تنميط درجة الحموضة اللمعية في عضويات الجهاز الهضمي ثلاثية الأبعاد باستخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة

Summary

يصف هذا البروتوكول قياسات الأس الهيدروجيني في عضويات المعدة المشتقة من الأنسجة البشرية باستخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة للتوصيف الزماني المكاني لعلم وظائف الأعضاء داخل اللمعة.

Abstract

يتطلب التحسين والتوصيف التفصيلي لنماذج الجهاز الهضمي طرقا متقدمة لتحليل بيئاتها اللمعية. تقدم هذه الورقة طريقة قابلة للتكرار بدرجة عالية للقياس الدقيق للأس الهيدروجيني داخل لومينا من عضويات المعدة البشرية 3D عبر الأقطاب الكهربائية الدقيقة التي يتم التحكم فيها بواسطة micromanipulator. تتوفر الأقطاب الكهربائية الدقيقة ذات الأس الهيدروجيني تجاريا وتتكون من أطراف زجاجية مشطوفة يبلغ قطرها 25 ميكرومتر. بالنسبة للقياسات ، يتم تطوير القطب الدقيق للأس الهيدروجيني إلى تجويف عضو عضوي (>200 ميكرومتر) معلق في Matrigel ، بينما يستقر القطب المرجعي مغمورا في الوسط المحيط في لوحة الاستزراع.

باستخدام هذه الأقطاب الكهربائية الدقيقة لتحديد المواد العضوية المشتقة من جسم المعدة البشري ، نثبت أن درجة الحموضة اللمعية متسقة نسبيا داخل كل مزرعة بشكل جيد عند ~ 7.7 ± 0.037 وأنه يمكن الحصول على قياسات مستمرة لمدة لا تقل عن 15 دقيقة. في بعض الكائنات العضوية الأكبر حجما ، كشفت القياسات عن تدرج الأس الهيدروجيني بين السطح الظهاري والتجويف ، مما يشير إلى أنه يمكن تحقيق قياسات الأس الهيدروجيني في المواد العضوية بدقة مكانية عالية. في دراسة سابقة ، تم استخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة بنجاح لقياس تركيزات الأكسجين اللمعي في المواد العضوية ، مما يدل على تنوع هذه الطريقة في التحليلات العضوية. باختصار ، يصف هذا البروتوكول أداة مهمة للتوصيف الوظيفي للفضاء اللمعي المعقد داخل عضويات 3D.

Introduction

أحدثت الكائنات العضوية - الهياكل المصغرة متعددة الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية - ثورة في قدرتنا على دراسة علم وظائف الأعضاء البشرية وبدأت في استبدال النماذج الحيوانية ، حتى في الإعدادات التنظيمية¹. منذ الوصف الأولي للعضويات المعوية من قبل Sato et al. في عام 2009 ، أصبحت التكنولوجيا العضوية شائعة للغاية². تميز عدد كبير من الدراسات التركيب الخلوي ووظيفة النماذج العضوية بتفصيل كبير^3،4،5،6. ومع ذلك ، فإن الفضاء اللمعي لهذه الهياكل متعددة الخلايا 3D لا يزال غير محدد إلى حد كبير^....

Protocol

يتطلب هذا البروتوكول عضويات 3D لا يقل قطرها عن 200 ميكرومتر والتي لها تجويف مميز ومضمنة في مصفوفة اصطناعية خارج الخلية (ECM ، على سبيل المثال ، Matrigel). تم الحصول على أنسجة المعدة البشرية لاشتقاق الأعضاء بموافقة من مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة ولاية مونتانا وموافقة مستنيرة من المرضى الذين يخضعون للتنظير العلوي في Bozeman Health (البروتوكول # 2023-48-FCR ، إلى D.B.) أو كعينات معفاة من المعدة الكاملة أو تكميم المعدة من التبادل الوطني لأبحاث الأمراض (البروتوكول #DB062615-EX). يتم توفير معلومات حول الخطوط العضوية وأرقام المرور المستخدمة لهذه الدراسة في الجدول 1 ، ويتم سرد تكوين الوسائط في الجدول 2. الرجوع إلى البروتوكولات المنشورة سابق....

النتائج

إفراز الحمض هو وظيفة حاسمة للمعدة البشرية. ومع ذلك ، إلى أي مدى يمكن نمذجة إفراز الحمض في المواد العضوية لا يزال موضع نقاش^{6،32،33،34}. لذلك قمنا بتطوير البروتوكول المفصل أعلاه لقياس إنتاج الحمض بدقة في عضويات المعدة. والجدي.......

Discussion

أدى الوصول المحدود إلى الفضاء اللمعي للعضويات إلى تقييد فهمنا الشديد للديناميكيات الفسيولوجية لهذه البيئة المكروية. ستعمل أداة موثوقة للتحليلات الوظيفية لعلم وظائف الأعضاء اللمعي على توسيع قدرتنا على الاستفادة من المواد العضوية كما هو الحال في النماذج المختبرية لعلم وظائف الأعضا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 M KCl	Unisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229092B
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	CellTreat	229412
24 Well Tissue Culture Plate, Sterile	CellTreat	229124
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229093B
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
50 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	CellTreat	229422
70% Ethanol	BP82031GAL	BP82031GAL
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, Sterile	CellTreat	229483
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, Sterile	CellTreat	229037
Amphotericin B (Fungizone) Solution	HyClone Laboratories, Inc	SV30078.01
Biosafety Cabinet	Nuaire	NU-425-600	Class II Type A/B3
Bovine Serum Albumin	Fisher Bioreagents	BP1605-100
Cell recovery solution	Corning	354253	Cell dissociation solution
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)	Gibco	12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)	Fisher Scientific	15017CV
Fetal Bovine Serum	HyClone Laboratories, Inc	SH30088
G418 Sulfate	Corning	30-234-CR
Gentamycin sulfate	IBI Scientific	IB02030
HEPES, Free Acid	Cytiva	SH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3	HP	M03840-001
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144C-212
Incubator	Fisher Scientific	11676604
iPhone 12 camera	Apple
L-glutamine	Cytiva	SH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	34133
M 205 FA Stereomicroscope	Leica
Matrigel Membrane Matrix 354234	Corning	CB-40234
MC-1 UniMotor Controller	Unisense
Methyl red
MM33 Micromanipulator	Marzhauser Wetzlar	61-42-113-0000	Right handed
MS-15 Motorized Stage	Unisense
Nanoject-II	Drummond	3-000-204	nanoliter autoinjector
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15-140-148
pH Microelectrodes	Unisense	50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160	SensorTrace software is not compatible with Apple computers
Reference Electrode	Unisense	REF-RM-001652	SensorTrace software is not compatible with Apple computers
SB 431542	Tocris Bioscience	16-141-0
Smartphone Camera Adapter	Gosky
Specifications Laboratory Stand LS	Unisense	LS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol red	Gibco	25-200-056
UniAmp	Unisense	11632
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PK	Fisher	MCS-200
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	12-541-0
µSensor Calibration Kit	Unisense/ Mettler Toledo	51-305-070, 51-302-069	pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets