JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем протоколе описаны измерения рН в органоидах желудка человека, полученных из тканей человека, с использованием микроэлектродов для пространственно-временной характеристики внутрипросветной физиологии.

Аннотация

Оптимизация и детальная характеристика моделей органоидов желудочно-кишечного тракта требуют передовых методов анализа их люминального окружения. В данной работе представлен высоковоспроизводимый метод точного измерения рН в просвете 3D-органоидов желудка человека с помощью микроэлектродов, управляемых микроманипуляторами. Микроэлектроды pH коммерчески доступны и состоят из скошенных стеклянных наконечников диаметром 25 мкм. Для измерений pH-микроэлектрод продвигается в просвет органоида (>200 мкм), взвешенного в Matrigel, в то время как электрод сравнения погружается в окружающую среду в культуральной пластине.

Используя такие микроэлектроды для профилирования органоидов, полученных из желудочного тела человека, мы демонстрируем, что рН люминала относительно постоянен в каждой культуральной лунке на уровне ~7,7 ± 0,037 и что непрерывные измерения могут быть получены в течение как минимум 15 минут. В некоторых крупных органоидах измерения выявили градиент pH между поверхностью эпителия и просветом, что позволяет предположить, что измерения pH в органоидах могут быть достигнуты с высоким пространственным разрешением. В предыдущем исследовании микроэлектроды были успешно использованы для измерения концентрации кислорода в органоидах в люминате, что продемонстрировало универсальность этого метода для анализа органоидов. Таким образом, этот протокол описывает важный инструмент для функциональной характеристики сложного просветного пространства внутри 3D-органоидов.

Введение

Органоиды — миниатюрные многоклеточные структуры, полученные из стволовых клеток, — произвели революцию в изучении физиологии человека и начинают заменять животные модели, дажев условиях регулирования. С момента первоначального описания кишечных органоидов Сато и др. в 2009 году, технология органоидов стала чрезвычайно популярной. Большое количество исследований очень подробно охарактеризовало клеточный состав и функции органоидных моделей 3,4,5,6. Тем не менее, световое пространство этих трехмерных многоклеточных структур остается в значительной степени неопределенным 7,8. Просвет представляет собой центральную полость органоидов, полученных из тканей слизистой оболочки, которая окружена апикальными частями поляризованных эпителиальных клеток. Поскольку клеточная секреция и абсорбция происходят преимущественно на апикальной поверхности эпителия, микроокружение просвета органоидов контролируется этими важными физиологическими процессами. Используемые в настоящее время органоидные модели демонстрируют вариации в клеточных сигнальных паттернах, общей стволовости, градиентах концентрации метаболитов и условиях окружающей среды9. Таким образом, понимание физиологии органоидного просвета необходимо для точного моделирования функции органов и патологии. К сожалению, относительная недоступность просвета значительно затрудняет функциональный анализ физиологии люминов в 3D-органоидах10.

Способность исследовать профили pH особенно важна для желудка, который печально известен тем, что имеет самый крутой протонный градиент в организме, варьирующийся от примерно 1-3 в просвете до почти нейтрального в эпителии 11,12,13. Остается значительный пробел в нашем понимании микромасштабного поддержания градиента pH желудка и актуальности органоидных моделей для повторения этой динамической среды в слое желудочной слизи. Традиционные подходы к анализу рН органоидов предполагают использование рН-чувствительных красителей, которые могут быть флуоресцентными или колориметрическими индикаторами. McCracken et al. использовали люминальную инъекцию SNARF-5F-ратиометрического индикатора pH в органоиды для анализа падения люминального pH в ответ на лечение гистамином. Такие красители могут быть включены в питательные среды, что позволяет проводить неинвазивный мониторинг pH в режиме реального времени. Мало того, что pH-чувствительные красители требуют сложных этапов калибровки, которые способствуют низкой надежности и точности измерений, но такие красители также имеют тенденцию работать в определенных диапазонах обнаружения, которые могут не отражать полный диапазон pH в пределах интересующей микросреды14,15. Тем не менее, можно считать целесообразным использовать индикаторные красители для подтверждающих экспериментов. Также были разработаны оптические наносенсоры, использующие флуоресцентные оптоды и pH-чувствительные подходы; Тем не менее, такие методы зондирования требуют микроскопической визуализации и также подвержены фотообесцвечиванию, фототоксичности, а также систематической ошибке изображения16,17. Кроме того, Брукс и др. имеют напечатанные на 3D-принтере многолуночные планшеты, содержащие микроэлектроды, поверх которых могут быть нанесены органоиды. Такой подход, однако, не позволяет проводить измерения непосредственно внутри органоидного просвета.

Измерения pH на основе электродов позволяют достичь более высокой точности по сравнению с другими методами, а также обеспечить мониторинг pH в режиме реального времени. Кроме того, pH-электроды, установленные на микроманипуляторах, обеспечивают превосходное пространственное разрешение измерений pH, поскольку точное расположение наконечника электрода можно точно контролировать. Это обеспечивает максимально возможную гибкость и воспроизводимость при анализе моделей органоидов. Используемые здесь электроды представляют собой миниатюрные pH-микроэлектроды, которые работают на основе диффузии протонов через селективное pH-стекло, окружающее тонкую платиновую проволоку. Микроэлектрод подключается к внешнему электроду сравнения Ag-AgCl, а затем подключается к высокоомному милливольтметру. Электрический потенциал между двумя кончиками электродов при погружении в один и тот же раствор будет отражать pH раствора19. Такие системы микропрофилирования были использованы при метаболическом анализе биопленок20,21, планктонных водорослей22, образцов мокроты человека23 и даже сфероидов мезенхимальных стволовых клеток24. Как наша лаборатория, так и Murphy et al. ранее использовали микроэлектродыO2, управляемые микроманипулятором, для оценки концентрации кислорода в просветных пространствах органоидов. Murphy et al. объединили этот метод с математическим моделированием, чтобы выявить градиент кислорода в своих сфероидах. Наша группа смогла обнаружить снижение уровня кислорода в люминальном спектре в тканевых органоидах желудка по сравнению с окружающим внеклеточным матриксом25.

Здесь мы подробно описываем метод ручного микроэлектродного профилирования рН просвета в сферических органоидах желудочно-кишечного тракта, который позволит лучше понять их сложное микроокружение просвета. Мы ожидаем, что этот метод добавит новое измерение в исследование физиологии органоидов с помощью измерений уровня pH в микромасштабе в режиме реального времени с высоким разрешением. Кроме того, следующий протокол может быть легко адаптирован для анализа O2, N2O, H2, NO, H2S, окислительно-восстановительного потенциала и температуры в различных типах органоидных моделей. Физиологическое профилирование служит ценным инструментом для оптимизации условий культивирования органоидов для лучшей имитации сред in vivo , тем самым повышая актуальность и полезность органоидных моделей в биомедицинских исследованиях.

протокол

Для этого протокола требуются 3D-органоиды диаметром не менее 200 мкм, которые имеют отчетливый просвет и встраиваются в искусственный внеклеточный матрикс (ВКМ, например, Матригель). Ткани желудка человека для получения органоидов были получены с одобрения Институционального наблюдательного совета Университета штата Монтана и информированного согласия пациентов, проходящих эндоскопию верхних отделов кишечника в Bozeman Health (протокол # 2023-48-FCR, к D.B.) или в качестве исключенных образцов для цельного желудка или рукавной гастрэктомии из Национального центра исследований заболеваний (протокол #DB062615-EX). Информация об органоидных линиях и номерах пассажей, использованных для данного исследования, представлена в таблице 1, а состав среды указан в таблице 2. Обратитесь к ранее опубликованным протоколам по получению и поддержанию линий органоидов желудочно-кишечного тракта 6,26,27.

1. Подготовка желудочных органоидов человека к профилированию pH

  1. Инициируйте и поддерживайте культуру органоидов желудка с использованием стандартных протоколов. Поддерживайте органоиды на 24-луночных планшетах в концентрации 500 мкл расширительной среды на лунку (табл. 2). Проход устанавливали органоидные линии каждые 5-7 дней, перенося в чашку со стеклянным дном диаметром 35 мм для подготовки к экспериментам по профилированию pH.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органоидные культуры для наших экспериментов получают из препаратов желудочных желез, которые получают из тканей взрослого человека, как описано выше. Мы используем метод расщепления тканей коллагеназой для выделения этих желез до того, как они будут суспензированы в ВКМ, как описано ранее 25,28,29.
  2. Из активно выращиваемых органоидных культур в проходах 1-15 выберите лунки, содержащие не менее 100 органоидов (примерно 2 млн клеток) диаметром от 200 до 700 мкм для переноса и расширения на чашках Петри 3,5 мм.
  3. При подготовке органоидов к осаждению (шаги 1.4-1.8) дайте аликвоте (аликвотам) внеклеточного матрикса (ВКМ) оттаять на льду в течение не менее 45 минут. Поддерживайте ECM на льду на протяжении всего этого протокола, чтобы предотвратить гелеобразование. Предварительно разогрейте планшеты для клеточных культур, поместив их в инкубатор с температурой 37 °C и 5%CO2 .
  4. Удалите среду из лунок и соберите органоидные культуры желудка, нанеся ледяной PBS на каждую каплю ECM и поцарапав гель кончиком пипетки P1000. Пипетируйте PBS с фрагментами ECM, содержащими органоиды, в коническую пробирку объемом 15 мл.
  5. Центрифугируйте пробирку при 200 × г при 4 °C в течение 5 мин. Фрагменты ЭКМ, содержащие органоиды, будут видны в виде слоя на дне пробирки. Осторожно отасуньте надосадочную жидкость и пипетку 350 мкл 0,25% трипсина-ЭДТА в каждую пробирку, осторожно перемешивая пипетированием вверх и вниз. Инкубируйте пробирки на водяной бане при температуре 37 °C в течение 2-5 минут.
  6. После инкубации с трипсином-ЭДТА добавьте 600 мкл ледяного DMEM с пенициллином/стрептомицином в каждую пробирку и энергично пипетируйте вверх и вниз не менее 40 раз. Центрифуга при 200 × г при 4 °C в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость. Чтобы подготовить культуры для измерения pH, суспендируйте клеточную гранулу в ледяном жидком ECM с соотношением 1:4 В/В органоидной гранулы к ECM для гальванического покрытия.
  7. Для каждого образца наберите 40 мкл жидкого ECM, содержащего органоиды/фрагменты органоидов в тонкой горизонтальной линии по диаметру чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение геля на планшет в линию, а не в виде круглой капли, облегчает доступ к отдельным органоидам за счет разжижения культуры.
  8. Дайте гелю полимеризоваться в течение 15-30 минут; затем осторожно добавьте 2 мл органоидной расширительной среды в планшет пипетированием по краю лунки, чтобы не нарушить гель.
  9. Заменяйте носители через день. Подождите 4-8 дней, чтобы минимум 10 органоидов выросли до минимального диаметра 400 мкм.
  10. Чтобы приступить к эксперименту по профилированию pH, убедитесь, что каждая культура содержит не менее 10 органоидов, которые соответствуют следующим критериям: диаметр >200 мкм, здоровый внешний вид (в органоидах практически не видно темного материала, наблюдаемого с помощью светлопольного микроскопа) и не перегруженность другими органоидами.

2. Распаковка и калибровка микроэлектродов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения микромасштабных измерений в дополнение к микроэлектроду датчика pH используется отдельный электрод сравнения, а не интегрированная (и, следовательно, более громоздкая) конструкция. Микроэлектрод pH и электрод сравнения должны храниться влажными. Не допускайте контакта с воздухом более 10 минут за один раз. Определите подходящий размер наконечника для конкретного приложения. Здесь мы использовали потенциометрический pH-микроэлектрод со скошенным диаметром наконечника 25 мкм.

  1. Пока микроэлектрод все еще находится в защитной трубке, визуально осмотрите наконечник на наличие повреждений.
  2. Подключите электрод сравнения к кабелю pH-электрода через разъем. Затем подключите микроэлектрод к усилителю, а усилитель — к заземленному ПК с программным обеспечением через USB-кабель (рис. 1A).
  3. Заполните две конические пробирки объемом 50 мл 2/3 70% этанолом и деионизированным H2O (diH2O). Поместите микроэлектрод и электрод сравнения в трубку diH2O, следя за тем, чтобы оба кончика оказались погруженными в жидкость на глубине не менее 1 см.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого и подобных этапов также можно использовать высокие стаканы.
  4. Дайте электродам уравновеситься в течение ~10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура также может быть приостановлена на этом этапе и возобновлена позже, так как электроды могут храниться в diH2O.
  5. Пока электроды находятся в равновесии, откройте программное обеспечение (красный значок) на рабочей станции компьютера. На вкладке «Настройки» убедитесь, что рядом с микроэлектродом установлен флажок, указывающий на то, что он правильно подключен и распознан программным обеспечением. Нажмите «Начать эксперимент » в левом верхнем углу окна и введите желаемое имя файла и место назначения. В окне Настройки калибровки датчика и эксперимента нажмите Очистить все точки , чтобы подготовить программное обеспечение к новой калибровке.
  6. Заполните две конические пробирки объемом 50 мл 2/3 калибровочными буферами с pH 4,01 и pH 9,21. Аккуратно промокните защитную трубку и электрод сравнения насухо деликатной лабораторной салфеткой.
  7. Начиная с электродов в буфере pH 4,01, введите 4,01 в качестве известного значения pH. Как только показания мВ стабилизируются, выберите точку добавления. Убедитесь, что сигнал стабилен на уровне ~380 мВ. После того, как точка будет добавлена, поместите оба электрода обратно в diH2O для промывки, затем снова промокните насухо.
  8. Повторите предыдущий шаг с буфером 9.21 и нажмите кнопку Добавить точку , когда сигнал стабилизируется (~83 мВ). Убедитесь, что микроэлектроды реагируют линейно в диапазоне pH от 4,01 до 9,21; Следовательно, необходима только двухточечная калибровочная кривая. Убедитесь, что результирующая линия между этими точками имеет отрицательный наклон 50-70 мВ/pH-единицу. Нажмите «Сохранить и использовать калибровку».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь вы готовы начать запись измерений30.

3. Профилирование рН органоидов желудка человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Для праворукого пользователя описан следующий протокол. ВНИМАНИЕ: Отключите все параметры энергосбережения на вашем ПК, так как текущие измерения будут прерваны, если ПК перейдет в спящий режим.

  1. Соберите кольцевую подставку с зажимом на левой стороне стереомикроскопа для удержания электрода сравнения. Расположите микроманипулятор, прикрепленный к тяжелой лабораторной стойке с правой стороны микроскопа (рисунок 1A).
  2. Осторожно извлеките микроэлектрод из защитного корпуса, положив его на скамью и быстро и быстро сняв корпус.
    ВНИМАНИЕ: Микроэлектроды невероятно хрупкие, и следует следить за тем, чтобы наконечник не соприкасался с жестким, твердым материалом. Для достижения наилучших результатов выполняйте измерения на прочном столе без оборудования, которое может вызвать вибрацию стола или нежелательное перемещение электродов.
  3. Установите микроэлектрод на микроманипулятор и расположите стереоскоп и микроманипулятор таким образом, чтобы микроэлектрод мог продвигаться к чашке с культурой, не задевая объектив или другие части микроскопа.
  4. Расположите чашку для культивирования, содержащую органоиды, чтобы обеспечить адекватную визуализацию первого органоида, который должен быть профилирован (рисунок 1B).
  5. Слегка закрепите электрод сравнения на зажиме на кольцевой подставке слева от стереоскопа. Расположите электрод сравнения так, чтобы он находился в среде, окружающей ЭБУ. Следите за тем, чтобы он не нарушил работу органоидов при перемещении предметного столика между измерениями.
  6. Глядя непосредственно на культуральную пластину (не в микроскоп), продвигайте кончик микроэлектрода вперед до тех пор, пока он не будет достаточно погружен в среду. На вкладке «Регистратор данных» в программном обеспечении нажмите кнопку «Пуск» (один треугольник, указывающий вправо), чтобы начать запись. Убедитесь, что в правой части экрана установлен флажок Откалибровано.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите ~10 секунд для стабилизации каждого показания перед переходом к следующей области.
  7. Перед вводом в ЭКМ убедитесь, что наконечник электрода виден под микроскопом и что он расположен таким образом, чтобы продвигаться линейно к первому интересующему органоиду. Медленно продвигайте электрод в гель, не контактируя ни с какими органоидами. Запишите не менее трех показаний pH и рассчитайте среднее значение.
  8. Расположите микроэлектрод таким образом, чтобы он был готов к продвижению к первому интересующему органоиду вдоль оси, перпендикулярной поверхности. Позвольте электроду сделать небольшое углубление на поверхности эпителия, не проникая (рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг также даст представление о том, останется ли органоид на месте или он может более свободно перемещаться в ЭХМ.
  9. Одним быстрым движением продвигайте микроэлектрод в органоид. Если органоид движется вокруг микроэлектрода или удаляется, попробуйте немного изменить угол или приложите его к другому органоиду или пластиковому ободку, окружающему дно покровного стекла чашки. Измерьте рН света (три раза) 10 различных органоидов для каждого экспериментального условия. Когда закончите запись измерений, нажмите квадратную кнопку «Стоп».
    ВНИМАНИЕ: Оцените диаметр органоида, чтобы решить, насколько далеко продвигать электрод в просвет органоида, стараясь не прокалывать его насквозь. Для повышения точности измерьте диаметр с помощью программного обеспечения камеры микроскопа, если оно доступно. ПРИМЕЧАНИЕ: Если после одного или нескольких измерений кончик микроэлектрода заметно покрывается мусором, промойте микроэлектрод в растворе для диссоциации клеток, PBS, EtOH, а затем diH2O, прежде чем продолжить.

4. Моторизованное профилирование (опционально)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой опции требуется микроманипулятор, установленный на механическом двигателе, который в конечном итоге управляется компьютерным программным обеспечением через контроллер двигателя31.

  1. Откройте программу «Профилирование» (значок коричневого цвета) и начните новый эксперимент на вкладке « Профилирование ».
  2. Настройки оси Z автоматически распознают мотор при правильном подключении моторного аппарата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При этой настройке движение в направлениях x и y по-прежнему контролируется вручную.
  3. Перейдите на вкладку Взаимодействие с профилем30. Прежде чем нажать кнопку «Пуск», убедитесь, что есть возможность быстро перейти к взгляду на окуляр микроскопа, чтобы обеспечить вход органоида на нужное расстояние. Перейдите в Настройки профиля и выполните следующие действия:
    1. Укажите, что начальное расстояние равно 0 μм.
      ВНИМАНИЕ: Если эпителиальная оболочка особенно жесткая на данном органоиде, органоид может быть оттолкнут или деформирован, а не проникнут. Если это так, продолжайте продвигаться по электроду, но обратите внимание на точку, в которой происходит ввод, так как программное обеспечение не может записать это автоматически.
    2. Оценивая размер профилируемого органоида, укажите конечное расстояние , которое не более чем на 3/4 от расчетного диаметра органоида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот конкретный шаг предназначен для предотвращения повреждения наконечника электрода.
    3. Укажите желаемый размер шага — 100 мкм, как показано на рисунке 2Е. Убедитесь, что минимальный размер шага соответствует размеру наконечника электрода (например, 25 мкм для наконечника электрода pH-25 мкм 25 мкм).
    4. Укажите безопасное положение, в которое мотор будет возвращать наконечник электрода между профилями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это должна быть комфортная высота над образцом (за пределами органоида), где датчик можно безопасно перемещать в сторону в направлениях x и y с помощью ручного микроманипулятора. Оставьте угол датчика на значении по умолчанию.
    5. Чтобы обеспечить равновесие электрода, укажите не менее 3 с в поле Ожидание перед измерением.
    6. Установите для параметра Период (периоды) измерения значение не менее 1 с. Измерения за этот период будут усреднены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении измерений в среде с высоким уровнем электрического шума может быть полезно указать более длительный период.
    7. Установите Задержку между(ями) не менее 1 с.
    8. Задайте предпочтительное количество повторов для измерения на каждой глубине.
    9. Начните запись измерений, нажав кнопку « Старт ».

5. Чистка электродов

  1. Поместите очищаемый электрод обратно в защитную трубку.
  2. Промойте электроды с помощью diH2O после измерений.
  3. Промойте электроды 70% этанолом в течение пары минут.
  4. Промойте электроды буфером pH 4,01.
  5. Прежде чем приступить к измерениям, еще раз промойте электроды с помощью diH2O.

6. Хранение электродов

ПРИМЕЧАНИЕ: Оба электрода должны храниться при комнатной температуре в месте с низкой активностью, защищенном от случайных повреждений.

  1. После использования pH-микроэлектрода осторожно переместите его горизонтально обратно в защитную трубку (скользя вдоль лабораторного стола для горизонтальной поддержки).
  2. Держа микроэлектрод вертикально (кончик направлен вверх), аккуратно наполните защитную трубку стерильной водой. Заглушите защитную трубку с помощью пробки, в комплекте с которой идет электрод. Убедитесь, что все отверстия в защитной трубке заклеены изолентой. Хранить в небьющейся коробке до следующего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать оригинальную коробку, в которой поставлялись электроды, так как она будет содержать защитные вставки, предназначенные для удержания электродов на месте при хранении.
  3. Храните электрод сравнения в стакане или градуированном цилиндре, заполненном раствором 3М KCl. Накройте стакан/градуированный цилиндр парапленкой, чтобы предотвратить испарение раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании градуированного цилиндра рекомендуется закрепить его на лабораторном столе с помощью ленты, чтобы предотвратить случайное перемещение.

7. Инъекция метилового красного (по желанию)

ПРИМЕЧАНИЕ: Метиловый красный является колориметрическим индикаторным красителем, который можно использовать для валидации измерений микроэлектродов.

  1. Стеклянный капилляр объемом 2 мкл наполнить стерильным минеральным маслом, загрузить его на автоинъектор nL, управляемый микроманипулятором, а затем заполнить раствором, содержащим 0,02% метилового красного и 150 мМ HCl.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор должен казаться красным/розовым при нахождении в капилляре из-за кислотности HCl.
  2. Введите органоиды диаметром не менее 300 мкм с 9,2 мкл раствора25.
  3. Захват изображений или видео с помощью камеры, адаптированной к стереомикроскопу (рис. 2G).

Результаты

Секреция кислоты является важнейшей функцией желудка человека. Однако вопрос о том, в какой степени секреция кислоты может быть смоделирована в органоидах, до сих пор остается предметом споров 6,32,33,34. Поэтому мы разр...

Обсуждение

Ограниченный доступ к просветному пространству органоидов сильно ограничил наше понимание физиологической динамики этого микроокружения. Надежный инструмент для функционального анализа люминальной физиологии расширит наши возможности по использованию органоидов в качестве модел...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы выражают признательность доктору Эллен Лохнор, доктору Филу Стюарту и Бенгису Киличу за их предыдущую работу и помощь с микросенсорами O2 ; Энди Себрелл за обучение культивированию органоидов и микроманипуляциям; Лекси Бурчам за помощь в выращивании органоидов, подготовке носителей, записи и организации данных; и доктору Сьюзи Кохаут за общие советы по электрофизиологии. Мы хотели бы поблагодарить доктора Хайди Смит за ее помощь в проведении визуализации и выразить признательность Центру биопленочной инженерии биовизуализации в Университете штата Монтана, который финансируется Программой МРТ Национального научного фонда (2018562), Благотворительным фондом М.Дж. Мердока (202016116), Министерством обороны США (77369LSRIP & W911NF1910288) и Нанотехнологическим центром Монтаны (членом NNCI при поддержке гранта NSF ECCS-2025391).

Особая благодарность всей команде Unisense, которая сделала эту работу возможной, особенно доктору Эндрю Церскусу, доктору Лауре Вудс, доктору Ларсу Ларсену, доктору Таге Далсгаард, доктору Лин Даугард, доктору Карен Маэгор и Метте Гаммельгаард. Финансирование нашего исследования было предоставлено грантами Национальных институтов здравоохранения R01 GM13140801 (D.B., R.B.) и UL1 TR002319 (K.N.L.), а также премией за расширение исследований от Управления исследований и экономического развития Университета штата Монтана (D.B.). Рисунок 1A был создан с помощью BioRender.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3 M KClUnisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229092B
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, SterileCellTreat229412
24 Well Tissue Culture Plate, SterileCellTreat229124
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229093B
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
50 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, SterileCellTreat229422
70% EthanolBP82031GALBP82031GAL
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, SterileCellTreat229483 
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, SterileCellTreat229037
Amphotericin B (Fungizone) SolutionHyClone Laboratories, IncSV30078.01
Biosafety CabinetNuaire NU-425-600Class II Type A/B3
Bovine Serum AlbuminFisher BioreagentsBP1605-100
Cell recovery solutionCorning354253Cell dissociation solution
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)Gibco12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)Fisher Scientific15017CV
Fetal Bovine SerumHyClone Laboratories, IncSH30088
G418 SulfateCorning30-234-CR
Gentamycin sulfateIBI ScientificIB02030
HEPES, Free AcidCytivaSH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3HPM03840-001
Hydrochloric acidFisher ScientificA144C-212
IncubatorFisher Scientific11676604
iPhone 12 cameraApple
L-glutamineCytivaSH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-PlyFisher Scientific34133
M 205 FA StereomicroscopeLeica
Matrigel Membrane Matrix 354234CorningCB-40234
MC-1 UniMotor ControllerUnisense
Methyl red
MM33 MicromanipulatorMarzhauser Wetzlar61-42-113-0000Right handed
MS-15 Motorized StageUnisense
Nanoject-IIDrummond3-000-204nanoliter autoinjector
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15-140-148
pH MicroelectrodesUnisense50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160SensorTrace software is not compatible with Apple computers
Reference ElectrodeUnisenseREF-RM-001652SensorTrace software is not compatible with Apple computers
SB 431542Tocris Bioscience16-141-0
Smartphone Camera AdapterGosky
Specifications Laboratory Stand LSUnisenseLS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol redGibco25-200-056
UniAmpUnisense11632
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PKFisherMCS-200
Y-27632 dihydrochlorideTocris Bioscience12-541-0
µSensor Calibration KitUnisense/ Mettler Toledo51-305-070, 51-302-069pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets

Ссылки

  1. Zhang, N., et al. Tissue spatial omics dissects organoid biomimicry. GEN Biotechnology. 2 (5), 372-383 (2023).
  2. Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3d organoid systems. Trends Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).
  5. Achberger, K., et al. Merging organoid and organ-on-a-chip technology to generate complex multi-layer tissue models in a human retina-on-a-chip platform. Elife. 8, e46188 (2019).
  6. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  7. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nat Cell Biol. 18 (3), 246-254 (2016).
  8. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  9. Davies, J. A., Davies, J. A., Lawrence, M. L. . Organoids and Mini-organs. , 3-40 (2018).
  10. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS One. 15 (4), e0231423 (2020).
  11. Williams, S. E., Turnberg, L. A. Demonstration of a pH gradient across mucus adherent to rabbit gastric mucosa: Evidence for a 'mucus-bicarbonate' barrier. Gut. 22 (2), 94-96 (1981).
  12. Schubert, M. L. Gastric secretion. Curr Opin Gastroenterol. 20 (6), 519-525 (2004).
  13. Celli, J. P., et al. Rheology of gastric mucin exhibits a pH-dependent sol−gel transition. Biomacromolecules. 8 (5), 1580-1586 (2007).
  14. Takeshita, Y., et al. Assessment of pH-dependent errors in spectrophotometric pH measurements of seawater. Marine Chemistry. 223, 103801 (2020).
  15. Mccracken, K. W., et al. Wnt/β-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
  16. Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: Application to oxygen and ph sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
  17. Jewell, M. P., Galyean, A. A., Kirk Harris, J., Zemanick, E. T., Cash, K. J. Luminescent nanosensors for ratiometric monitoring of three-dimensional oxygen gradients in laboratory and clinical pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 85 (20), e01116-e01119 (2019).
  18. Brooks, E. L., Hussain, K. K., Kotecha, K., Abdalla, A., Patel, B. A. Three-dimensional-printed electrochemical multiwell plates for monitoring food intolerance from intestinal organoids. ACS Sens. 8 (2), 712-720 (2023).
  19. pH and reference electrode manual. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2023/05/2023.05-pH-and-ref-sensor-manual.pdf (2023)
  20. Villahermosa, D., Corzo, A., Garcia-Robledo, E., Gonzalez, J. M., Papaspyrou, S. Kinetics of indigenous nitrate reducing sulfide oxidizing activity in microaerophilic wastewater biofilms. PLoS One. 11 (2), 0149096 (2016).
  21. Pabst, B., Pitts, B., Lauchnor, E., Stewart, P. S. Gel-entrapped staphylococcus aureus bacteria as models of biofilm infection exhibit growth in dense aggregates, oxygen limitation, antibiotic tolerance, and heterogeneous gene expression. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 6294-6301 (2016).
  22. Ploug, H., Stolte, W., Epping, E. H. G., Jørgensen, B. B. Diffusive boundary layers, photosynthesis, and respiration of the colony-forming plankton algae, phaeocystis sp. Limnology and Oceanography. 44 (8), 1949-1958 (1999).
  23. Kolpen, M., et al. Nitrous oxide production in sputum from cystic fibrosis patients with chronic pseudomonas aeruginosa lung infection. PLoS One. 9 (1), 84353 (2014).
  24. Murphy, K. C., et al. Measurement of oxygen tension within mesenchymal stem cell spheroids. J R Soc Interface. 14 (127), 20160851 (2017).
  25. Sebrell, T. A., et al. A novel gastric spheroid co-culture model reveals chemokine-dependent recruitment of human dendritic cells to the gastric epithelium. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 157-171 (2019).
  26. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  27. Takase, Y., Fujishima, K., Takahashi, T. The 3d culturing of organoids from murine intestinal crypts and a single stem cell for organoid research. J Vis Exp. (194), e65219 (2023).
  28. Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, vitrogel((r)) organoid-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891 (2021).
  29. Sebrell, T. A., et al. Live imaging analysis of human gastric epithelial spheroids reveals spontaneous rupture, rotation and fusion events. Cell Tissue Res. 371 (2), 293-307 (2018).
  30. Sensortrace suite user manual. 3.3. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/10/SensorTrace-Suite-Manual.pdf (2023)
  31. Microprofiling system user manual. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/09/2023.11-MicroProfiling-System-2.pdf (2023)
  32. Wolffling, S., et al. Egf and bmps govern differentiation and patterning in human gastric glands. Gastroenterology. 161 (2), 623-636 (2021).
  33. Boccellato, F., et al. Polarised epithelial monolayers of the gastric mucosa reveal insights into mucosal homeostasis and defence against infection. Gut. 68 (3), 400-413 (2019).
  34. Mccracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
  35. Schumacher, M. A., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. J Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
  36. . Unisense Available from: https://unisense.com/products/ph-microelectrode/ (2024)
  37. Mccracken, K. W., et al. Wnt/beta-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
  38. Schreiber, S., et al. In situ measurement of ph in the secreting canaliculus of the gastric parietal cell and adjacent structures. Cell Tissue Res. 329 (2), 313-320 (2007).
  39. Xu, H., Li, J., Chen, H., Wang, C., Ghishan, F. K. Nhe8 plays important roles in gastric mucosal protection. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (3), G257-G261 (2013).
  40. Gawenis, L. R., et al. Impaired gastric acid secretion in mice with a targeted disruption of the nhe4 na+/h+ exchanger. J Biol Chem. 280 (13), 12781-12789 (2005).
  41. Lewis, O. L., Keener, J. P., Fogelson, A. L. A physics-based model for maintenance of the ph gradient in the gastric mucus layer. Am J Physiol-Gastrointest Liver Physiol. 313 (6), G599-G612 (2017).
  42. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) and extracellular flux analyses. Redox Biol. 30, 101420 (2020).
  43. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106 (2020).
  44. Guimera, X., et al. A minimally invasive microsensor specially designed for simultaneous dissolved oxygen and ph biofilm profiling. Sensors (Basel). 19 (21), 4747 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE209PHPH3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены