Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول قياسات الأس الهيدروجيني في عضويات المعدة المشتقة من الأنسجة البشرية باستخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة للتوصيف الزماني المكاني لعلم وظائف الأعضاء داخل اللمعة.

Abstract

يتطلب التحسين والتوصيف التفصيلي لنماذج الجهاز الهضمي طرقا متقدمة لتحليل بيئاتها اللمعية. تقدم هذه الورقة طريقة قابلة للتكرار بدرجة عالية للقياس الدقيق للأس الهيدروجيني داخل لومينا من عضويات المعدة البشرية 3D عبر الأقطاب الكهربائية الدقيقة التي يتم التحكم فيها بواسطة micromanipulator. تتوفر الأقطاب الكهربائية الدقيقة ذات الأس الهيدروجيني تجاريا وتتكون من أطراف زجاجية مشطوفة يبلغ قطرها 25 ميكرومتر. بالنسبة للقياسات ، يتم تطوير القطب الدقيق للأس الهيدروجيني إلى تجويف عضو عضوي (>200 ميكرومتر) معلق في Matrigel ، بينما يستقر القطب المرجعي مغمورا في الوسط المحيط في لوحة الاستزراع.

باستخدام هذه الأقطاب الكهربائية الدقيقة لتحديد المواد العضوية المشتقة من جسم المعدة البشري ، نثبت أن درجة الحموضة اللمعية متسقة نسبيا داخل كل مزرعة بشكل جيد عند ~ 7.7 ± 0.037 وأنه يمكن الحصول على قياسات مستمرة لمدة لا تقل عن 15 دقيقة. في بعض الكائنات العضوية الأكبر حجما ، كشفت القياسات عن تدرج الأس الهيدروجيني بين السطح الظهاري والتجويف ، مما يشير إلى أنه يمكن تحقيق قياسات الأس الهيدروجيني في المواد العضوية بدقة مكانية عالية. في دراسة سابقة ، تم استخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة بنجاح لقياس تركيزات الأكسجين اللمعي في المواد العضوية ، مما يدل على تنوع هذه الطريقة في التحليلات العضوية. باختصار ، يصف هذا البروتوكول أداة مهمة للتوصيف الوظيفي للفضاء اللمعي المعقد داخل عضويات 3D.

Introduction

أحدثت الكائنات العضوية - الهياكل المصغرة متعددة الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية - ثورة في قدرتنا على دراسة علم وظائف الأعضاء البشرية وبدأت في استبدال النماذج الحيوانية ، حتى في الإعدادات التنظيمية1. منذ الوصف الأولي للعضويات المعوية من قبل Sato et al. في عام 2009 ، أصبحت التكنولوجيا العضوية شائعة للغاية2. تميز عدد كبير من الدراسات التركيب الخلوي ووظيفة النماذج العضوية بتفصيل كبير3،4،5،6. ومع ذلك ، فإن الفضاء اللمعي لهذه الهياكل متعددة الخلايا 3D لا يزال غير محدد إلى حد كبير 7,8. التجويف هو التجويف المركزي للعضويات المشتقة من الأنسجة المخاطية المحاطة بالأجزاء القمية للخلايا الظهارية المستقطبة. نظرا لأن الإفراز الخلوي والامتصاص يحدثان في الغالب على السطح الظهاري القمي ، يتم التحكم في البيئة المكروية اللمعية للعضويات من خلال هذه العمليات الفسيولوجية الهامة. تظهر النماذج العضوية المستخدمة حاليا اختلافات في أنماط إشارات الخلية ، والجذع الكلي ، وتدرجات تركيز الأيض ، والظروف البيئية9. لذلك فإن فهم فسيولوجيا اللمعية العضوية ضروري للنمذجة الدقيقة لوظيفة الأعضاء وعلم الأمراض. لسوء الحظ ، فإن عدم إمكانية الوصول النسبي إلى التجويف يعيق بشكل كبير التحليلات الوظيفية لعلم وظائف الأعضاء اللمعي في 3Dorganoids 10.

تعد القدرة على فحص ملامح الأس الهيدروجيني مهمة بشكل خاص في المعدة ، والتي تشتهر بوجود تدرج بروتون شديد الانحدار في الجسم ، يتراوح من حوالي 1-3 في التجويف ، إلى شبه محايد عند الظهارة11،12،13. لا تزال هناك فجوة كبيرة في فهمنا للصيانة المجهرية لتدرج الأس الهيدروجيني في المعدة ، وأهمية النماذج العضوية في تلخيص هذا الوسط الديناميكي عبر طبقة مخاط المعدة. تضمنت الأساليب التقليدية لتحليل الأس الهيدروجيني العضوي استخدام الأصباغ الحساسة لدرجة الحموضة ، والتي يمكن أن تكون مؤشرات فلورية أو لونية. استخدم McCracken et al. حقنة لمعية من SNARF-5F-a مؤشر الأس الهيدروجيني النسبي - في المواد العضوية لتحليل انخفاض في درجة الحموضة اللمعية استجابة لعلاج الهيستامين. يمكن دمج هذه الأصباغ في وسائط الاستزراع ، مما يسمح بمراقبة الأس الهيدروجيني في الوقت الفعلي وغير الغازية. لا تتطلب الأصباغ الحساسة لدرجة الحموضة خطوات معايرة معقدة تساهم في ضعف الموثوقية والدقة مع القياسات فحسب ، بل تميل هذه الأصباغ أيضا إلى العمل ضمن نطاقات كشف محددة قد لا تكون ممثلة لنطاق الأس الهيدروجيني الكامل داخل البيئة المكروية محل الاهتمام14,15. ومع ذلك ، يمكن اعتبار استخدام أصباغ المؤشر للتجارب التأكيدية أمرا معقولا. كما تم تطوير أجهزة استشعار نانوية بصرية تستخدم نهج استشعار الأس الهيدروجيني القائمة على البصريات الفلورية. ومع ذلك ، تتطلب تقنيات الاستشعار هذه تصويرا مجهريا وهي أيضا عرضة للتبييض الضوئي والسمية الضوئية وكذلك تحيز التصوير16,17. بالإضافة إلى ذلك ، لدى Brooks et al. لوحات متعددة الآبار مطبوعة 3D تحتوي على أقطاب كهربائية دقيقة فوقها يمكن طلاء المواد العضوية18. ومع ذلك ، لا يسمح هذا النهج بإجراء قياسات مباشرة داخل التجويف العضوي.

يمكن أن تحقق قياسات الأس الهيدروجيني القائمة على الأقطاب الكهربائية دقة محسنة مقارنة بالطرق الأخرى ، فضلا عن توفير مراقبة الأس الهيدروجيني في الوقت الفعلي. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح أقطاب الأس الهيدروجيني المثبتة على أجهزة micromanipulators بدقة مكانية فائقة لقياسات الأس الهيدروجيني حيث يمكن التحكم بدقة في الموقع الدقيق لطرف القطب. وهذا يتيح أعلى قدر ممكن من المرونة والتكرار في تحليلات النماذج العضوية. الأقطاب الكهربائية المستخدمة هنا عبارة عن أقطاب كهربائية دقيقة ذات درجة حموضة مصغرة تعمل على أساس انتشار البروتونات من خلال زجاج الأس الهيدروجيني الانتقائي الذي يحيط بسلك بلاتيني رفيع. يتم توصيل القطب الدقيق بقطب مرجعي خارجي Ag-AgCl ثم يتم توصيله بمقياس ملي فولت عالي المقاومة. سيعكس الجهد الكهربي بين طرفي القطبين عند غمرهما في نفس المحلول الأس الهيدروجيني للمحلول19. تم استخدام أنظمة التنميط الدقيقة هذه في التحليل الأيضي للأغشية الحيوية20،21 ، والطحالب العوالق22 ، وعينات البلغم البشري23 ، وحتى في كرويات الخلايا الجذعية الوسيطة24. استخدم كل من مختبرنا و Murphy et al. سابقا أقطاب كهربائية دقيقة O2 يتم التحكم فيها بواسطة micromanipulator لتقييم تركيزات الأكسجين في المساحات اللمعية للعضويات. قام مورفي وآخرون بإقران هذه الطريقة بالنمذجة الرياضية للكشف عن تدرج الأكسجين داخل كروياتهم. تمكنت مجموعتنا من العثور على مستويات منخفضة من الأكسجين اللمعي في عضويات المعدة المشتقة من الأنسجة مقارنة بالمصفوفة المحيطةخارج الخلية 25.

هنا ، نقدم طريقة مفصلة للتنميط اليدوي للأقطاب الكهربائية الدقيقة لدرجة الحموضة اللمعية في عضويات الجهاز الهضمي الكروية التي ستمكن من تعزيز الفهم الفسيولوجي لبيئتها الدقيقة اللمعية المعقدة. نتوقع أن تضيف هذه التقنية بعدا جديدا لاستكشاف فسيولوجيا الأعضاء العضوية من خلال قياسات عالية الدقة في الوقت الفعلي لمستويات الأس الهيدروجيني على نطاق صغير. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول التالي بسهولة لتحليل O2 و N2O و H2 و NO و H2S والاختزال ودرجة الحرارة في أنواع مختلفة من النماذج العضوية. يعمل التنميط الفسيولوجي كأداة قيمة لتحسين ظروف الثقافة العضوية لمحاكاة البيئات الحية بشكل أفضل ، وبالتالي تعزيز أهمية وفائدة النماذج العضوية في البحوث الطبية الحيوية.

Protocol

يتطلب هذا البروتوكول عضويات 3D لا يقل قطرها عن 200 ميكرومتر والتي لها تجويف مميز ومضمنة في مصفوفة اصطناعية خارج الخلية (ECM ، على سبيل المثال ، Matrigel). تم الحصول على أنسجة المعدة البشرية لاشتقاق الأعضاء بموافقة من مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة ولاية مونتانا وموافقة مستنيرة من المرضى الذين يخضعون للتنظير العلوي في Bozeman Health (البروتوكول # 2023-48-FCR ، إلى D.B.) أو كعينات معفاة من المعدة الكاملة أو تكميم المعدة من التبادل الوطني لأبحاث الأمراض (البروتوكول #DB062615-EX). يتم توفير معلومات حول الخطوط العضوية وأرقام المرور المستخدمة لهذه الدراسة في الجدول 1 ، ويتم سرد تكوين الوسائط في الجدول 2. الرجوع إلى البروتوكولات المنشورة سابقا لتوليد وصيانة خطوط الجهاز الهضمي6،26،27.

1. إعداد عضويات المعدة البشرية لتحديد درجة الحموضة

  1. بدء والحفاظ على الثقافات العضوية في المعدة باستخدام البروتوكولات القياسية. الحفاظ على المواد العضوية على ألواح 24 بئرا في 500 ميكرولتر من وسائط التمدد لكل بئر (الجدول 2). أنشأ Passage خطوطا عضوية كل 5-7 أيام ، وانتقل إلى طبق ذو قاع زجاجي 35 مم استعدادا لتجارب تنميط الأس الهيدروجيني.
    ملاحظة: تستمد الثقافات العضوية لتجاربنا من مستحضرات الغدة المعدية ، والتي يتم الحصول عليها من الأنسجة البالغة كما هو موضح أعلاه. نستخدم طريقة هضم أنسجة كولاجيناز لعزل هذه الغدد قبل تعليقها في ECM ، كما هو موضح سابقا25،28،29.
  2. من مزارع الكائنات العضوية المتنامية بنشاط في الممرات 1-15 ، حدد الآبار التي تحتوي على ما لا يقل عن 100 عضوي (حوالي 2 مليون خلية) بأقطار تتراوح بين 200 و 700 ميكرومتر للنقل والتوسع على أطباق بتري 3.5 مم.
  3. أثناء تحضير المواد العضوية للطلاء (الخطوات 1.4-1.8) ، اترك قسمة (قسامة) المصفوفة خارج الخلية (ECM) تذوب على الجليد لمدة 45 دقيقة على الأقل. حافظ على ECM على الجليد طوال هذا البروتوكول لمنع الهلام. لوحات زراعة الخلايا المسخنة عن طريق وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 .
  4. قم بإزالة الوسائط من الآبار واحصد مزارع الأعضاء في المعدة عن طريق سحب PBS المثلج البارد على كل قطرة ECM وخدش الجل بطرف ماصة P1000. ماصة PBS مع شظايا ECM التي تحتوي على عضويات في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  5. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 200 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. ستكون شظايا ECM التي تحتوي على المواد العضوية مرئية كطبقة في أسفل الأنبوب. قم بشفط المادة الطافية وماصة 350 ميكرولتر من 0.25٪ trypsin-EDTA بعناية في كل أنبوب ، واخلطها برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. احتضان الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق.
  6. بعد الحضانة مع التربسين-EDTA ، أضف 600 ميكرولتر من DMEM المثلج البارد مع البنسلين / الستربتومايسين إلى كل أنبوب وماصة بقوة لأعلى ولأسفل على الأقل 40x. أجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. نضح الطاف. لإعداد مزارع لقياسات الأس الهيدروجيني ، أعد تعليق حبيبات الخلية في ECM السائل المثلج البارد بنسبة 1: 4 فولت / فولت من الحبيبات العضوية إلى ECM للطلاء.
  7. لكل عينة ، لوحة 40 ميكرولتر من ECM السائل تحتوي على عضويات / شظايا عضوية في خط أفقي رفيع على طول قطر طبق زجاجي القاع 35 مم.
    ملاحظة: يتيح توزيع الجل على الطبق في خط بدلا من قطرة مستديرة وصولا أسهل إلى المواد العضوية الفردية عن طريق تخفيف الثقافة.
  8. السماح للهلام بالبلمرة لمدة 15-30 دقيقة ؛ بعد ذلك ، أضف بعناية 2 مل من وسائط التمدد العضوية إلى اللوحة عن طريق السحب على طول حافة البئر لتجنب إزعاج الجل.
  9. استبدل الوسائط كل يومين. اترك 4-8 أيام لمدة لا تقل عن 10 عضويات لتنمو إلى قطر لا يقل عن 400 ميكرومتر.
  10. للمضي قدما في تجربة تنميط الأس الهيدروجيني ، تأكد من أن كل مزرعة تحتوي على 10 عضويات على الأقل تفي بالمعايير التالية: قطر >200 ميكرومتر ، مظهر صحي (القليل من المواد الداكنة المرئية داخل المواد العضوية التي لوحظت باستخدام مجهر برايتفيلد) ، وليس مكتظا بالمواد العضوية الأخرى.

2. تفريغ ومعايرة الأقطاب الكهربائية الدقيقة

ملاحظة: لتمكين القياسات المجهرية ، يتم استخدام قطب كهربائي مرجعي منفصل بالإضافة إلى القطب الدقيق لمستشعر الأس الهيدروجيني بدلا من استخدام تصميم متكامل (وبالتالي أكبر). يجب تخزين كل من القطب الكهربي الدقيق الأس الهيدروجيني والقطب المرجعي رطبا. لا تسمح بالتعرض للهواء لأكثر من 10 دقائق في المرة الواحدة. حدد حجم الطرف المناسب للتطبيق. هنا ، استخدمنا قطبا كهربائيا دقيقا لقياس الأس الهيدروجيني بقطر طرف مشطوف يبلغ 25 ميكرومتر.

  1. مع بقاء القطب الدقيق في أنبوب الحماية الخاص به ، افحص الطرف بصريا بحثا عن أي ضرر.
  2. قم بتوصيل القطب المرجعي بكابل قطب الأس الهيدروجيني عبر الموصل. بعد ذلك ، قم بتوصيل القطب الدقيق بمكبر الصوت ومكبر الصوت بجهاز كمبيوتر مؤرض باستخدام البرنامج عبر كابل USB (الشكل 1 أ).
  3. املأ أنبوبين مخروطيين سعة 50 مل 2/3 بإيثانول 70٪ ومنزوع الأيونات H2O (diH2O). ضع القطب الدقيق والقطب المرجعي في أنبوب diH2O ، مع التأكد من ظهور كلا الطرفين مغمورين على الأقل 1 سم في السائل.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الكئوس الطويلة لهذه الخطوة والخطوات المشابهة.
  4. اسمح للأقطاب الكهربائية بالتوازن لمدة ~ 10 دقائق.
    ملاحظة: يمكن أيضا إيقاف الإجراء مؤقتا في هذه الخطوة واستئنافه لاحقا حيث قد يتم تخزين الأقطاب الكهربائية في diH2O.
  5. أثناء توازن الأقطاب الكهربائية ، افتح البرنامج (الرمز الأحمر) على محطة عمل الكمبيوتر. ضمن علامة التبويب الإعدادات ، تأكد من تحديد المربع الموجود بجوار القطب الصغير ، مما يشير إلى أنه متصل بشكل صحيح ويتعرف عليه البرنامج. انقر على بدء التجربة في الجزء العلوي الأيسر من النافذة وأدخل اسم الملف والوجهة المطلوبين. في نافذة إعدادات معايرة المستشعر والتجربة ، انقر فوق مسح كل النقاط لإعداد البرنامج لمعايرة جديدة.
  6. املأ أنبوبين مخروطيين سعة 50 مل 2/3 بمخازن معايرة pH 4.01 و pH 9.21. جفف الأنبوب الواقي والقطب المرجعي برفق بمسح مختبر دقيق.
  7. بدءا من الأقطاب الكهربائية في المخزن المؤقت pH 4.01 ، أدخل 4.01 كقيمة pH المعروفة. بمجرد استقرار قراءة mV ، حدد إضافة نقطة. تأكد من أن الإشارة مستقرة عند ~ 380 مللي فولت. بعد إضافة النقطة ، ضع كلا القطبين مرة أخرى في diH2O للشطف ، ثم جفف مرة أخرى.
  8. كرر الخطوة السابقة مع المخزن المؤقت 9.21 وانقر فوق إضافة نقطة عندما تكون الإشارة مستقرة (~ 83 مللي فولت). تأكد من أن الأقطاب الكهربائية الدقيقة تستجيب خطيا بين الرقم الهيدروجيني 4.01 و 9.21 ؛ لذلك ، من الضروري فقط منحنى معايرة من نقطتين. تأكد من أن الخط الناتج بين هذه النقاط له ميل سالب من 50-70 mV / pH-unit. انقر فوق حفظ واستخدام المعايرة.
    ملاحظة: أنت الآن جاهز لبدء تسجيل القياسات30.

3. التنميط درجة الحموضة من عضويات المعدة البشرية

ملاحظة: يتم وصف البروتوكول التالي للمستخدم الأيمن. تنبيه: قم بتعطيل جميع خيارات توفير الطاقة على جهاز الكمبيوتر الخاص بك حيث سيتم تعطيل القياسات المستمرة إذا دخل الكمبيوتر في وضع السكون.

  1. قم بتجميع حامل حلقي بمشبك على الجانب الأيسر من المجهر المجسم لتثبيت القطب المرجعي. ضع مناورا دقيقا متصلا بحامل مختبر ثقيل على الجانب الأيمن من المجهر (الشكل 1 أ).
  2. قم بإزالة القطب الدقيق بعناية من علبة الحماية الخاصة به عن طريق وضعه بشكل مسطح على المقعد وسحب العلبة بحركة سريعة وسريعة.
    تنبيه: الأقطاب الكهربائية الدقيقة هشة بشكل لا يصدق ويجب توخي الحذر لضمان عدم ملامسة الطرف لمادة صلبة صلبة. للحصول على أفضل النتائج ، قم بإجراء قياسات على سطح طاولة قوي خال من المعدات التي قد تسبب اهتزاز المقعد أو الحركة غير المرغوب فيها للأقطاب الكهربائية.
  3. قم بتركيب القطب الدقيق على مناور دقيق ورتب المجسمة والمناور الدقيق بطريقة قد يتقدم فيها القطب الدقيق نحو طبق الاستزراع دون ضرب الهدف أو أجزاء أخرى من المجهر.
  4. ضع طبق الاستزراع الذي يحتوي على المواد العضوية للحصول على تصور كاف للعضو الأول الذي سيتم تحديده (الشكل 1 ب).
  5. ثبت القطب المرجعي برفق بالمشبك الموجود على الحامل الحلقي على يسار المجسم. ضع القطب المرجعي بحيث يستقر في الوسط المحيط ب ECM. احرص على التأكد من أنه لن يعطل المواد العضوية أثناء نقل المرحلة بين القياسات.
  6. بالنظر مباشرة إلى لوحة الثقافة (وليس في المجهر) ، قم بدفع طرف القطب الدقيق حتى يتم غمره بشكل كاف في الوسائط. ضمن علامة التبويب مسجل البيانات في البرنامج ، انقر فوق بداية زر (مثلث واحد يشير إلى اليمين) لبدء التسجيل. تأكد من تحديد خانة الاختيار معايرة على الجانب الأيمن من الشاشة.
    ملاحظة: اترك ~ 10 ثوان لكل قراءة حتى تستقر قبل التقدم إلى المنطقة التالية.
  7. قبل الدخول إلى ECM ، تأكد من أن طرف القطب مرئي تحت المجهر وأنه في وضع للتقدم خطيا نحو العضو الأول محل الاهتمام. تقدم ببطء القطب في الجل ، دون الاتصال مع أي عضويات. سجل ثلاث قراءات على الأقل لدرجة الحموضة واحسب المتوسط.
  8. ضع القطب الصغير بحيث يكون مستعدا للتقدم نحو أول عضو مهم على طول المحور عموديا على السطح. اسمح للقطب بعمل مسافة بادئة طفيفة على السطح الظهاري دون اختراق (الشكل 1C).
    ملاحظة: ستوفر هذه الخطوة أيضا نظرة ثاقبة حول ما إذا كان العضو العضوي سيبقى في مكانه أو ما إذا كان قد يتحرك بحرية أكبر في ECM.
  9. بحركة سريعة واحدة ، قم بدفع القطب الدقيق إلى العضو العضوي. إذا تحرك العضو العضوي حول القطب الصغير أو تحرك بعيدا ، فحاول زاوية مختلفة قليلا ، أو قم بنسخه احتياطيا مقابل عضو آخر أو الحافة البلاستيكية المحيطة بقاع الغطاء الزجاجي للطبق. قم بقياس الرقم الهيدروجيني اللمعي (ثلاث مرات فردية) ل 10 عضويات مختلفة لكل حالة تجريبية. عند الانتهاء من تسجيل القياسات ، انقر فوق مربع قف زر.
    تنبيه: قم بتقدير قطر العضو العضوي لتحديد مدى دفع القطب إلى التجويف العضوي ، مع الحرص على عدم اختراقه. لزيادة الدقة ، قم بقياس القطر باستخدام برنامج كاميرا المجهر ، إذا كان متاحا. ملاحظة: إذا أصبح طرف القطب الدقيق مغطى بشكل ملحوظ بالحطام بعد قياس واحد أو عدة قياسات ، اغسل القطب الدقيق في محلول تفكك الخلية ، PBS ، EtOH ، ثم diH2O قبل المتابعة.

4. التنميط الآلي (اختياري)

ملاحظة: يتطلب هذا الخيار معالجا دقيقا مثبتا على مرحلة محرك ميكانيكي ، والتي يتم التحكم فيها في النهاية بواسطة برنامج كمبيوتر عبر وحدة تحكم في المحرك31.

  1. افتح برنامج التنميط (الرمز البني) وابدأ تجربة جديدة ضمن علامة التبويب التنميط .
  2. ستتعرف إعدادات المحور z تلقائيا على المحرك عند توصيل جهاز المحرك بشكل صحيح.
    ملاحظة: لا يزال يتم التحكم في الحركة في الاتجاهين x وy يدويا باستخدام هذا الإعداد.
  3. حدد موقع علامة التبويب تفاعل ملف التعريف30. قبل البدء ، تأكد من أنه من الممكن الانتقال بسرعة إلى النظر إلى عدسة المجهر لضمان دخول العضو العضوي على المسافة المطلوبة. انتقل إلى إعدادات الملف الشخصي وقم بما يلي:
    1. أشر إلى أن مسافة البدء هي 0 ميكرومتر.
      تنبيه: إذا كانت القشرة الظهارية قاسية بشكل خاص على عنصر عضوي معين ، فقد يتم دفع العضو العضوي بعيدا أو تشويهه بدلا من اختراقه. إذا كان الدفع هو الحال ، فاستمر في دفع القطب ولكن لاحظ النقطة التي يحدث فيها الدخول ، حيث لا يمكن للبرنامج تسجيل ذلك تلقائيا.
    2. بالحكم على حجم العضو العضوي الذي يتم تحديده ، أشر إلى مسافة نهاية لا تزيد عن 3/4 طريق عبر القطر المقدر للعضوي.
      ملاحظة: تم تصميم هذه الخطوة بالذات لمنع تلف طرف القطب.
    3. حدد حجم الخطوة المطلوب - 100 ميكرومتر كما هو موضح في الشكل 2E. تأكد من أن الحد الأدنى لحجم الخطوة يتطابق مع حجم طرف القطب (على سبيل المثال ، 25 ميكرومتر لطرف قطب كهربائي 25 ميكرومتر pH-25).
    4. أشر إلى الوضع الآمن الذي سيعيد إليه المحرك طرف القطب بين الملفات الشخصية.
      ملاحظة: يجب أن يكون هذا ارتفاعا مريحا فوق العينة (خارج العضو العضوي) حيث يمكن تحريك المستشعر بأمان جانبيا في الاتجاهين x و y باستخدام المعالج الدقيق اليدوي. اترك زاوية المستشعر في إعدادها الافتراضي.
    5. للسماح للقطب بالتوازن ، أشر إلى 3 ثوان على الأقل ضمن الانتظار قبل القياس (القياسات).
    6. اضبط فترة (فترات) القياس على 1 ثانية على الأقل. سيتم حساب متوسط القياسات خلال هذه الفترة.
      ملاحظة: في حالة إجراء قياسات في بيئة عالية الضوضاء الكهربائية ، قد يكون من المفيد الإشارة إلى فترة أطول.
    7. اضبط التأخير بين (ق) إلى 1 ثانية على الأقل.
    8. قم بتعيين العدد المفضل من النسخ المتماثلة ليتم قياسها في كل عمق.
    9. ابدأ تسجيل القياسات بالضغط على زر ابدأ .

5. تنظيف الأقطاب الكهربائية

  1. ضع القطب المراد تنظيفه مرة أخرى في أنبوب الحماية الخاص به.
  2. اغسل الأقطاب الكهربائية باستخدام diH2O بعد القياسات.
  3. اغسل الأقطاب الكهربائية بنسبة 70٪ من الإيثانول لبضع دقائق.
  4. شطف الأقطاب الكهربائية مع العازلة درجة الحموضة 4.01.
  5. اشطف الأقطاب الكهربائية مرة أخرى باستخدام diH2O قبل متابعة القياسات.

6. تخزين الأقطاب الكهربائية

ملاحظة: يجب تخزين كلا القطبين في درجة حرارة الغرفة في مكان منخفض النشاط ، في مأمن من التلف العرضي.

  1. بعد استخدام القطب الدقيق للأس الهيدروجيني ، حركه بعناية أفقيا مرة أخرى في أنبوب الحماية الخاص به (انزلق على طول مقعد المختبر للحصول على دعم أفقي).
  2. أمسك القطب الدقيق في وضع مستقيم (الطرف مدبب لأعلى) ، املأ أنبوب الحماية برفق بالماء المعقم. قم بتوصيل أنبوب الحماية بالسدادة التي يأتي بها القطب. تأكد من سد أي ثقوب في أنبوب الحماية بشريط كهربائي. يخزن في صندوق مقاوم للكسر حتى الاستخدام التالي.
    ملاحظة: يوصى باستخدام الصندوق الأصلي الذي جاءت فيه الأقطاب الكهربائية لأنه سيحتوي على إدخالات واقية مصممة للحفاظ على الأقطاب الكهربائية في مكانها عند تخزينها.
  3. قم بتخزين القطب المرجعي في دورق أو أسطوانة مدرجة مملوءة بمحلول 3M KCl. قم بتغطية الدورق / الأسطوانة المدرجة ببارافيلم لمنع تبخر المحلول.
    ملاحظة: في حالة استخدام أسطوانة مدرجة، يوصى بتثبيتها على طاولة المختبر بشريط لاصق لمنع الحركة العرضية.

7. حقن الميثيل الأحمر (اختياري)

ملاحظة: أحمر الميثيل هو صبغة مؤشر لوني يمكن استخدامها للتحقق من صحة قياسات القطب الدقيق.

  1. ردم شعرية زجاجية سعة 2 ميكرولتر بزيت معدني معقم ، وقم بتحميلها على حاقن ذاتي nL يتم التحكم فيه بواسطة micromanipulator ، ثم املأه بمحلول يحتوي على 0.02٪ ميثيل أحمر و 150 مللي مول حمض الهيدروكلوريك.
    ملاحظة: يجب أن يظهر المحلول باللون الأحمر / الوردي أثناء وجوده في الشعيرات الدموية بسبب حموضة حمض الهيدروكلوريك.
  2. حقن المواد العضوية التي لا يقل قطرها عن 300 ميكرومتر مع 9.2 ميكرولتر من المحلول25.
  3. التقط صورا أو مقاطع فيديو باستخدام كاميرا مكيفة مع المجهر المجسم (الشكل 2G).

النتائج

إفراز الحمض هو وظيفة حاسمة للمعدة البشرية. ومع ذلك ، إلى أي مدى يمكن نمذجة إفراز الحمض في المواد العضوية لا يزال موضع نقاش6،32،33،34. لذلك قمنا بتطوير البروتوكول المفصل أعلاه لقياس إنتاج الحمض بدقة في عضويات المعدة. والجدي...

Discussion

أدى الوصول المحدود إلى الفضاء اللمعي للعضويات إلى تقييد فهمنا الشديد للديناميكيات الفسيولوجية لهذه البيئة المكروية. ستعمل أداة موثوقة للتحليلات الوظيفية لعلم وظائف الأعضاء اللمعي على توسيع قدرتنا على الاستفادة من المواد العضوية كما هو الحال في النماذج المختبرية لعلم وظائف الأعضا?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتورة إلين لاوشنور والدكتور ستيوارت وبينجيسو كيليتش على عملهم السابق ومساعدتهم في أجهزة الاستشعار الدقيقة O2 . آندي سيبريل للتدريب في الثقافة العضوية والمعالجة الدقيقة ؛ ليكسي بورشام للمساعدة في الثقافة العضوية ، وإعداد وسائل الإعلام ، وتسجيل البيانات ، والتنظيم ؛ والدكتورة سوسي كوهوت للحصول على المشورة العامة في الفيزيولوجيا الكهربية. نود أن نشكر الدكتورة هايدي سميث على مساعدتها في التصوير ونعترف بمركز مرفق التصوير الحيوي لهندسة الأغشية الحيوية في جامعة ولاية مونتانا ، والذي يدعمه تمويل من برنامج التصوير بالرنين المغناطيسي لمؤسسة العلوم الوطنية (2018562) ، وصندوق إم جي موردوك الخيري (202016116) ، ووزارة الدفاع الأمريكية (77369LSRIP &W911NF1910288) ، ومرفق مونتانا لتكنولوجيا النانو (عضو في NNCI مدعوم من NSF Grant ECCS-2025391).

شكر خاص لفريق Unisense بأكمله الذي جعل هذا العمل ممكنا ، وخاصة الدكتور أندرو سيرسكوس ، والدكتورة لورا وودز ، والدكتور لارس لارسن ، والدكتور تاج دالسجارد ، والدكتور لاين دوجارد ، والدكتورة كارين مايجارد ، وميت جاميلجارد. تم توفير التمويل لدراستنا من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 GM13140801 (DB ، RB) و UL1 TR002319 (K.N.L) ، وجائزة توسيع البحث من مكتب جامعة ولاية مونتانا للبحوث والتنمية الاقتصادية (DB). تم إنشاء الشكل 1A باستخدام BioRender.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3 M KClUnisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229092B
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, SterileCellTreat229412
24 Well Tissue Culture Plate, SterileCellTreat229124
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229093B
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
50 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, SterileCellTreat229422
70% EthanolBP82031GALBP82031GAL
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, SterileCellTreat229483 
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, SterileCellTreat229037
Amphotericin B (Fungizone) SolutionHyClone Laboratories, IncSV30078.01
Biosafety CabinetNuaire NU-425-600Class II Type A/B3
Bovine Serum AlbuminFisher BioreagentsBP1605-100
Cell recovery solutionCorning354253Cell dissociation solution
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)Gibco12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)Fisher Scientific15017CV
Fetal Bovine SerumHyClone Laboratories, IncSH30088
G418 SulfateCorning30-234-CR
Gentamycin sulfateIBI ScientificIB02030
HEPES, Free AcidCytivaSH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3HPM03840-001
Hydrochloric acidFisher ScientificA144C-212
IncubatorFisher Scientific11676604
iPhone 12 cameraApple
L-glutamineCytivaSH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-PlyFisher Scientific34133
M 205 FA StereomicroscopeLeica
Matrigel Membrane Matrix 354234CorningCB-40234
MC-1 UniMotor ControllerUnisense
Methyl red
MM33 MicromanipulatorMarzhauser Wetzlar61-42-113-0000Right handed
MS-15 Motorized StageUnisense
Nanoject-IIDrummond3-000-204nanoliter autoinjector
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15-140-148
pH MicroelectrodesUnisense50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160SensorTrace software is not compatible with Apple computers
Reference ElectrodeUnisenseREF-RM-001652SensorTrace software is not compatible with Apple computers
SB 431542Tocris Bioscience16-141-0
Smartphone Camera AdapterGosky
Specifications Laboratory Stand LSUnisenseLS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol redGibco25-200-056
UniAmpUnisense11632
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PKFisherMCS-200
Y-27632 dihydrochlorideTocris Bioscience12-541-0
µSensor Calibration KitUnisense/ Mettler Toledo51-305-070, 51-302-069pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets

References

  1. Zhang, N., et al. Tissue spatial omics dissects organoid biomimicry. GEN Biotechnology. 2 (5), 372-383 (2023).
  2. Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3d organoid systems. Trends Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).
  5. Achberger, K., et al. Merging organoid and organ-on-a-chip technology to generate complex multi-layer tissue models in a human retina-on-a-chip platform. Elife. 8, e46188 (2019).
  6. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  7. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nat Cell Biol. 18 (3), 246-254 (2016).
  8. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  9. Davies, J. A., Davies, J. A., Lawrence, M. L. . Organoids and Mini-organs. , 3-40 (2018).
  10. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS One. 15 (4), e0231423 (2020).
  11. Williams, S. E., Turnberg, L. A. Demonstration of a pH gradient across mucus adherent to rabbit gastric mucosa: Evidence for a 'mucus-bicarbonate' barrier. Gut. 22 (2), 94-96 (1981).
  12. Schubert, M. L. Gastric secretion. Curr Opin Gastroenterol. 20 (6), 519-525 (2004).
  13. Celli, J. P., et al. Rheology of gastric mucin exhibits a pH-dependent sol−gel transition. Biomacromolecules. 8 (5), 1580-1586 (2007).
  14. Takeshita, Y., et al. Assessment of pH-dependent errors in spectrophotometric pH measurements of seawater. Marine Chemistry. 223, 103801 (2020).
  15. Mccracken, K. W., et al. Wnt/β-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
  16. Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: Application to oxygen and ph sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
  17. Jewell, M. P., Galyean, A. A., Kirk Harris, J., Zemanick, E. T., Cash, K. J. Luminescent nanosensors for ratiometric monitoring of three-dimensional oxygen gradients in laboratory and clinical pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 85 (20), e01116-e01119 (2019).
  18. Brooks, E. L., Hussain, K. K., Kotecha, K., Abdalla, A., Patel, B. A. Three-dimensional-printed electrochemical multiwell plates for monitoring food intolerance from intestinal organoids. ACS Sens. 8 (2), 712-720 (2023).
  19. pH and reference electrode manual. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2023/05/2023.05-pH-and-ref-sensor-manual.pdf (2023)
  20. Villahermosa, D., Corzo, A., Garcia-Robledo, E., Gonzalez, J. M., Papaspyrou, S. Kinetics of indigenous nitrate reducing sulfide oxidizing activity in microaerophilic wastewater biofilms. PLoS One. 11 (2), 0149096 (2016).
  21. Pabst, B., Pitts, B., Lauchnor, E., Stewart, P. S. Gel-entrapped staphylococcus aureus bacteria as models of biofilm infection exhibit growth in dense aggregates, oxygen limitation, antibiotic tolerance, and heterogeneous gene expression. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 6294-6301 (2016).
  22. Ploug, H., Stolte, W., Epping, E. H. G., Jørgensen, B. B. Diffusive boundary layers, photosynthesis, and respiration of the colony-forming plankton algae, phaeocystis sp. Limnology and Oceanography. 44 (8), 1949-1958 (1999).
  23. Kolpen, M., et al. Nitrous oxide production in sputum from cystic fibrosis patients with chronic pseudomonas aeruginosa lung infection. PLoS One. 9 (1), 84353 (2014).
  24. Murphy, K. C., et al. Measurement of oxygen tension within mesenchymal stem cell spheroids. J R Soc Interface. 14 (127), 20160851 (2017).
  25. Sebrell, T. A., et al. A novel gastric spheroid co-culture model reveals chemokine-dependent recruitment of human dendritic cells to the gastric epithelium. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 157-171 (2019).
  26. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  27. Takase, Y., Fujishima, K., Takahashi, T. The 3d culturing of organoids from murine intestinal crypts and a single stem cell for organoid research. J Vis Exp. (194), e65219 (2023).
  28. Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, vitrogel((r)) organoid-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891 (2021).
  29. Sebrell, T. A., et al. Live imaging analysis of human gastric epithelial spheroids reveals spontaneous rupture, rotation and fusion events. Cell Tissue Res. 371 (2), 293-307 (2018).
  30. Sensortrace suite user manual. 3.3. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/10/SensorTrace-Suite-Manual.pdf (2023)
  31. Microprofiling system user manual. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/09/2023.11-MicroProfiling-System-2.pdf (2023)
  32. Wolffling, S., et al. Egf and bmps govern differentiation and patterning in human gastric glands. Gastroenterology. 161 (2), 623-636 (2021).
  33. Boccellato, F., et al. Polarised epithelial monolayers of the gastric mucosa reveal insights into mucosal homeostasis and defence against infection. Gut. 68 (3), 400-413 (2019).
  34. Mccracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
  35. Schumacher, M. A., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. J Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
  36. . Unisense Available from: https://unisense.com/products/ph-microelectrode/ (2024)
  37. Mccracken, K. W., et al. Wnt/beta-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
  38. Schreiber, S., et al. In situ measurement of ph in the secreting canaliculus of the gastric parietal cell and adjacent structures. Cell Tissue Res. 329 (2), 313-320 (2007).
  39. Xu, H., Li, J., Chen, H., Wang, C., Ghishan, F. K. Nhe8 plays important roles in gastric mucosal protection. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (3), G257-G261 (2013).
  40. Gawenis, L. R., et al. Impaired gastric acid secretion in mice with a targeted disruption of the nhe4 na+/h+ exchanger. J Biol Chem. 280 (13), 12781-12789 (2005).
  41. Lewis, O. L., Keener, J. P., Fogelson, A. L. A physics-based model for maintenance of the ph gradient in the gastric mucus layer. Am J Physiol-Gastrointest Liver Physiol. 313 (6), G599-G612 (2017).
  42. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) and extracellular flux analyses. Redox Biol. 30, 101420 (2020).
  43. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106 (2020).
  44. Guimera, X., et al. A minimally invasive microsensor specially designed for simultaneous dissolved oxygen and ph biofilm profiling. Sensors (Basel). 19 (21), 4747 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 209 Luminal PH Micromanipulator PH 3D Organoids

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved