe zur Welt bringen.
3. Bevor Sie mit einer zeitgesteuerten Trächtigkeit beginnen, halten Sie das Männchen 1 Woche vor der Zucht allein in einem Käfig. Setzen Sie in der Woche des Zuchtbeginns mindestens 1 Weibchen pro Männchen in den Käfig ein.
   HINWEIS: Abhängig vom genehmigten Tierprotokoll kann das Hinzufügen von 2-3 weiblichen Hündinnen in einen Zuchtkäfig erlaubt sein und wird bevorzugt, um die Pfropfenbildung zu erhöhen.
4. Richten Sie mindestens 4 Zuchttrios ein (2 weibliche Mäuse bis 1 Männchen), um die Chancen auf synchronisierte Schwangerschaften in den Käfigen zu erhöhen (auch bekannt als mehrere Plugs am selben Tag). Dadurch erhöht sich die Anzahl der Embryonen, die im gleichen Entwicklungsstadium isoliert werden.
5. Arrangieren Sie die ideale Paarung am Nachmittag oder Abend vor 17 Uhr, und die Weibchen werden in den Käfig des Männchens gesetzt oder umgekehrt. Wenn die Brut nicht innerhalb von 4-5 Tagen stattfindet, sollten Sie in Betracht ziehen, den Paarungspartner jeden zweiten Tag zu wechseln.
   HINWEIS: Wenn Sie am nächsten Morgen nicht nach einem Vaginalpfropfen suchen können, trennen Sie das Zuchtpaar am Vorabend (z. B. am Wochenende/an Feiertagen).
6. Überprüfen Sie jeden Tag am frühen Morgen auf Vaginalpfropfen; vor 9 Uhr wird bevorzugt.
   1. Um nach Vaginalpfropfen zu suchen, heben Sie die weiblichen Mäuse vorsichtig an der Basis des Schwanzes an und beobachten Sie die Vaginalöffnung. Achte auf eine weiße oder cremefarbene gallertartige Masse. Oft kann der Scheidenpfropfen offensichtlich sein, aber wenn er unklar ist, nimm eine Pinzette und sondiere vorsichtig die Scheidenöffnung. Betrachten Sie nur die offensichtlicheren Stecker für die Isolierung. Siehe Abbildung 2C.
      HINWEIS: Es ist wichtig, so früh wie möglich am Morgen nach Vaginalpfropfen zu suchen, um eine mögliche Schwangerschaft nicht zu verpassen. Stopfen können nach 12 h herausfallen oder sich auflösen.
      HINWEIS: Selbst wenn ein Stöpsel beobachtet wird, ist dies keine Garantie dafür, dass die weibliche Maus schwanger ist. Wenn ein teilweiser oder kein Pfropfen beobachtet wird, aber eine Rötung in der Nähe der Vaginalöffnung der weiblichen Mäuse auftritt, sollten diese Weibchen nicht isoliert werden, da die Wahrscheinlichkeit, dass der Stöpsel klebt, geringer ist. Die Wahrscheinlichkeit einer Trächtigkeit nach der Paarung variiert je nach Mausstamm und hängt von der Phase des Brunstzyklus während der Paarung ab (Abbildung 2).
7. Sobald ein Vaginalplug beobachtet wird, notieren Sie den Tag. Der Mittag desselben Tages, an dem der Vaginalpfropfen beobachtet wird, gilt als E0,5. Trennen Sie die weiblichen Mäuse vom Zuchtkäfig und isolieren Sie die Embryonen je nach gewünschtem Stadium der Gastrulation.
   HINWEIS: Diese Methode bietet kein genaues Timing für die Steckung. Herkömmlicherweise wird davon ausgegangen, dass die Paarung um Mitternacht in der vorangegangenen Nacht stattfindet. Folglich gelten Embryonen am Mittag des Tages, an dem der Vaginalpfropfen beobachtet wird, als einen halben Tag alt (E0,5).

2. Isolierung von Mausembryonen während der Gastrulation

1. Bereiten Sie vor Beginn der Embryoisolierung alle erforderlichen Reagenzien und Geräte vor.
   1. Reinigen Sie den Bereich gründlich mit 70% Ethanol. Stellen Sie sicher, dass alle Sezierwerkzeuge (Pinzetten und Scheren) gewaschen und sterilisiert sind. 5 mL Modified Eagle Medium (DMEM)/10 % fötales Rinderserum (FBS) von Dulbecco und 20 mL DPBS^-/- erhalten und auf Eis legen.
   2. Führen Sie alle Isolierungen mit einem Stereomikroskop mit Durchlichttisch und Kamera durch, um die grobe Entwicklungsphänotypisierung zu unterstützen.
2. Euthanasieren Sie die trächtige Mausmutter und beginnen Sie sofort mit der Isolierung.
   1. Setzen Sie die trächtige Hündin in eine CO_{2 -} Kammer ein, wobei die CO_{2 -} Durchflussmenge so eingestellt ist, dass 20 % des Käfigvolumens pro Minute verdrängt werden. Überwachen Sie die Maus genau und bestätigen Sie den Tod, indem Sie das Fehlen von Atembewegungen beobachten.
   2. Halten Sie den CO_{2 -} Fluss für weitere 2 Minuten aufrecht, nachdem keine Atembewegungen aufgetreten sind. Bestätigen Sie die Euthanasie, indem Sie eine Gebärmutterhalsluxation durchführen.
   3. Positionieren Sie die Mäuse in normaler Standposition auf einer festen, ebenen Fläche. Drücken Sie dann mit dem Daumen und dem ersten Finger einer Hand gegen den Nacken an der Schädelbasis nach vorne und unten, während Sie mit der anderen Hand nach hinten ziehen und die Schwanzbasis halten.
   4. Überprüfen Sie die Wirksamkeit der Luxation, indem Sie die Trennung der Halswirbel spüren. Bei einer Durchtrennung des Rückenmarks ist zwischen den Hinterhauptkondylen und dem ersten Halswirbel ein Abstand von 2-4 mm tastbar.
      HINWEIS: Euthanasieren Sie nicht mehrere trächtige Muttertiere auf einmal, da dies die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt. Isofluoran kann als alternatives Anästhetikum verwendet werden, wenn es vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oder einem gleichwertigen Gremium genehmigt wurde.
3. Legen Sie die trächtige Hündin auf den Rücken und sterilisieren Sie den Bereich in der Nähe der Vaginalöffnung mit Ethanol.
   1. Heben Sie mit einer Präparierschere und einer Pinzette die Hautfalte in der Nähe der Vaginalöffnung an und machen Sie einen kleinen V-förmigen Schnitt, wodurch langsam die Gebärmutter der trächtigen Hündin zum Vorschein kommt (Abbildung 3 [gelber Pfeil]).
   2. Präpariere das Gebärmutterhorn der trächtigen Mutter, indem du ein Ende mit einer Pinzette festhältst und daran entlang schneidest, wobei du darauf achtest, den Gebärmutterhals zu entfernen. Legen Sie das Gebärmutterhorn in eine 10 cm große Petrischale, die DPBS^-/- auf Eis enthält (Abbildung 3).
      HINWEIS: Je nach Stadium der Embryoisolierung ähnelt die Gebärmutter kleineren oder größeren Implantationsstellen (d. h. "Perlen" an einer Schnur).
4. Schneiden Sie mit einer Präparierschere und einer Pinzette jede Implantationsstelle ("Perlen"), die die Dezidualschwellungen im Inneren enthält, und legen Sie sie in eine 6 cm große Petrischale auf Eis in ein frisches DPBS^-/- (Abbildung 3).
   HINWEIS: Eine durchschnittliche schwangere Hündin hat etwa 6-8 implantierte Embryonen.
5. Nehmen Sie eine Implantationsstelle und legen Sie sie auf eine neue 6 cm Petrischale auf dem Stereomikroskoptisch und fügen Sie 500 μL DPBS^-/- hinzu. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops und die Lichtquelle ein (Abbildung 3).
   HINWEIS: Abhängig von der Größe der Implantationsstelle kann die Menge an DPBS variieren. Ziel ist es, genügend DPBS zu haben, dass die Implantationsstelle untergetaucht ist.
6. Entfernen Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze den Gebärmuttermuskel von der Implantationsstelle. Halten Sie die Implantationsstelle mit einer Pinzette in einer Hand nach unten und führen Sie mit der anderen Hand langsam eine weitere Pinzette in das Ende der Implantationsstelle ein, die aus dem Gebärmutterhorn geschnitten wurde, so dass die Deziduaschwellung langsam sichtbar wird (Abbildung 3).
   HINWEIS: Ziehen oder zerren Sie nicht zu stark an der Gebärmutteroberfläche, da dies zum Platzen der Deziduschwellung oder sogar zur Lyse des Embryos führen kann.
7. Nachdem die deziduale Schwellung isoliert wurde, fahren Sie mit der Enthüllung des Embryos fort.
   1. Halten Sie das anti-mesometriale Ende der Dezidualschwellung mit einer Pinzette fest und machen Sie mit dem anderen Paar langsam einen horizontalen Schnitt, der etwa 1/4 der Größe der Dezidualschwellung vom mesometrialen Ende aus ist (d.h. oft das spitzere Ende der Dezidualschwellung).
   2. Drücken Sie nun mit beiden Pinzetten langsam aus dem anti-mesometrialen Ende der dezidualen Schwellung, und der Embryo springt aus dem frisch geschnittenen mesometrialen Ende heraus (Abbildung 3).
      HINWEIS: Reißen Sie nicht in die deziduale Schwellung, da dies den Embryo zerbricht. Machen Sie bei Bedarf kleinere Schnitte entlang des mesometrialen Endes der Dezidualschwellung.
8. Sobald der Embryo freigelegt ist, entfernen Sie alle anhaftenden extraembryonalen Gewebe.
   1. Der parietale endodermale Sack und der ektoplazentare Kegel können sich während des Enthüllungsprozesses spontan vom Embryo lösen, aber wenn nicht, verwenden Sie eine Pinzette und entfernen Sie sie zusammen mit dem zugehörigen mütterlichen Blut. Halten Sie dann den Embryo mit zwei Pinzetten mit einem Paar fest und schälen Sie langsam den viszeralen Dottersack vom Embryo mit dem anderen Set.
   2. Legen Sie den Dottersack mit nicht mehr als 10 μl DPBS^-/- aus der Schale mit einer P20-Pipette in ein 8-Streifen-Polymerase-Kettenreaktionsröhrchen (PCR) auf Eis, da dieses für die Genotypisierung am selben Tag verwendet wird.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Dottersackprobe nicht mit Gewebe der trächtigen Hündin kontaminiert ist. Eine Kontamination kann zu einer falschen Genotypzuordnung des Embryos führen.
9. Machen Sie Hellfeldfotos von frisch isolierten Embryonen, um sicherzustellen, dass das Staging der Wurfgeschwister ähnlich ist. Pipettieren Sie den Embryo mit einer P200-Pipette langsam mit 50 μl DMEM/10 % FBS hoch und legen Sie ihn in ein 1,5-ml-Röhrchen auf Eis. Lassen Sie die Embryonen auf Eis liegen, bis die Genotypen bestätigt sind.
   HINWEIS: Die Embryonen wurden 3-4 Stunden lang ohne offensichtlichen Abbau auf Eis gehalten, überschreiten Sie diese Zeit jedoch nicht, da es zu einer Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen kommt. Beschriften Sie die Embryonen und Genotypisierungsröhrchen entsprechend. Das Aufnehmen von Hellfeldbildern wird empfohlen, um grobe phänotypische Unterschiede zwischen Embryonen zu identifizieren und zu kommentieren.
10. Wiederholen Sie diese Schritte für alle verbleibenden Deziduschwellungen. Reinigen Sie alle Sezierwerkzeuge und verwenden Sie für jede Isolierung neue Kunststoffe, um sicherzustellen, dass keine Kontamination durch frühere Isolierungen erfolgt.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Dissektion auf 1 Stunde ab dem Zeitpunkt der Entnahme der Implantationsstelle von der trächtigen Hündin begrenzt ist.
11. Fahren Sie mit der Isolierung von Embryonen der nächsten trächtigen Hündin fort (wenn mehrere synchronisierte Schwangerschaften festgestellt wurden), bevor Sie mit dem Schritt der Genotypisierung am selben Tag fortfahren.

3. Genotypisierung am selben Tag (Abbildung 4)

1. Verdauen Sie jeden viszeralen Dottersack in einem 8-Streifen-PCR-Röhrchen. Geben Sie mit einer P20-Pipette 19,3 μl PCR-Template-DNA-Lysepuffer und 0,7 μl 0,2 μg/ml Proteinase K zu jeder Dottersackprobe.
2. Wirbeln Sie die Probe 10 s lang vor und drehen Sie sie nach unten, um die Proben mit einer Minizentrifuge und einem Streifenadapter bei 1.000 x g für 10 s am Boden des Röhrchens zu positionieren. Legen Sie das 8-Streifen-PCR-Röhrchen für 45 min in einen 85 °C heißen Heizblock und wirbeln Sie es alle 5 min 5 s lang ein.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Proben während der Verdauung zu wirbeln, um die Zelllyse in 45 Minuten zu maximieren.
3. Nach 45 Minuten wird der Röhrchenstreifen mit einer Minizentrifuge mit einem Streifenadapter bei 1.000 x g für 10 s nach unten geschleudert und mit der PCR zur gewünschten genetischen Identifizierung fortgefahren. Als Referenz wird ein Beispielprotokoll für ein Cre-lox-System zur Verfügung gestellt. Im Folgenden finden Sie ein Beispiel für PCR-Bedingungen für die Cre-Genotypisierung. Entwerfen Sie Primer, um die 5'- und 3'-Bereiche der anvisierten Cre-Stelle zu verstärken.
4. Um die PCR-Reaktion für die Cre-Genotypisierung durchzuführen, bereiten Sie einen PCR-Mastermix pro 8-Streifen-PCR-Röhrchen für jeden Dottersack vor, der 10 μl Taq-DNA-Polymerase-Mix, 0,5 μl 0,5 μM Vorwärts-Cre-Primer, 0,5 μl 0,5 μM Reverse-Cre-Primer, 5 μl PCR-zertifiziertes Wasser und 4 μl genomische Dottersack-DNA enthält.
   HINWEIS: Wenn Sie ein Protokoll verwenden, das für die Genotypisierung von Mausschwänzen optimiert wurde, fügen Sie die doppelte Menge an DNA hinzu, die normalerweise für sauberere Ergebnisse verwendet wird.
5. Sobald der PCR-Mastermix hergestellt wurde, führen Sie das PCR-Amplifikationsprogramm für den thermischen Zyklus durch. Für die Cre-Genotypisierung ist der Zyklus wie folgt: (1) 95 °C für 3 min, (2) 95 °C für 30 s, (3) 55 °C für 30 s, (4) 72 °C für 30 s, wiederholter Schritt 2-4 für 34 Zyklen, (5) 72 °C für 10 min, (6) 4 °C halten. Lassen Sie die PCR-Produkte auf einem 1%igen Agarosegel laufen, um Rückschlüsse auf die Genotypisierung zu ziehen.
   HINWEIS: Wenn mehr als eine PCR für die genetische Identifizierung erforderlich ist, führen Sie die PCR-Reaktionen gleichzeitig durch, um das Timing zu optimieren. Um den Prozess zu beschleunigen, bereiten Sie das Agarose-Gel am Tag des Experiments einen Tag im Voraus vor und lagern Sie es über Nacht bei 4 °C. Betrachten Sie keine Proben ohne eindeutige Genotypen. Berücksichtigen Sie bei den Proben sowohl den Genotyp als auch das Entwicklungsstadium, da sich Wurfgeschwister in unterschiedlichen Stadien der Gastrulation befinden und die Ergebnisse möglicherweise verzerren können. Bei der Durchführung der Genotypisierung der LoxP-Allele können die im Gel erwarteten PCR-Banden je nach verwendetem Cre-Treiber variieren. Wenn zum Beispiel der Cre-Treiber im viszeralen Dottersack exprimiert wird, erscheint die Loxp-Bande in den Cre-positiven (Cre+) Embryonen im Vergleich zu den Cre-negativen (Cre-) Embryonen verschoben. Wenn das Cre jedoch nicht im viszeralen Dottersack exprimiert wird, ist die Größe der Loxp-Bande in den Cre+- und Cre-Embryonen gleich groß (d.h. die Loxp-Allele werden in der Dottersack-Linie nicht gefloxt). Ein Embryo, der ein Cre+-Allel und zwei Loxp-Allele trägt, gilt als bedingter KO-Embryo. Um die Deletion des floxierten Gens zu bestätigen, wird jedoch empfohlen, eine Bestätigung des Knockouts des Gens an den Zellen durchzuführen, die den Cre-Treiber exprimieren, entweder durch Wiederholung des Genotypisierungsprotokolls oder durch qPCR-Analyse der mRNA-Spiegel des gefloxten Gens (Abbildung 4D, E).
6. Lagern Sie die restlichen Proben des verdauten Dottersacks zur Langzeitlagerung im -20 °C-Gefrierschrank.

4. Zelldissoziation von Embryonen und Zellviabilität

1. Sobald die Genotypen bestätigt wurden, nehmen Sie eine P200-Pipette und pipettieren Sie 50 μl DMEM/10 % FBS. Embryonen mit demselben Genotyp werden in ein neues 1,5-ml-Röhrchen gebüllt und das Röhrchen auf Eis gelegt.
   HINWEIS: Fahren Sie nicht mit dem Experiment fort, wenn nicht mindestens 5 Embryonen pro Gruppe (E7-E7.5) oder 3 (E7.75-E8) vorhanden sind, da die Zellzahl und die Lebensfähigkeit enorm abnehmen.
2. Nachdem die Embryonen auf der Grundlage von Genotypen gepoolt wurden, lassen Sie sie am Boden der Röhre sitzen. Waschen Sie die gepoolten Embryonen, indem Sie 50 μl DPBS^-/- hinzufügen, und warten Sie dann, bis sich die Embryonen beruhigt haben, bevor Sie so viel DPBS^-/- wie möglich entfernen, ohne die Embryonen aus dem Eileiter zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
   HINWEIS: Wenn Sie das 1,5-ml-Röhrchen an eine Lichtquelle oder an ein Fenster halten, ist es leichter zu sehen, wie sich die Embryonen am Boden des Röhrchens absetzen.
3. Geben Sie 100 μl Trypsin zu den gepoolten Embryonen und inkubieren Sie bei 37 °C in einem Wärmeblock für 5 Minuten. Bewegen Sie die 1,5-ml-Röhrchen alle 30 s vorsichtig, um die Disssoziation der Zellen zu unterstützen.
   HINWEIS: Verwenden Sie während des Trypsinisierungsprozesses keinen Wirbel oder eine Pipette, da dies die Zellen schädigt. Wenn mehr als 5 Embryonen (E7-E7.5) oder 3 Embryonen (E7.75-E8) gepoolt sind, führen Sie die Trypsinverdauung in einem anderen Röhrchen mit einer entsprechenden Menge Trypsin (~20 μL pro 1 Embryo) durch. Verwenden Sie ~20 μl Trypsin pro Embryo (E6.5-E7.5), 35 μl pro Embryo (E7.75) und 40 μl für den Embryo (E8).
4. Nach 5 min neutralisieren Sie das Trypsin mit 300 μl DMEM/10% FBS. Zentrifugieren Sie die gepoolten Embryonen bei 100 x g für 4 min bei Raumtemperatur (RT). Nach der Zentrifugation erscheint für alle Proben ein kleines Pellet. Die Pellets in 40 μl DMEM/10 % FBS resuspendieren und auf Eis legen.
   HINWEIS: Die Größe des Pellets hängt von der Anzahl der gepoolten Embryonen ab. Es ist möglich, dass das Pellet nicht sichtbar ist, aber fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Die Menge an DMEM/10% FBS, die zur Neutralisierung von Trypsin erforderlich ist, hängt von der Menge des zugesetzten Trypsins ab. Fügen Sie die 3-fache Menge an DMEM/10% zur Trypsinmenge hinzu.
5. Bestimmen Sie die Konzentration der resuspendierten Zellen (40 μL) mit einem automatisierten Zellzähler. Mischen Sie 5 μl Zellen mit 5 μl Trypanblau in einem neuen 1,5 ml-Röhrchen. Pipettieren Sie das Mischen gründlich und pipettieren Sie es auf einen Objektträger, um die Zellzahl und die Zellviabilität zu bestimmen. Die optimale Konzentration der Zellen liegt bei 700-1200 Zellen/μl, und die Zellviabilität beträgt 90 % oder mehr.
   HINWEIS: Wenn die Konzentration unter 200 Zellen/μl und die Lebensfähigkeit unter 50 % liegt, setzen Sie den Versuch nicht fort. Wenn die Zellkonzentration zu hoch ist, verdünnen Sie die Zellsuspension und zählen Sie die Zellen erneut. Wenn Zellklumpen beobachtet werden, verwenden Sie ein Zellsieb, um eine einzellige Suspension zu gewährleisten.
6. Fahren Sie mit der Einzelzellpartitionierung mit einem mikrofluidischen Chip fort und befolgen Sie das Protokoll der Hersteller von mikrofluidischen Chips¹¹.

5. Zellkernisolierung von Mausembryonen (Option für größere embryonale Zeitpunkte ab E8)

1. Bereiten Sie frische Lyse- und Waschpuffer vor, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, und legen Sie sie auf Eis.
   HINWEIS: Die Kernisolierung kann an frischen oder gefrorenen Proben durchgeführt werden. Wenn die Proben eingefroren sind, lassen Sie sie 2-5 Minuten auf Eis auftauen.
2. Bestätigen Sie vor Beginn des Experiments alle Genotypen und legen Sie nur Embryonen mit eindeutigen Genotypen zusammen.
3. Geben Sie mit einer P200-Pipette 50 μl Kernlysepuffer in ein 1,5-ml-Röhrchen in gepoolte Embryonen, wobei ein Minimum von 3 Embryonen pro Mutantengruppe angestrebt wird. Lassen Sie die Proben 5 Minuten lang mit Lysepuffer auf Eis ruhen und wirbeln Sie sie alle 30 s ein.
4. Nach 5 min Inkubation bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie mit einer P200-Pipette den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 50 μl Waschpuffer. Nach der Resuspendierung bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
5. Den Überstand entfernen und in 40 μl DPBS^-/- resuspendieren. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler. Mischen Sie 5 μl Zellkerne mit 5 μl Trypanblau in einem neuen 1,5 ml-Röhrchen. Pipettieren Sie die Mischung gründlich und laden Sie sie auf einen Objektträger, um die Zellzahl und Lebensfähigkeit zu bestimmen.
   HINWEIS: Die Kernmembran ist durchlässig für Trypanblau; Daher ist die isolierte Kernfärbung positiv für Trypanblau. In einem automatisierten Zellzähler wird der Prozentsatz toter Zellen verwendet, um den Prozentsatz der isolierten Zellkerne zu schätzen (Abbildung 5A).
6. Wenn der Prozentsatz der intakten Zellkerne mehr als 90 % beträgt (was bedeutet, dass mindestens 90 % der Zellkerne mit Trypanblau gefärbt sind und eine abgerundete Form und ein pralles Aussehen aufweisen; siehe Abbildung 5B, C), fahren Sie mit der Verwendung eines Mikrofluidik-Chips fort und befolgen Sie das Protokoll der Hersteller von Mikrofluidik-Chips¹¹.

6. Einzelzell-Partitionierung (einschließlich cDNA-Amplifikation und Bibliotheksaufbau)

1. Fahren Sie sofort mit dem Einzelzell-RNA-Sequenzierungsprotokoll fort, indem Sie dem Protokoll¹¹ des Mikrofluidik-Chipherstellers folgen, um die optimalsten Ergebnisse zu erzielen. Legen Sie die Wiederherstellung der Zielzelle auf 6000 Zellen oder höher fest.

7. Sequenzierung

1. Nachdem die Bibliotheken erstellt wurden, messen Sie die Fragmentgrößenverteilung und die Konzentrationen der Proben mit einem automatisierten Elektrophorese-Analysator.
   HINWEIS: Optimale Fragmentgrößenverteilungen liegen zwischen 300 und 1000 bp.
2. Die Samples sind bereit, in den Sequenzer geladen zu werden. Bündeln Sie Bibliotheken aus verschiedenen Stichproben. Die endgültige Beladungskonzentration der gepoolten Bibliotheken beträgt 750 pM bei einem Gesamtvolumen von 24 μl. Die gepoolten Bibliotheken werden gemäß^{dem Protokoll} 12 des Sequenzierherstellers in die Reagenzkartusche geladen.
3. Sequenzieren Sie die in die vormontierte Durchflusszelle und Kartusche geladenen Bibliotheken entsprechend der gewünschten Sequenzierungstiefe mit doppelter Indizierung am Paarende. Die Sequenzierungslesevorgänge, die dem von den Herstellern mikrofluidischer Chips skizzierten Protokoll entsprechen, lauten wie folgt:¹¹: Lesen Sie 1: 28 Zyklen, i7 Index: 10 Zyklen, i5 Index: 10 Zyklen und Lesen Sie 2: 90 Zyklen. Nach Abschluss der Sequenzierung werden die Daten einer bioinformatischen Analyse unterzogen.
4. Nutzen Sie bioinformatische Methoden, um Qualitätskontrollen durchzuführen. Dazu gehört die Bewertung der Anzahl der sequenzierten Zellen, der Reads pro Zelle und der Anzahl der pro Zelle kartierten Gene.
   HINWEIS: Für optimale Ergebnisse beträgt die Anzahl der sequenzierten Zellen mindestens 80 % der Zielzellen. Es wird empfohlen, dass die Anzahl der Reads pro Zelle mindestens 30.000 und die Anzahl der nachgewiesenen Gene mehr als 3000 beträgt (für Mausproben).

Ergebnisse

Die in dieser Arbeit entwickelte Methodik zielt speziell darauf ab, die Vorbereitung von Embryoproben für die Einzelzell-Omics von E6.5 bis E8 zu verbessern. Diese robuste Pipeline besteht aus fünf Hauptschritten: synchronisierte zeitgesteuerte Schwangerschaften, Embryoisolierung, Genotypisierung am selben Tag, Zelldissoziation und Beurteilung der Zellviabilität (Abbildung 1A). Während sich die vorgestellten Daten auf Zeitpunkte von E7 bis E7,5 konzentrieren, können sie auf Embryonen bi...

Diskussion

In dieser Arbeit wird eine robuste Pipeline zur Gewinnung hochwertiger Einzelzell- und Zellkernsuspensionen aus gastrulierenden Mausembryonen vorgestellt, die speziell entwickelt wurde, um Studien zu den Mechanismen der Zellschicksalsspezifikation in der frühen Entwicklung zu erleichtern. Diese Methode schließt eine entscheidende Lücke im Bereich der Gastrulation, indem sie die Analyse von Embryonen optimiert, die Genotypen wie Geschlecht oder somatische Gene erfordern. Durch die Verwendung genetischer Mutations-Mausm...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000