Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем протоколе описаны измерения рН в органоидах желудка человека, полученных из тканей человека, с использованием микроэлектродов для пространственно-временной характеристики внутрипросветной физиологии.

Аннотация

Оптимизация и детальная характеристика моделей органоидов желудочно-кишечного тракта требуют передовых методов анализа их люминального окружения. В данной работе представлен высоковоспроизводимый метод точного измерения рН в просвете 3D-органоидов желудка человека с помощью микроэлектродов, управляемых микроманипуляторами. Микроэлектроды pH коммерчески доступны и состоят из скошенных стеклянных наконечников диаметром 25 мкм. Для измерений pH-микроэлектрод продвигается в просвет органоида (>200 мкм), взвешенного в Matrigel, в то время как электрод сравнения погружается в окружающую среду в культуральной пластине.

Используя такие микроэлектроды для профилирования органоидов, полученных из желудочного тела человека, мы демонстрируем, что рН люминала относительно постоянен в каждой культуральной лунке на уровне ~7,7 ± 0,037 и что непрерывные измерения могут быть получены в течение как минимум 15 минут. В некоторых крупных органоидах измерения выявили градиент pH между поверхностью эпителия и просветом, что позволяет предположить, что измерения pH в органоидах могут быть достигнуты с высоким пространственным разрешением. В предыдущем исследовании микроэлектроды были успешно использованы для измерения концентрации кислорода в органоидах в люминате, что продемонстрировало универсальность этого метода для анализа органоидов. Таким образом, этот протокол описывает важный инструмент для функциональной характеристики сложного просветного пространства внутри 3D-органоидов.

Введение

Органоиды — миниатюрные многоклеточные структуры, полученные из стволовых клеток, — произвели революцию в изучении физиологии человека и начинают заменять животные модели, дажев условиях регулирования. С момента первоначального описания кишечных органоидов Сато и др. в 2009 году, технология органоидов стала чрезвычайно популярной. Большое количество исследований очень подробно охарактеризовало клеточный состав и функции органоидных моделей 3,4,5,6. Тем не менее, световое пространство этих трехм....

протокол

Для этого протокола требуются 3D-органоиды диаметром не менее 200 мкм, которые имеют отчетливый просвет и встраиваются в искусственный внеклеточный матрикс (ВКМ, например, Матригель). Ткани желудка человека для получения органоидов были получены с одобрения Институционального наблюдательного совета Университета штата Монтана и информированного согласия пациентов, проходящих эндоскопию верхних отделов кишечника в Bozeman Health (протокол # 2023-48-FCR, к D.B.) или в качестве исключенных образцов для цельного желудка или рукавной гастрэктомии из Национального центра исследований заболеваний (протокол #DB062615-EX). Информация об органоидных линиях и номерах пассажей, ис....

Результаты

Секреция кислоты является важнейшей функцией желудка человека. Однако вопрос о том, в какой степени секреция кислоты может быть смоделирована в органоидах, до сих пор остается предметом споров 6,32,33,34. Поэтому мы разр.......

Обсуждение

Ограниченный доступ к просветному пространству органоидов сильно ограничил наше понимание физиологической динамики этого микроокружения. Надежный инструмент для функционального анализа люминальной физиологии расширит наши возможности по использованию органоидов в качестве модел.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы выражают признательность доктору Эллен Лохнор, доктору Филу Стюарту и Бенгису Киличу за их предыдущую работу и помощь с микросенсорами O2 ; Энди Себрелл за обучение культивированию органоидов и микроманипуляциям; Лекси Бурчам за помощь в выращивании органоидов, подготовке носителей, записи и организации данных; и доктору Сьюзи Кохаут за общие советы по электрофизиологии. Мы хотели бы поблагодарить доктора Хайди Смит за ее помощь в проведении визуализации и выразить признательность Центру биопленочной инженерии биовизуализации в Университете штата Монтана, который финансируется Программой МРТ Национального научного фонда (2018562), Благотворительным ф....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3 M KClUnisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229092B
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, SterileCellTreat229412
24 Well Tissue Culture Plate, SterileCellTreat229124
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229093B
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
50 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, SterileCellTreat229422
70% EthanolBP82031GALBP82031GAL
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, SterileCellTreat229483 
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, SterileCellTreat229037
Amphotericin B (Fungizone) SolutionHyClone Laboratories, IncSV30078.01
Biosafety CabinetNuaire NU-425-600Class II Type A/B3
Bovine Serum AlbuminFisher BioreagentsBP1605-100
Cell recovery solutionCorning354253Cell dissociation solution
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)Gibco12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)Fisher Scientific15017CV
Fetal Bovine SerumHyClone Laboratories, IncSH30088
G418 SulfateCorning30-234-CR
Gentamycin sulfateIBI ScientificIB02030
HEPES, Free AcidCytivaSH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3HPM03840-001
Hydrochloric acidFisher ScientificA144C-212
IncubatorFisher Scientific11676604
iPhone 12 cameraApple
L-glutamineCytivaSH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-PlyFisher Scientific34133
M 205 FA StereomicroscopeLeica
Matrigel Membrane Matrix 354234CorningCB-40234
MC-1 UniMotor ControllerUnisense
Methyl red
MM33 MicromanipulatorMarzhauser Wetzlar61-42-113-0000Right handed
MS-15 Motorized StageUnisense
Nanoject-IIDrummond3-000-204nanoliter autoinjector
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15-140-148
pH MicroelectrodesUnisense50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160SensorTrace software is not compatible with Apple computers
Reference ElectrodeUnisenseREF-RM-001652SensorTrace software is not compatible with Apple computers
SB 431542Tocris Bioscience16-141-0
Smartphone Camera AdapterGosky
Specifications Laboratory Stand LSUnisenseLS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol redGibco25-200-056
UniAmpUnisense11632
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PKFisherMCS-200
Y-27632 dihydrochlorideTocris Bioscience12-541-0
µSensor Calibration KitUnisense/ Mettler Toledo51-305-070, 51-302-069pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE209PHPH3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены