Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Профилирование рН люминала в трехмерных органоидах желудочно-кишечного тракта с помощью микроэлектродов
В этой статье
Резюме
В настоящем протоколе описаны измерения рН в органоидах желудка человека, полученных из тканей человека, с использованием микроэлектродов для пространственно-временной характеристики внутрипросветной физиологии.
Аннотация
Оптимизация и детальная характеристика моделей органоидов желудочно-кишечного тракта требуют передовых методов анализа их люминального окружения. В данной работе представлен высоковоспроизводимый метод точного измерения рН в просвете 3D-органоидов желудка человека с помощью микроэлектродов, управляемых микроманипуляторами. Микроэлектроды pH коммерчески доступны и состоят из скошенных стеклянных наконечников диаметром 25 мкм. Для измерений pH-микроэлектрод продвигается в просвет органоида (>200 мкм), взвешенного в Matrigel, в то время как электрод сравнения погружается в окружающую среду в культуральной пластине.
Используя такие микроэлектроды для профилирования органоидов, полученных из желудочного тела человека, мы демонстрируем, что рН люминала относительно постоянен в каждой культуральной лунке на уровне ~7,7 ± 0,037 и что непрерывные измерения могут быть получены в течение как минимум 15 минут. В некоторых крупных органоидах измерения выявили градиент pH между поверхностью эпителия и просветом, что позволяет предположить, что измерения pH в органоидах могут быть достигнуты с высоким пространственным разрешением. В предыдущем исследовании микроэлектроды были успешно использованы для измерения концентрации кислорода в органоидах в люминате, что продемонстрировало универсальность этого метода для анализа органоидов. Таким образом, этот протокол описывает важный инструмент для функциональной характеристики сложного просветного пространства внутри 3D-органоидов.
Введение
Органоиды — миниатюрные многоклеточные структуры, полученные из стволовых клеток, — произвели революцию в изучении физиологии человека и начинают заменять животные модели, дажев условиях регулирования. С момента первоначального описания кишечных органоидов Сато и др. в 2009 году, технология органоидов стала чрезвычайно популярной. Большое количество исследований очень подробно охарактеризовало клеточный состав и функции органоидных моделей 3,4,5,6. Тем не менее, световое пространство этих трехм....
протокол
Для этого протокола требуются 3D-органоиды диаметром не менее 200 мкм, которые имеют отчетливый просвет и встраиваются в искусственный внеклеточный матрикс (ВКМ, например, Матригель). Ткани желудка человека для получения органоидов были получены с одобрения Институционального наблюдательного совета Университета штата Монтана и информированного согласия пациентов, проходящих эндоскопию верхних отделов кишечника в Bozeman Health (протокол # 2023-48-FCR, к D.B.) или в качестве исключенных образцов для цельного желудка или рукавной гастрэктомии из Национального центра исследований заболеваний (протокол #DB062615-EX). Информация об органоидных линиях и номерах пассажей, ис....
Результаты
Секреция кислоты является важнейшей функцией желудка человека. Однако вопрос о том, в какой степени секреция кислоты может быть смоделирована в органоидах, до сих пор остается предметом споров 6,32,33,34. Поэтому мы разр.......
Обсуждение
Ограниченный доступ к просветному пространству органоидов сильно ограничил наше понимание физиологической динамики этого микроокружения. Надежный инструмент для функционального анализа люминальной физиологии расширит наши возможности по использованию органоидов в качестве модел.......
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Авторы выражают признательность доктору Эллен Лохнор, доктору Филу Стюарту и Бенгису Киличу за их предыдущую работу и помощь с микросенсорами O2 ; Энди Себрелл за обучение культивированию органоидов и микроманипуляциям; Лекси Бурчам за помощь в выращивании органоидов, подготовке носителей, записи и организации данных; и доктору Сьюзи Кохаут за общие советы по электрофизиологии. Мы хотели бы поблагодарить доктора Хайди Смит за ее помощь в проведении визуализации и выразить признательность Центру биопленочной инженерии биовизуализации в Университете штата Монтана, который финансируется Программой МРТ Национального научного фонда (2018562), Благотворительным ф....
Материалы
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 M KCl | Unisense | ||
| 5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229091B | |
| 10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229092B | |
| 15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile | CellTreat | 229412 | |
| 24 Well Tissue Culture Plate, Sterile | CellTreat | 229124 | |
| 25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229093B | |
| 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile | CellTreat | 229422 | |
| 70% Ethanol | BP82031GAL | BP82031GAL | |
| 70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, Sterile | CellTreat | 229483 | |
| 1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, Sterile | CellTreat | 229037 | |
| Amphotericin B (Fungizone) Solution | HyClone Laboratories, Inc | SV30078.01 | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | Class II Type A/B3 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605-100 | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | Cell dissociation solution |
| DMEM/F-12 (Advanced DMEM) | Gibco | 12-491-015 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Fisher Scientific | 15017CV | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone Laboratories, Inc | SH30088 | |
| G418 Sulfate | Corning | 30-234-CR | |
| Gentamycin sulfate | IBI Scientific | IB02030 | |
| HEPES, Free Acid | Cytiva | SH30237.01 | |
| HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3 | HP | M03840-001 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144C-212 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11676604 | |
| iPhone 12 camera | Apple | ||
| L-glutamine | Cytiva | SH3003401 | |
| Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 34133 | |
| M 205 FA Stereomicroscope | Leica | ||
| Matrigel Membrane Matrix 354234 | Corning | CB-40234 | |
| MC-1 UniMotor Controller | Unisense | ||
| Methyl red | |||
| MM33 Micromanipulator | Marzhauser Wetzlar | 61-42-113-0000 | Right handed |
| MS-15 Motorized Stage | Unisense | ||
| Nanoject-II | Drummond | 3-000-204 | nanoliter autoinjector |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-148 | |
| pH Microelectrodes | Unisense | 50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160 | SensorTrace software is not compatible with Apple computers |
| Reference Electrode | Unisense | REF-RM-001652 | SensorTrace software is not compatible with Apple computers |
| SB 431542 | Tocris Bioscience | 16-141-0 | |
| Smartphone Camera Adapter | Gosky | ||
| Specifications Laboratory Stand LS | Unisense | LS-009238 | |
| Trypsin-EDTA 0.025%, phenol red | Gibco | 25-200-056 | |
| UniAmp | Unisense | 11632 | |
| United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PK | Fisher | MCS-200 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 12-541-0 | |
| µSensor Calibration Kit | Unisense/ Mettler Toledo | 51-305-070, 51-302-069 | pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets |
Ссылки
- Zhang, N., et al. Tissue spatial omics dissects organoid biomimicry. GEN Biotechnology. 2 (5), 372-383 (2023).
- Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal n....
Перепечатки и разрешения
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены